一种去乙酰化酶SIRT1变构激动剂及其应用的制作方法

一种去乙酰化酶sirt1变构激动剂及其应用
技术领域
1.本发明属于药物化学领域，尤其是涉及一种去乙酰化酶sirt1变构激动剂及其应用。


背景技术：

2.在进入二十一世纪以来，世界各国老年人所占比例越来越大，老龄化程度日趋加重。机体衰老的同时，老年疾病患者人群占比也呈现迅速增长的趋势。延缓衰老，提升生活质量也就迅速成为社会各阶层人士的共同诉求。由此，抗衰老药物的开发工作成为世界各研究机构及医药生产企业药物研究的热点方向之一。
3.sirtuin蛋白家族是一类nad依赖型的去乙酰化酶，能催化组蛋白底物和非组蛋白底物的去乙酰化反应。研究发现sirtuin家族首个成员酵母sir2及其同源蛋白能够延长酵母细胞、秀丽线虫和果蝇的生命周期。更重要的，研究还发现可以通过增加sir2的人源同源物sirt1蛋白的表达量来延缓细胞衰老。因此有关sirt1激动激活作用的研究对于人类延年益寿等疾病的治疗具有重要的意义。
4.此外，去乙酰化酶sirt1在诸如糖异生以及胰岛素分泌调节等生理活动中发挥了重要的调节作用。有大量研究结果证实，提高nad依赖的去乙酰酶sirt1的活性在延缓衰老、治疗代谢紊乱、神经系统退化等多种疾病的治疗方面具有非常重要的意义。提高sirt1蛋白活性的小分子药物研究可以在众多代谢疾病的治疗方案制订过程中提供诸多参考价值。因此，这一药物具有非常重要的应用前景和发展潜力。
5.许多sirtuin蛋白激活化合物(stacs)已被报道用于sirt1相关研究，如天然stacs白藜芦醇和人工合成的stacs srt1720等。然而，大量的报道证明，在这两种小分子激动剂筛选的过程中，采用了荧光基团修饰后的多肽作为底物，而在天然底物上，这些激动剂的促进作用十分微弱。
6.目前，sirt1激动剂的筛选还存在着一些问题，第一，前期的一些高通量筛选方法，采用了具有荧光标记的活性检测方法，人为引入了干扰因素。第二，sirt1相较于其它家族成员，具有特殊的氮-结构域。基于配体的quantitative structure
–
activity relationship(qsar)筛选方法无法充分考虑靶点的结构柔性，故筛选到的激动剂先导化合物选择性不高。第三，基于药物靶点分子结构的筛选，往往需要在药物结合位点比较固定的情况下进行。在受体蛋白的活性口袋处筛选出具有高亲和性的小分子来阻断受体与底物的作用，达到抑制蛋白活性的目的。sirt1蛋白可以分为三个结构域。分别为氮-结构域(n-domain)，连接结构域(linker)，碳催化结构域(c-domain)。其中，linker位于氮、碳-结构域之间，催化底物结合在碳催化结构域。有别于传统蛋白的抑制机制，sirt1催化底物的过程中，涉及到位置自由度很大的氮-结构域。sirt1的激活底物的过程存在着很大的构象变化。所以很难直接确定传统意义上所需要的筛选“结合位点”。因此，通过合理有效的手段筛选出具有良好激动作用的sirt1的激动剂，具有重要的研究价值。


技术实现要素：

7.有鉴于此，为解决上述问题，本发明利用分子动力学模拟和生化实验手段研究sirt1蛋白变构分子机制，并以此为依据筛选出了具有良好激动作用的sirt1的激动剂sirt1的激动剂，由此本发明提出了一种去乙酰化酶sirt1变构激动剂及其应用。
8.具体而言，本发明一方面提供了一种去乙酰化酶sirt1变构激动剂，其技术方案是这样实现的：
9.一种去乙酰化酶sirt1变构激动剂，为具有均三嗪结构的如式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0010][0011]
其中，r1选自n或s；
[0012]
r2选自以下任一结构：
[0013][0014]
其中，z1、z2、z3均独立地选自h、卤素或-oh；z4表示为一个或者两个取代基，所述取代基选自h、卤素或oh，所述两个取代基在苯环位置为邻位、间位或对位；
[0015]
r3、r4均独立地选自c、n、s、o或取代的苯基形成的环状结构；
[0016]
r5选自或经取代的芳香基团；
[0017]
其中，z5表示为一个或者两个取代基，所述取代基选自h、卤素、-oh、ch
3-o-ch
2-、-n(ch3)、-no2或-o-ch3，所述两个取代基在苯环中的位置为邻位、间位或对位；
[0018]
r6、r7均独立地选自h、卤素或-oh；
[0019]
r8选自c、n、s、o或取代的苯基形成的环状结构；
[0020]
r9选自h或
[0021][0022]
其中，n为任一整数，z6表示为一个或者两个取代基，所述取代基选自h、卤素、-oh、ch
3-o-ch
2-、-n(ch3)、-no2或-o-ch3，所述两个取代基在苯环中的位置为邻位、间位或对位。
[0023]
进一步的，所述的r3、r4、r8选自取代的苯基形成的环状结构为以下任一结构：
[0024][0025]
进一步的，所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂为具有式ⅱ到
ⅸ
任一所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
[0026][0027]
八种均三嗪结构的sirt1变构激动剂是基于sirt1蛋白变构分子机制筛选得到，这八种均三嗪结构的sirt1变构激动剂可以加快sirt1与野生p53底物的去乙酰化反应，是sirt1蛋白的有效激动剂。
[0028]
进一步的，所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂用于增加sirtuin蛋白的活性。
[0029]
进一步的，所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂能以天然底物n12p增加sirtuin蛋白的活性。
[0030]
进一步的，所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂用于增加sirtuin蛋白的脱乙酞酶活性。
[0031]
进一步的，所述sirtuin蛋白是人源sirt1。
[0032]
进一步的，所述去乙酰化酶sirt1变构激动剂增加sirt1蛋白活性的剂量范围为50～400μm。
[0033]
进一步的，具有式ⅱ和式ⅵ所示结构的化合物在hek-293t细胞上有激活sirt1去乙酰化反应的活性，并且比srt1720和白藜芦醇有更好的细胞活性。
[0034]
本发明另一还提供了一种药物组合物，包括所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂以及药剂学上可接受的辅料、稀释剂、载体或它们的组合。
[0035]
本发明再一方面还提供了所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂或药物组合物，在制备延缓衰老、治疗代谢紊乱、神经系统退化疾病的药物中的应用。
[0036]
所述药物是通过激活去乙酰化酶sirt1来延缓衰老、治疗代谢紊乱、神经系统退化疾病的。
[0037]
进一步的，所述与衰老有关的疾病为中风、心血管疾病、关节炎、高血压或阿尔兹海默病。
[0038]
相对于现有技术，本发明所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂及其应用具有以下优势：
[0039]
(1)本发明利用分子动力学模拟和生化实验手段研究sirt1蛋白变构分子机制，解决了先前sirt1变构激动剂筛选位点难确定的难题，并以此为依据筛选出了具有良好激动作用的含均三嗪结构的去乙酰化酶sirt1变构激动剂。
[0040]
(2)经体外去乙酰化实验验证，本发明所述的去乙酰化酶sirt1变构激动剂具有较好的激动作用，传统的激动剂如白藜芦醇、srt1720只有在多肽底物被amc荧光基团修饰后才具有对sirt1蛋白的激活作用，而本发明所述去乙酰化酶sirt1变构激动剂在天然底物下仍对sirt1具有明显的激动作用。
[0041]
(3)通过在hek-293t细胞上的细胞活性实验，发现具有本发明所述的式ⅱ和式ⅵ所示结构的化合物能在细胞水平上激活sirt1蛋白的去乙酰化反应，并且比str1720和白藜芦醇具有更好的细胞活性。
[0042]
(4)本发明所述去乙酰化酶sirt1变构激动剂作为延缓衰老、治疗代谢紊乱、神经系统退化等多种疾病的靶点sirt1蛋白的有效激动剂，可将其作为进一步开发的候选或者先导化合物用于制备相关药物。
附图说明
[0043]
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0044]
图1分子动力学模拟研究sirt1氮端结构域的变构调节过程；
[0045]
图2 sirt1在激动剂的调节下对不同底物的去乙酰化作用激活的分子机制；
[0046]
图3 sirt1对不同底物的去乙酰化速率和白藜芦醇和与srt1720在不同类型底物下对sirt1的去乙酰化速率的影响；
[0047]
图4激动剂在sirt1变构激活过程中的可能的结合位点；
[0048]
图5用discovery studio软件的cdock算法对多种商业化合物库中的化合物在sirt1潜在变构激活位点进行高通量对接；
[0049]
图6 sirt1蛋白的表达纯化后得到的电泳图；
[0050]
图7 sirt1蛋白体外去乙酰化酶速率鉴定方法，酶偶联反应方法测活原理；
[0051]
图8检测虚拟筛选得到的小分子对sirt1蛋白去乙酰化酶耦连反应读数吸光度的影响；
[0052]
图9酶偶联反应检测虚拟筛选得到的小分子对sirt1蛋白的激活速率的影响；
[0053]
图10在细胞水平上激动剂对sirt1蛋白的激活速率的影响；a表示细胞测活的方法；b表示白藜芦醇的细胞活性；c表示srt1720的细胞活性；d表示stac-n12p-1的细胞活性；e表示stac-n12p-5的细胞活性；
[0054]
图11培养皿中的hek-293t细胞
[0055]
图12 discovery studio具有活性预测能力的药效团方法计算验证均三嗪结构的构效关系。
具体实施方式
[0056]
除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
[0057]
在说明书和权利要求书中使用的，单数型“一个”和“这个”包括复数参考，除非上下文另有清楚的表述。例如，术语“(一个)细胞”包括复数的细胞，包括其混合物。
[0058]
所有的数字标识，例如ph、温度、时间、浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
[0059]
除了特别说明，本文中提及的各种试剂均为市收购得。
[0060]
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
[0061]
一、sirt1变构激活机制的确定
[0062]
1.利用全原子分子动力学模拟，粗粒化分子动力学模拟，副本加速动力学模拟及拉伸分子动力学模拟等四种模拟方法，研究sirt1催化底物的变构激活动力学过程，如图1和图2所示。
[0063]
2.用sirt1去乙酰化实验验证分子动力学模拟的结果。主要测试白藜芦醇和srt1720在不同类型底物下对sirt1的激活作用。
[0064]
对照组：向96孔透明板中加入1
×
pbs buffer(ph 7.4)，其余加入各组分及终浓度如下所示：400mm sirt1-143-cs、0.2mm nadh、3.3mmα-酮戊二酸、1μm烟酰胺酶pnca、3u牛肝谷氨酸脱氢酶(sigma)、1mm dtt、100μm p53多肽、2％二甲基亚砜。然后将透明孔板放置于微孔检测仪上37℃孵育10-15min，待340nm波长处吸收示数稳定后加入nad

(终浓度2mm)，最后检测溶液在340nm处的吸收数值。该实验平行重复三次以消除误差。
[0065]
实验组：将多肽底物分别改变为nap、fdl、n5p、n12p。随后调整白藜芦醇及srt1720终浓度分别为0μm、50μm、100μm测定其对sirt1蛋白的激活效果。
[0066]
实验结果：由图3可知，对sirt1催化天然底物具有amc荧光标记的底物fdl，白藜芦醇具有三到四倍的激活作用，而srt1720和白藜芦醇对天然底物n12p的催化无激活作用。
[0067]
3.根据分子动力学模拟和去乙酰化实验验证的结果，确定激动剂在sirt1变构激活过程中的可能的结合位点，即潜在变构激活位点，见图4所示。
[0068]
二、利用潜在变构激活位点，进行虚拟筛选，得到sirt1变构激动剂待选化合物。
[0069]
利用discovery studio软件的cdock模块对多种商业化合物库进行高通量对接，见图5，确定打分靠前的待选化合物，如下表。
[0070]
表一 虚拟筛选结果中结合能最高的化合物(specs库)
[0071][0072][0073]
表二 虚拟筛选结果中结合能最高的化合物(chemdiv-ppi库)
[0074][0075]
表三 虚拟筛选结果中结合能最高的化合物(chemdiv库)
[0076][0077][0078]
对筛选出的化合物进行结合自由能验证，如下：
[0079]
表四 筛选出的先导化合物结合自由能
[0080][0081]
三、对筛选所得的化合物进行体外测活实验验证
[0082]
1.进行sirt1蛋白的表达和纯化
[0083]
把编码sirt1-143-cs(sirt1蛋白质第253,268,501,502处的半胱氨酸突变为丝氨酸)蛋白143位到512位和641位到665位的dna序列插入pet28a-sumo3载体上，构建sirt1剪切体的原核表达质粒，然后将该质粒转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中,涂布于含有100μg/ml卡那霉素的lb固体培养基中，于37℃培养8-12h。挑取单菌落，在lb培养基中培养过夜，然后将培养物扩大培养，待od
600
达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.3mm的iptg，于16℃诱导18h。然后离心收菌除去培养基，获得诱导后的细菌，将细菌悬浮在冰冷的缓冲液(20mm tris ph 8.0,500mm nacl,5％glycerol,and 1mm pmsf)中超声裂解细胞，通过高速离心除去细胞碎片，收集上清。随后使用ni-nta柱纯化目标蛋白。待上清与镍柱充分结合后，使用洗涤缓冲液(20mm tris-hcl ph 8.0,200mm nacl,5％glycerol，0-100mm咪唑)进行梯度洗涤去除与镍柱具有非特异性吸附作用的杂蛋白。最后使用洗脱缓冲液(20mm tris-hcl ph 8.0,200mm nacl,5％glycerol，100mm咪唑)洗脱目的蛋白。向洗脱后的蛋白溶液中加入适量的sumo蛋白酶进行酶切以除去融合蛋白上的sumo标签。切除标签后的蛋白质经过浓缩后,用分子筛superdex75(ge healthcare)进行进一步的分离纯化。收集sirt1蛋白所对应的峰，经sds-page验证后，浓缩，最后分装冻存于-80℃。图6为sirt1蛋白的表达纯化后得到的电泳图。
[0084]
2.化合物筛选和活性测试
[0085]
检测原理：
[0086]
见图7，本发明中采用的酶活检测方法是基于酶偶联的方式进行的，sirt1通过nad

依赖的去乙酰化作用可以去除底物多肽上的乙酰基，同时会产生另一种物质烟酰胺。烟酰胺在烟酰胺酶(pnca)的作用下转化为烟酸和氨。然后谷氨酸脱氢酶将氨、α-酮戊二酸和nadh转化为谷氨酸和nad

。最后，溶液在340nm波长处的吸收值即可反映nadh氧化物的含量。
[0087]
实验操作:
[0088]
将小分子激动剂溶解于dmso中使之完全溶解配制成储备液，放置于-30℃冰箱中储存。
[0089]
对照组：向96孔透明板中加入1
×
pbs buffer(ph 7.4)，其余加入各组分及终浓度
如下所示：400mm sirt1-143-cs、0.2mm nadh、3.3mmα-酮戊二酸、1μm烟酰胺酶pnca、3u牛肝谷氨酸脱氢酶(sigma)、1mm dtt、100μm p53多肽、2％二甲基亚砜。然后将透明孔板放置于微孔检测仪上37℃孵育10-15min，待340nm波长处吸收示数稳定后加入nad

(终浓度2mm)，最后检测溶液在340nm处的吸收数值。该实验平行重复三次以消除误差。
[0090]
实验组：除对照组所加入的组份外，将小分子激动剂也一同加入到孔板内(终浓度控制在0～400μm)孵育并测定340nm处的吸收值。另外，使用白藜芦醇(100μm)作为对照。
[0091]
通过测活实验验证，得到了式
ⅱ‑ⅸ
八种激动剂，这八种激动剂对sirt1催化天然底物n12p具有两到三倍的激活作用，见图8、9所示；而由图3可知，srt1720和白藜芦醇对n12p的催化无激活作用。
[0092][0093]
3.hek-293t细胞上的去乙酰化活性检测实验
[0094]
hek-293t细胞转染中使用了多种质粒。将sirt1-143-cs融合到哺乳动物质粒pcdna5的gal4 dna结合结构域(a.a.1-147)上作为表达构建(见图10a)。同时，通过添加五个共结合位点到酿酒酵母gal4蛋白的dna结合结构域(转录激活因子),构建具有ta启动子的荧光素酶报道质粒pgl6。pcmv-β-半乳糖苷酶(pcmv-β-gal)作为转染对照基因。
[0095]
当pcdna5构建体表达时，产生gal4-sirt1融合蛋白。gal4-sirt1融合蛋白的gal4部分与5x gal4结合位点结合，sirt1被募集到萤光素酶报道质粒的ta启动子。如果stac激活sirt1去乙酰化作用，它将抑制荧光素酶基因的表达(见图10a)。通过发光反应检测荧光素酶对荧光素的催化活性。
[0096]
将hek-293t细胞在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem培养基中培养，在37℃和5％co2的环境下保持。
[0097]
当细胞在100mm培养皿中覆盖60％-70％(见图11)时用以下转染混合物转染：2μg荧光素酶报告基因，2μg表达构建体，2μgpcmv-β-gal和20μgpei max。
[0098]
收获细胞8小时之前，分别将0.1μm，0.5μm或1μm的激动剂添加到培养皿中。将细胞
重悬于缓冲液(500mm nacl，20mm tris-hcl 8.0、1mm dtt)中，并通过超声进行裂解处理。
[0099]
在4℃下将裂解液以15000rpm离心速率离心10分钟，收集上清液用于荧光素酶活性测定。为了监测荧光素酶活性，将50μl hek-293t提取上清液与10μm atp和10mm mgcl2在96孔白板中孵育，并在酶标仪中检测360-700nm的发光，反应加入10μm萤光素进行起始反应。在室温下进行三次重复实验。
[0100]
由图10b-e可知，式ⅱ和式ⅵ所示化合物在hek-293t细胞上比白藜芦醇和srt1720具有更好的细胞活性。
[0101]
四、用quantitative structure
–
activity relationship(qsar)的方法得到sirt1催化天然底物有潜在激活作用的均三嗪化合物结构通式
[0102]
分析激动剂
ⅱ‑ⅸ
共同的结构特性，发现所有化合物具有均三嗪；再通过discovery studio的“活性预测能力的药效团”模块，验证了均三嗪结构对激活sirt1对天然底物的催化作用至关重要(图12)。
[0103]
综上，具有均三嗪结构的如式i所示的化合物在sirt1催化野生型底物的过程中具有产生变构激活的作用。
[0104][0105]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。