一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒及制备方法和检测方法与流程

1.本公开涉及免疫分析检测技术领域，尤其涉及一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒及制备方法和检测方法。


背景技术：

2.糖尿病(diabetes mellitus)是以高血糖为特征、以糖代谢紊乱为主要表现的慢性复杂的代谢性疾病。2007年全球20～79岁人群中糖尿病患者约2.46亿，占全球人口5.9％。中国是糖尿病的重灾区，不但糖尿病人数占全球的近1/6，而且增长速度迅猛。糖尿病给社会、家庭带来了沉重的经济负担，对患者个人来说是一种身心摧残。由于糖尿病的病因和发病机制尚未完全阐明，给防治带来了不少的难度。
3.1型糖尿病(type 1diabetes mellitus，t1dm)具有胰岛β细胞产生胰岛素功能受损的特征，是一种免疫介导的疾病。t1dm的临床表现可以表现为急性疾病，如酮症酸中毒，也可表现为慢性疾病。在患者血清中可以检测到针对胰岛β细胞的多种自身抗体。以谷氨酸脱羧酶自身抗体(gada)，胰岛素自身抗体(iaa)，蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(ia-2a)及胰岛洗吧抗体(ica)最为重要。
4.酪氨酸磷酸酶(ia-2)是1型糖尿病的一个主要靶抗原，且特异度高。检测ia-2自身抗体对于1型糖尿病的诊断、鉴别诊断、治疗监控和预测具有重要的临床意义。目前国际上建立的方法有免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫吸附试验(elisa)、时间分辩荧光免疫分析法和放射配体检测法。多次国际标准化评估显示，放射配体检测法具有高灵敏度和特异度，是检测ia-2自身抗体最有效的方法。而elisa等方法因在包被过程中遮蔽了抗原表位或抗体不能充分与其反应，致使灵敏度降低。然而，放射配体检测ia-2自身抗体影响因素众多，只有在严格的质量控制情况下才能得到理想的结果。
5.目前酪氨酸磷酸酶抗体检测技术存在以下缺点：检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、测值的影响因素多、有放射性污染、操作复杂等。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本公开的目的在于提出一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒及制备方法和检测方法，用以解决或部分解决上述技术问题。
7.基于上述目的，本公开第一方面提供了一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒，包括：磁性颗粒-抗生物素抗体溶液、生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液和酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液。
8.进一步地，所述生物素包括但不限于n-琥珀酰亚氨-6-生物素-氨己酸、d-生物素-n-羟基琥珀酰亚、磺酸基-生物素-n-琥珀酰亚胺基酯、酰氨基己酰-6-氨基己酸-生物素-n-羟基琥珀酰亚胺酯。
9.进一步地，所述生物素直接或间接偶联有n-羟基磺基琥珀酰亚胺(nhs)基团，在碱
性缓冲液中与伯胺基团(-nh2)高效反应，形成稳定的酰胺键，包括但不限于n-琥珀酰亚氨-6-生物素氨己酸(简称“nhs-lc-biotin”或“nhs-lc-生物素”)、d-生物素-n-羟基琥珀酰亚(简称“nhs-biotin”或“nhs-生物素”)、磺酸基-生物素-n-琥珀酰亚胺基酯(简称“sulfo-nhs-biotin”或“sulfo-nhs-生物素”)、酰氨基己酰-6-氨基己酸-生物素-n-羟基琥珀酰亚胺酯(简称“lc-lc-nhs-biotin”或“nhs-lc-lc-生物素”)。
10.进一步地，所述酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液为碱性磷酸酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液和/或辣根过氧化物酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液。
11.进一步地，所述生物素标记酪氨酸磷酸酶抗原溶液、酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的工作浓度均为0.01-0.5μg/ml，所述磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的工作浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml。
12.进一步地，所述生物素标记酪氨酸磷酸酶抗原、酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的工作浓度均为0.05-0.5μg/ml。
13.进一步地，所述抗酪氨酸磷酸酶抗体为鼠抗人igg单克隆抗体。
14.进一步地，所述磁性颗粒的涂覆基团选自链霉亲合素、对甲苯磺酸基、羧基、羟基、环氧基和氨基中的一种或几种的组合，所述磁性颗粒为粒径1-3μm的四氧化三铁颗粒。
15.进一步地，所述酪氨酸磷酸酶抗原为来源于大肠杆菌和毕赤酵母的重组抗原，所述重组抗原中来源于大肠杆菌的重组抗原和来源于毕赤酵母的抗原的质量比为1：1。
16.所述重组抗原中来源于大肠杆菌的重组抗原优选为：rsr公司的酪氨酸磷酸酶抗重组蛋白：货号：rla2/fr/1，批号：305l01。
17.基于同一发明构思，本公开的第二方面提供了一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括：
18.酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的制备方法，包括如下步骤：
19.(1)将酶溶于戊二醛溶液中，室温静置，得到酶溶液；
20.(2)在所述酶溶液中加入抗酪氨酸磷酸酶抗体，用碳酸缓冲液将溶液的总体积补充到需用的体积，混匀、静置，得到混合液；
21.(3)在所述混合液中加入甘氨酸，调节溶液的ph，室温静置；
22.(4)将步骤(3)得到的溶液室温透析，在得到的透析液中加入甘油，混合后即得到所述酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液；
23.和/或
24.生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液的制备方法，包括以下步骤：
25.(1)将生物素与酪氨酸磷酸酶混合，用碳酸缓冲液将溶液总体积补充到所需体积，避光反应，得到反应液；
26.(2)将反应液室温透析，在得到的透析液中加入甘油，混合后即得到所述生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液；
27.和/或
28.所述磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的制备方法，包括以下步骤：
29.(1)在磷酸盐缓冲液中加入磁性颗粒、抗生物素抗体和(nh4)2so4溶液，混匀；
30.(2)将步骤(1)得到的溶液置于培养箱中进行旋转反应，反应结束后，去除上清液，得到备用液；
31.(3)将所述备用液用磷酸盐缓冲液洗涤后定容，得到所述磁性颗粒-抗生物素抗体溶液。
32.将制备好的酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液、生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液、磁性颗粒-抗生物素抗体溶液用其各自对应的稀释液稀释到工作浓度后分装到试剂盒中，检测的时候可以直接根据需要的浓度来选择相应的试剂盒。
33.进一步地，所述稀释液包括用于稀释磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的稀释液、用于稀释生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液的稀释液，用于稀释酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的稀释液，和用于稀释酪氨酸磷酸酶抗体校准品和质控品的稀释液。
34.进一步地，用于稀释酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的稀释液，包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷(以下简称“tris”)4-15g/l、zncl
2 0.5-2g/l、mgcl
2 5-20g/l、牛血清白蛋白(以下简称“bsa”)1-5g/l、液体生物防腐剂(以下简称“proclin
tm
300”)1-2ml/l，且稀释液的ph为6.8-8.2。
35.进一步地，用于稀释生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液的稀释液，包括如下组分：tris 4-15g/l、nacl 1-10g/l、牛血清白蛋白1-5g/l、proclin
tm
300 1-2ml/l；且稀释液的ph为6.8-8.2。
36.进一步地，用于稀释磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的稀释液，包括如下组分：tris 4-15g/l、牛血清白蛋白0.5-3.0g/l、nacl 2-10g/l、proclin
tm
300 1-2ml/l、吐温-20 0.5-5g/l，且ph为6.8-8.2。
37.进一步地，用于稀释酪氨酸磷酸酶抗体校准品和质控品的稀释液，包括如下组分：tris 4-15g/l、牛血清白蛋白10-50g/l、proclin
tm
300 1-2ml/l、吐温-20 0.5-5g/l，且稀释液的ph为6.8-8.2。
38.进一步地，所述用于稀释酪氨酸磷酸酶抗体校准品和质控品的稀释液，优选为包括如下组分：tris 6g/l、牛血清白蛋白20g/l、proclin
tm
300 1ml/l、吐温-20 2g/l，且稀释液的ph为7.4
±
0.20。
39.进一步地，所述酪氨酸磷酸酶抗体校准品和/或质控品在检测时使用，可以购买市售的已经配制好浓度的校准品和/或质控品，也可以制备检测所需的校准品和/或质控品。
40.基于同一发明构思，本公开的第三方面提供了一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测方法，包括：
41.(1)将磁性颗粒-抗生物素抗体溶液、生物素标记的抗酪氨酸磷酸酶抗原溶液和待检测的血清样本加入到反应容器中，反应后洗掉游离成分；
42.(2)将酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液加入到所述反应容器中，反应后洗掉游离成分；
43.(3)向所述反应容器中加入化学发光底物液，测定反应容器中所述样本的发光值，依据所述发光值计算所述血清样本中抗酪氨酸磷酸酶抗体的含量。
44.进一步地，采用间接法的原理检测人血清中抗酪氨酸磷酸酶抗体，具体包括如下步骤：
45.将磁性颗粒-抗生物素抗体溶液、生物素标记的抗酪氨酸磷酸酶抗原溶液和待检测的血清样本加入到反应容器中，若样本中含抗酪氨酸磷酸酶抗体，则样本中的抗酪氨酸磷酸酶抗体与生物素标记的抗酪氨酸磷酸酶抗原形成复合物，同时复合物结合到磁性颗粒
上，洗掉游离成分；
46.将酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液加入所述反应容器中，酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体作为二抗，与样本中的抗酪氨酸磷酸酶抗体结合，并形成酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体-重组抗原-磁性颗粒复合物，洗掉游离成分；
47.加入化学发光底物液，酶催化底物液发光，测定反应容器中所述样本的发光值(rlu)，样本的发光值与样本中的抗酪氨酸磷酸酶抗体浓度呈正相关，依据所述发光值计算所述血清样本中抗酪氨酸磷酸酶抗体的含量。
48.进一步地，本公开所述的化学发光底物为：3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷(amppd)、cspd、4-硝基苯磺酸二钠盐六水合物(pnpp)、3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷(cdp-star)和aps-5[(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐]的其中一种或几种的组合。
[0049]
采用由免疫反应系统和化学发光系统组成的磁微粒化学发光免疫分析(mclia)测定系统，用免疫反应后的产物所产生的化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测，具有灵敏度高、稳定性好、无污染等优点。
[0050]
从上面所述可以看出，本公开提供的酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒及制备方法和检测方法，将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，大大提高了检测的灵敏度和准确性，具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点，同时以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量；以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积及发光面积，提高了反应的灵敏度；反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒具有搅拌作用，大大缩短了反应时间；
[0051]
检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广，配合磁微粒化学发光可以满足医院对快速和高通量的检测需求，采用化学发光免疫分析法对igg抗体分析，具有高灵敏度和特异性，操作简便无放射性污染，可以更好的应用于临床。
[0052]
反应体系发光时间长，检测结果更加准确；检测灵敏度高，能够达到0.06iu/ml；酶促化学发光免疫分析系统线性范围宽，达到1-4000iu/ml，相关技术中的的酪氨酸磷酸酶抗体化学发检测方法的检线性范围为20-2000iu/ml；
[0053]
化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过定标后，测试样本就可直接得到样本的浓度值；全自动化检测，试剂及样本的添加均由仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差，检测的精度更高。
附图说明
[0054]
为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0055]
图1为本公开实施例的抗酪氨酸磷酸酶抗体校准曲线示意图。
具体实施方式
[0056]
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
[0057]
需要说明的是，除非另外定义，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0058]
实施例1
[0059]
一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒，包括：工作浓度为0.1mg/ml的磁性颗粒-抗生物素抗体溶液、工作浓度为0.01μg/ml的n-琥珀酰亚氨-6-生物素氨己酸标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液和工作浓度为0.01μg/ml的碱性磷酸酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体溶液。
[0060]
实施例2
[0061]
一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒，包括：工作浓度为1.0mg/ml的磁性颗粒-抗酰氨基己酰-6-氨基己酸-生物素-n-羟基琥珀酰亚胺酯抗体溶液、工作浓度为0.5μg/ml的酰氨基己酰-6-氨基己酸-生物素-n-羟基琥珀酰亚胺酯标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液和工作浓度为0.5μg/ml的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体溶液。
[0062]
实施例3
[0063]
一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测的试剂盒，包括：工作浓度为0.5mg/ml的磁性颗粒-抗d-生物素-n-羟基琥珀酰亚抗体溶液、工作浓度为0.25μg/ml的d-生物素-n-羟基琥珀酰亚标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液和工作浓度为0.25μg/ml的碱性磷酸酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体溶液。
[0064]
实施例4
[0065]
一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括：
[0066]
a、酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的制备方法，包括如下步骤：
[0067]
(1)称取碱性磷酸酶5mg溶于1ml、质量分数为1.0％的戊二醛溶液中，于室温静置过夜，得到酶溶液；
[0068]
(2)在反应后的酶溶液中加入1mg的鼠抗人igg单克隆抗体且浓度应不低于1mg/ml，用1.0m ph＝9.5的碳酸缓冲液补充体积到2ml，混匀后静置过夜，得到混合液；
[0069]
(3)在混合液中，加入0.5ml、0.2m的甘氨酸，调节溶液的ph＝9.5，室温静置4h；
[0070]
(4)将步骤(3)所得的溶液装入透析袋中，用0.1m ph＝7.4的磷酸盐缓冲液室温透析24h，去除未反应的戊二醛等物质，中途更换一次缓冲液，用移液器取出透析袋中的液体，即为酶结合物，加入等体积的甘油2.5ml，即制备得到所述酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液，-20℃保存。
[0071]
b、生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液的制备方法，包括以下步骤：
[0072]
(1)将生物素与酪氨酸磷酸酶按摩尔比4:1进行混合，用1.0m ph＝9.5的碳酸缓冲液补充体积到不低于0.5ml，避光37℃反应2h，其中所述酪氨酸磷酸酶抗原为来源于大肠杆菌和毕赤酵母的重组抗原，所述来源于大肠杆菌的重组抗原和来源于毕赤酵母的重组抗原的质量比为1:1。
[0073]
(2)将步骤(1)的反应液转移到透析袋中，用0.1m pbs于4℃透析20-24h，中途更换一次缓冲液，用移液器取出透析袋中的液体，即为生物素结合物，加入等体积甘油，即得到所述生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液，-20℃保存；
[0074]
c、所述磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的制备方法，包括以下步骤：
[0075]
(1)在70ml 0.05-0.1m、ph＝7.4的pbs缓冲液中，加入100mg表面联有对甲苯磺酸基的磁性颗粒，加入4-8mg的抗生物素抗体，然后加入30ml 1-3m(nh4)2so4溶液，混匀；
[0076]
(2)将步骤(1)得到的溶液于42℃培养箱中旋转反应4-12h，反应结束后，置于磁力架上，去除上清液，得到备用液；
[0077]
(3)在所述备用液中加入0.01-0.05m、ph＝7.4的pbs缓冲液洗涤3次，用pbs溶液定溶至1l即得到所述磁性颗粒-抗生物素抗体溶液。所述磁性颗粒为表面包裹带有对甲苯磺酸基的四氧化三铁，粒径1-3μm。
[0078]
将制备好的酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液、生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液、磁性颗粒-抗生物素抗体溶液用其各自对应的稀释液稀释到工作浓度后分装到试剂盒中，检测的时候可以直接根据需要的浓度来选择相应的试剂盒。
[0079]
实施例5
[0080]
各种稀释液的配制：
[0081]
a：用于稀释生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液的稀释液，配制步骤为：在1l工艺用水中，加入tris 6g、nacl 3g、proclin
tm
300 1ml，搅拌至完全溶解后，加入bsa 2g搅拌至完全溶解，用6m hcl或2m naoh调整ph值在7.4
±
0.2范围内。
[0082]
b：用于稀释磁性颗粒-抗生物素抗体溶液的稀释液，配制步骤为：在1l工艺用水中，加入tris 6g、nacl 3g、proclin
tm
300 1ml、吐温-20 1.5g，搅拌至完全溶解；再加入牛血清白蛋白(bsa)20g，搅拌至完全溶解，用6m hcl或2m naoh调整ph为7.4
±
0.20。
[0083]
c：用于稀释酪氨酸磷酸酶抗体校准品和质控品的稀释液，配制步骤为：在1l工艺用水中，加入tris 6g、proclin
tm
300 1ml、吐温-20 2g，搅拌至完全溶解，再加入牛血清白蛋白(bsa)30g，搅拌至完全溶解，用6m hcl或2m naoh调整ph为7.4
±
0.20。
[0084]
d：用于稀释酶标记的抗酪氨酸磷酸酶抗体溶液的稀释液，配制步骤为：在1l工艺用水中，加入6g tris、1.5gzncl2、10.0g mgcl2搅拌至完全溶解，再加入2.1g bsa搅拌至完全溶解，再加入1.1ml proclin
tm
300，搅拌30分钟，用6m hcl或2m naoh调整ph值在8.0
±
0.2范围内。
[0085]
实施例6
[0086]
酪氨酸磷酸酶抗体校准品和质控品的制备：
[0087]
所述酪氨酸磷酸酶抗体校准品的制备方法包括如下步骤：将酪氨酸磷酸酶抗体用校准品稀释液稀释至工作浓度，所述工作浓度分别为5iu/ml、50iu/ml、200iu/ml、1000iu/ml、4000iu/ml。
[0088]
所述酪氨酸磷酸酶抗体质控品的制备方法包括：将酪氨酸磷酸酶抗体用质控品稀释液稀释至工作浓度，所述工作浓度分别为50iu/ml(低值质控品)、1000iu/ml(高值质控品)。
[0089]
实施例7
[0090]
一种酪氨酸磷酸酶自身抗体磁微粒化学发光免疫检测方法：
[0091]
本实施例中用到的生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液、抗生物素抗体标记的磁性颗粒和碱性磷酸酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体均为上述实施例3所述试剂盒中的溶液。
[0092]
本实施例中用到的校准品及质控品均为上述实施例6制备得到的。
[0093]
根据实验需要取出适量的反应管，设置校准品s1-s5各2管，低值质控品a1和高值质控品a2各2管，还有待检测血清样本m1、m2各2管。
[0094]
分别向s1-s5、a1、a2、m1、m2管中先加入50μl生物素标记的酪氨酸磷酸酶抗原溶液，30μl校准品、质控品或待检测血清样本，再加入50μl抗生物素抗体标记的磁性颗粒，在37℃下反应20分钟；
[0095]
其中，所述s1管中加入工作浓度为5iu/ml的校准品，s2管中加入工作浓度为50iu/ml的校准品，s3管中加入工作浓度为200iu/ml的校准品，s4管中加入工作浓度为1000iu/ml的校准品，所述s5管中加入工作浓度为4000iu/ml的校准品；
[0096]
所述a1管中加入工作浓度为50iu/ml的质控品，所述a2管中加入工作浓度为1000iu/ml的质控品；
[0097]
所述m1管、m2管中均加入待加测的血清样本。
[0098]
(2)磁分离清洗；
[0099]
(3)各管均加入50μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人igg单克隆抗体；
[0100]
(4)在37℃下反应10分钟。
[0101]
(5)磁分离清洗；
[0102]
(6)各管均加入化学发光底物200μl，避光检测，反应5秒读数。
[0103]
读数之后，首先利用全自动化学发光免疫分析仪对校准品进行检测，将校准品的检测结果通过内置于电脑的软件绘制成标准曲线，即为抗酪氨酸磷酸酶抗体校准曲线图，如图1所示，r2》0.99。
[0104]
然后将待检测血清样本的检测值带入校准曲线中，从校准曲线中得到相应的血清样本中抗酪氨酸磷酸酶抗体的浓度含量。
[0105]
以下是对本公开所述的酪氨酸磷酸酶抗体磁微粒化学发光免疫检测试剂盒的性能评价：
[0106]
(1)空白限的检测
[0107]
参照美国临床实验室标准化委员会(nccls)ep17-a文件推荐的实验方案，计算酪氨酸磷酸酶抗体化学发光免疫检测试剂盒的空白限。
[0108]
同时以英国生物医药国际公司(以下简称“英国rsr公司”或“rsr”)市售的ia-2试剂盒为对比例进行比对，分别使用本公开所述的ia-2试剂盒和rsr的ia-2试剂盒对酪氨酸磷酸酶抗体样品(零值样品1、零值样品2、零值样品3)进行检测，各自空白限的检测结果详见下表1。
[0109]
其中，零值样品指纯水或者校准品稀释液。
[0110]
所述rsr的ia-2试剂盒的主要成分包括：ia-2-生物素、链霉亲和素标记的过氧化物酶、反应促进剂。
[0111]
所述rsr的ia-2试剂盒的主要成分包括：ia-2-生物素、链霉亲和素标记的过氧化物酶、反应促进剂。
[0112]
表1空白限检测结果数据列表
[0113][0114][0115]
由上表可知，使用本公开所述的试剂盒，检测的空白限为0.060iu/ml，使用rsr的ia-2试剂盒，检测的空白限为1.17iu/ml，由此可知，本公开所述的试剂盒的检测空白限远远低于rsr的试剂盒，因此本公开的试剂盒的检测灵敏度大大高于rsr的试剂盒。
[0116]
(2)线性检测
[0117]
参考美国临床实验室标准化委员会(nccls)ep6-p文件，对本公开所述的酪氨酸磷酸酶抗体试剂盒进行评价。
[0118]
取高值(4000iu/ml)及低值(1.0iu/ml)的血清样本各1份(无溶血和脂血)，分别编为
⑥
号、
①
号。将
⑥
号高值和
①
号低值分别按4:1、3:2、2:3、1:4的比例混合作为
⑤
、
④
、
③
、
②
号。
[0119]
将6个不同浓度随机排列测定，每个重复检测3次，取其均值与目标值做直线回归，计算相关系数r，r2＝0.9999，大于0.99。用稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值及yi与估计值的绝对偏差和相对偏差，检测及计算结果详见下表2。
[0120]
表2线性检测结果数据列表
[0121][0122]
由上表可知，本公开所述的试剂盒在线性范围1-4000iu/ml内的检测结果的偏差较小，检测的准确率较高，因此本公开所述的试剂盒的对酪氨酸磷酸酶抗体样品检测的线性范围为1-4000iu/ml。
[0123]
(3)精密度测定
[0124]
参考(nccls)ep5文件中关于精密度试验的评价方案进行。
[0125]
取浓度为200u/ml和1000iu/ml的两个酪氨酸磷酸酶抗体样品，每个样本每个浓度各做10个平行实验，计算试剂盒的精密度，结果详见下表3。
[0126]
表3精密度测定结果数据列表
[0127][0128]
由上表可知，分别对浓度为200u/ml和1000iu/ml的两个酪氨酸磷酸酶抗体样品进行检测，其变异系数分别为0.83％、1.93％，由变异系数可知本试剂盒的精密度较高，并且变异系数的数值远远小于行业内规定的4.5％。
[0129]
(4)准确度测定
[0130]
用who国际标准品nibsc 97/550(jdf islet cell antibody)做为准确度样本，分别重复测定3次，计算相对偏差，详见下表4。
[0131]
表4准确度测定结果数据列表
[0132][0133][0134]
由上述结果可知，使用本公开所述的试剂盒对样本进行检测，检测的相对偏差值很小，远远小于行业内规定的相对偏差应≤10％的标准值。
[0135]
(5)阳性性符合率和阳性符合率
[0136]
分别使用英国rsr公司的ia-2试剂盒、德国的medipan公司的ia-2试剂盒以及本公开所述的试剂盒对160例正常样本(无糖尿病史)和90例ⅰ型糖尿病样本进行检测，检测结果统计详见下表5和表6。
[0137]
其中，英国rsr公司的ia-2试剂盒的主要成分包括：ia-2-生物素、链霉亲和素标记的过氧化物酶、反应促进剂；
[0138]
其检测结果的参考标准为：
[0139]
阴性区间：ia-2浓度《8iu/ml；
[0140]
灰区：ia-2浓度8-10iu/ml；
[0141]
阳性区间：ia-2浓度》10u/ml。
[0142]
德国的medipan公司的ia-2试剂盒的主要成分包括：链霉亲和素标记的过氧化物酶、ia2-生物素、反应促进剂、3,3,5,5-四甲基苯胺底物液；
[0143]
其检测结果的参考标准为：
[0144]
阴性区间：ia-2浓度《7.5u/ml；
[0145]
阳性区间：ia-2浓度≥7.5u/ml。
[0146]
本实施例中所用的本公开所述的ia-2试剂盒为上述实施例3中的试剂盒，本试剂盒的检测结果参考标准为：
[0147]
阴性区间：ia-2浓度《10.0iu/ml，发光值《130832；
[0148]
阳性区间：ia-2浓度≥10.0iu/ml，发光值≥130832。
[0149]
英国rsr公司的检测参考值是7.5iu/ml，德国meidipan公司的检测参考值是8.0，本公开所述的试剂盒的检测参考值是10.0iu/ml，三者的检测参考值接近，因此具有可比性。
[0150]
表5阴性符合率数据列表
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155][0156]
由上表5可知，对160例正常样本(无糖尿病史，理论上检测结果应为“阴性”)进行检测，结果如下：
[0157]
使用德国meidipan公司的试剂盒进行检测，检测结果中出现浓度大于10iu/ml的阳性样本有8例，所以有8个假阳样本；浓度在8-10iu/ml范围内的样本有1例，所以有一个灰区样本，因此假阳率为5.62％；
[0158]
使用英国rsr公司的试剂盒进行检测，检测结果中出现浓度大于7.5iu/ml的阳性样本有10例，所以有10例假阳样本，因此假阳率为6.25％；
[0159]
使用本公开所述的试剂盒进行检测，检测结果中出现发光值大于130832，即浓度大于10iu/ml的阳性样本有2例，因此假阳率为1.25％；
[0160]
由上述可知，使用本公开所述的试剂盒对ia-2进行检测，假阳率大大降低。
[0161]
表6阳性符合率数据列表
[0162]
[0163]
[0164]
[0165]
[0166][0167]
由上表6可知，对90例ⅰ型糖尿病样本(理论上检测结果应为“阳性”)进行检测，结果如下：
[0168]
使用德国meidipan公司的试剂盒进行检测，检测结果中出现浓度小于10iu/ml的阴性样本有15例，所以有15个假阴样本；浓度在8-10iu/ml范围内的样本有2例，所以有2个灰区样本，因此阳性符合率为81.11％；
[0169]
使用英国rsr公司的试剂盒进行检测，检测结果中出现浓度小于7.5iu/ml的阴性样本有15例，所以有15例假阴样本，因此阳性符合率为83.33％；
[0170]
使用本公开所述的试剂盒进行检测，检测结果中出现浓度是小于10iu/ml的阴性样本有8例，因此阳性符合率为91.11％；
[0171]
由上述可知，使用本公开所述的试剂盒对ia-2进行检测，阳性符合率大大提升，因此本公开所述的试剂盒检测的精度更高，检测效果更好。
[0172]
相较于现有技术，本公开所述的试剂盒将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，用免疫反应后的产物所产生的化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测，大大提高了检测的灵敏度和准确性，具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点，本公开的试剂盒具有以下优点：
[0173]
(1)以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量；
[0174]
(2)以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积以及发光面积，提高了反应的灵敏度；
[0175]
(3)反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间。
[0176]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0177]
本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、
改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。