1.本发明属于生物医学工程
技术领域：
：，特别涉及一种载细胞微凝胶组装的组织工程支架及其制备方法和在骨修复领域的应用。
背景技术：
：：2.针对功能丧失或缺陷的人体组织/器官的修复问题，临床上传统解决方法仍依赖于组织、器官移植。然而，捐献的人体组织短缺且存在传染性疾病潜在风险，引发社会伦理道德问题，使得组织/器官移植面临诸多挑战。组织工程技术提供工程化的组织给器官修复重建带来了希望，并有望缓解器官捐献者短缺的实际问题。目前，组织工程技术已经实现了包括皮肤、软骨等组织的修复并进入临床应用。然而，复杂结构，三维空间和多细胞精确分布的工程化组织或器官尚未成功构建。组织工程有两种构建方式——“自上而下”和“自下而上”的方法。“自上而下”方法是利用大尺寸的块体支架材料来固载细胞或因子，构建工程化的类组织体，以期实现组织/器官的修复和重建。然而这一设计方式获得的组织工程化类组织存在诸多瓶颈问题：(1)作为固载细胞的块体水凝胶尽管富含水和具有多孔性，但纳米尺度的致密孔隙使得细胞间信号交换的活性蛋白或大分子、营养物质、以及细胞排泄物难以有效传输，物质扩散效率低下，最终导致块体支架内部的细胞趋于凋亡，难以正常繁殖并组织化；(2)由于块体材料内部药物分子的扩散效率低下且难以控制，难以实现药物因子的可控释放；(3)对于不规则形状的组织缺损修复手术操作困难，无法实现可注射、可塑性，(4)在构建复杂组织结构过程中，难以在三维支架上精确固载不同种类的细胞等(jiangw，lim，chenz，etal.cell-ladenmicrofluidicmicrogelsfortissueregeneration[j].labonachip，2016，16(23)：4482-4506.)。[0003]人体组织/器官是由不同种类的细胞组成的微小功能单元组装而成。“自下而上”的组织工程构建方式是以微观尺度层面上构建组织工程的模块，然后通过微观模块的组装获得工程化组织体的方法。而获得这些微小的模块需要先进的微加工技术和实现模块组装的技术。微加工技术包括光刻蚀技术、微模塑技术、微流控液滴技术等(dalyac，rileyl，segurat，etal.hydrogelmicroparticlesforbiomedicalapplications[j].naturereviewsmaterials，2020，5(1)：20-43.)。相对与大尺寸支架材料而言，因为凝胶微球有利于物质交换并可对细胞外微环境形成更精确控制，凝胶微球更有利于细胞的固载包埋和三维培养。但现有技术存在的问题：尺寸难以达到单细胞水平，通量不够高，方法的生物相容性问题和模块组装仍是难题(dubayr，urbanjn，darlingem.single-cellmicrogelsfordiagnosticsandtherapeutics[j].advancedfunctionalmaterials，2021：2009946.)。[0004]目前，已有一些利用凝胶微球进行组织或器官仿生构建的报道，如，fernandezjg等人把一个固体表面作为模板来引导凝胶微球的组装，但无法实现连续批量化生产(fernandezjg，khademhosseiniali.micro-masonry：constructionof3dstructuresbymicroscaleself-assembly[j].advancedmaterials，2010，22(23)：2538-2541.)；khademhosseiniali课题组研究报道了通过光刻蚀技术制备凝胶微球，然后利用凝胶微球亲水驱动引发组装，组装体通过二次光交联来稳定结构，然而这种组装方法形成的组装体是无序的且无法形成复杂的组织结构(duy，loe，alis，etal.directedassemblyofcell-ladenmicrogelsforfabricationof3dtissueconstructs[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，2008，105(28)：9522-9527.b)；xuf课题组通过光刻蚀技术制备凝胶微球，采用磁力和声波辅助组装凝胶微球，或采用带正负电荷的凝胶微球组装二维或三维结构，这一方法也无法用于复杂组织结构的组装(xuf，finleytd，turkaydinm，etal.theassemblyofcell-encapsulatingmicroscalehydrogelsusingacousticwaves.biomaterials，2011，32：7847-7855)。donaldr.griffin等人提出了一种用于生物医学领域的可控自退火微凝胶颗粒的制备制备方法，作为细胞迁移支架，用于治疗和密封伤口，但不能批量化或高通量制备凝胶颗粒并且未能实现凝胶颗粒的可控组装。但是这些组装方法无法形成复杂的组织结构，尚不能精确分布不同种类的细胞(griffindr，weaverwm，scumpiapo，etal.acceleratedwoundhealingbyinjectablemicroporousgelscaffoldsassembledfromannealedbuildingblocks[j].naturematerials，2015，14(7)：737-744.)。随着3d打印技术的兴起，3d生物打印技术制备组织工程支架的方法受到极大关注。3d生物打印技术具有个性化制作、高精度和高分辨率的优点，可以在墨水中加入细胞进行打印，实现细胞的分层有序放置。凝胶微球由于其具有良好的生物相容性、自修复能力等性质可作为生物墨水用于3d生物打印(highleycb，songkh，dalyac，etal.jammedmicrogelinksfor3dprintingapplications[j].advancedscience，2019，6(1)：1801076.)。但是包裹生物活性物质的微凝胶作为生物墨水用于生物3d打印还存在诸多挑战：(1)载单细胞的微凝胶作为生物墨水可打印性及作为类组织生物功能性验证尚存在空白；(2)凝胶微球中细胞活性及功能性仍存在挑战。技术实现要素：[0005]本发明目的在于提供一种载单细胞微凝胶生物墨水基于3d打印技术制造类组织的方法及其在组织修复领域的应用。[0006]本发明首先将选用甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物材料采用液滴微流控技术制备载单细胞的凝胶微球，作为生物墨水；采用生物打印的方式进行载细胞的的凝胶微球组装(打印)。本发明利用生物打印方式能够实现三维复杂结构的构建，提高制备效率、保证细胞活性，有利于损伤组织的快速修复；其中载干细胞的微凝胶打印形成的类组织进行成骨诱导具有较快的成骨分化活性，大大缩短成骨时间，为骨再生医学应用奠定基础。[0007]本发明采用如下技术方案来实现。[0008]一种生物3d打印的方法，包括以下几个步骤：[0009](1)将甲基丙烯酸修饰的海藻酸(algma)与另一种聚合物材料通入集成微流控芯片，制备载细胞的微液滴，引发微液滴中所述材料交联，获得载细胞的的凝胶微球；[0010](2)将步骤(1)所述的载细胞的微凝胶作为墨水，经密堆积后，利用生物打印的方式实现载生物活性物质的微凝胶的精确排布，所述的凝胶微球通过钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、镍或镓离子交联完成组装。[0011]上文所述的技术方案中，所述另一种聚合物材料为天然聚合物或合成聚合物的一种或者二种以上的组合，所述天然聚合物包括细胞外基质、海藻酸、海藻酸盐、海藻酸盐衍生物、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖；蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、层连接蛋白；所述合成聚合物包括聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙烯醇、、聚氧化乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚氨基酸、聚丙烯酰胺、普朗尼克。[0012]上文所述的技术方案中，所述甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物可以紫外光交联反应，以实现步骤(1)中微凝胶的凝胶化，进一步实现步骤(2)所述的凝胶微球颗粒之间的钙交联反应。[0013]上文所述的技术方案中，用于步骤(1)中微凝胶的甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物凝胶化交联基团的修饰，例如，将材料修饰为具有紫外光引发聚合反应基团(如甲基丙烯酸酯基，巯基/丙烯酸酯基，四嗪类/丙烯酸酯基)，亦或能与材料本身自带基团反应的基团(如邻硝基苄醇基)紫外光照后能产生与氨基反应的醛基，使材料凝胶化；或修饰巯基和马来酰亚胺，叠氮基和环辛炔基，醛基和氨基，使材料具有自发耦合反应凝胶化；或将材料修饰上主客体反应基团(如环糊精和金刚烷)使得材料发生凝胶化；或通过温度使得凝胶化(如明胶在低温下形成凝胶)；或通过加入交联剂(如，金属离子、连接蛋白多肽、二硫苏糖醇dtt)实现基团交联使得材料凝胶化。[0014]上文所述的技术方案中，所述的载细胞微凝胶再次钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、铜、镍或镓离子交联，能实现凝胶微球颗粒之间的稳定，再次引发交联的方式也可采用其他方式，也包括：自发的基团之间的化学反应，亲核基团(硫醇、胺、氨氧基)的迈克尔加成反应、点击化学反应；通过光或温度引发基团之间的化学反应；通过加入交联剂，如：蛋白多肽、金属离子等实现基团交联。[0015]上文所述的技术方案中，具体而言，步骤(1)中所述的被包埋活体细胞是本领域技术人员可以根据实施目的的不同进行选择；[0016]所述活体细胞一般为原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种或二种以上的组合；[0017]上文所述的技术方案中，利用集成微流控芯片制备载细胞的微液滴的过程，主要包括如下步骤：[0018](1)配制溶液[0019]①甲基丙烯酸修饰的海藻酸(algma)与另一种聚合物溶解于水或pbs或培养基中制备溶液，随后加入交联反应引发剂，得到水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第一相水相溶液，另一相将细胞加入上述溶液中得水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第二相水相溶液；[0020]②将含有非离子表面活性剂的矿物油(石蜡/二甲基硅油)作为油包水乳液体系的油相；或含氟化表面活性剂的氟化油，作为油包水乳液体系的油相。[0021]上文所述的技术方案中，所述集成微流控芯片的微流道采用单通道或多通道，微流控芯片具有流体聚焦结构、t形混合结构、同向流动型或十字结构的微流通道，具有至少4相液体输入口，以及乳化通道和输出通道。所述的4相液体输入口包括：第一水相溶液输入口，第二水相溶液输入口，第一重油相输入口；且所述微通道内壁表面进行疏水处理。[0022]上文所述的技术方案中，所述微流控技术是将所述多重流体组成的第一水相溶液、第二水相溶液、第一重油相通过微量泵或微注射器分别以第一流速为5-2000μl/h、第二流速为5-2000μl/h、第三流速为200-20000μl/h，流速输送至微流控芯片装置的相应微通道中，形成单分散的水/油/水双乳液。[0023]上文所述的技术方案中，所述单通道微流控芯片：[0024]优选的第一流速为10-500μl/h，更优选20-200μl/h；[0025]优选的第二流速为10-500μl/h，更优选20-200μl/h；[0026]优选的第三流速为500-3000μl/h，更优选800-2000μl/h；[0027]上文所述的技术方案中，所述多通道微流控芯片：各通道优先流速及更优选流速为单通道的倍增，例如，两通道微流控芯片为单通道流速的2倍，三通道微流控芯片为单通道的流速的3倍，以此类推。[0028]上文所述的技术方案中，具体而言，多通道微流控能够提高包埋通量，缩短包埋时间至0.5-6h，保证载生物活性物质活性，有利于进一步实施生物打印。[0029]上文所述的技术方案中，具体而言，所述第一相和第二相水相流速总和与第一重油相的流速比为1∶0.01～1之间，优选1∶0.05～0.5；第一重油相流速和第二重油相流速比为1∶0.1～50，优选1∶0.5～10。[0030]上文所述的技术方案中，所述交联反应引发剂包括①配位反应引发剂(选自钙-乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、钙-氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸钙纳米颗粒、硫酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒中一种或几种的组合)，所述引发剂的终浓度以钙含量记为10-1000mm；②具有良好生物相容性的光化学反应引发剂(选自2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，i2959)、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(lithiumphenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，lap)、偶氮引发剂va086(2，2′‑(diazene-1，2-diyl)bis(n-(2-hydroxyethyl)-2-methylpropanamide)、安息香甲基醚(2-methoxy-2-phenyl-acetophenon)、伊红y(eosiny)中一种或几种的组合)，光照波长为365nm-780nm，光照时间0.00001s-600s；③温度介导的交联剂，交联温度为0-40℃；④酶催化反应所用酶(选自歧化酶、凝血酶、谷氨酰胺转氨酶中一种)。[0031]上文所述的技术方案中，所述微流控技术制备得到的载细胞微凝胶产品直径为20～500μm；粒径分布的离散系数在0.01～20％，本发明方法制备的载细胞微凝胶从微流芯片制备成油包水乳液分散在油相中，凝胶化后，经输出口到注入收集水性溶液并自发分散在水性溶液中，载细胞微凝胶在乳液中停留的时间在1～60秒，保证其活性。[0032]上文所述的技术方案中，步骤(2)是将步骤(1)制备的载细胞微凝胶作为可打印的生物墨水，借助三维(3d)移动平台，通过按需逐点打印和层层叠加的方式，载细胞凝胶微球可以同时快速交联和固化，达到精确构建三维复杂结构的目的。[0033]上文所述的技术方案中，将所述的用于生物打印的载细胞微凝胶进行密堆积，置于打印容器中，进行生物打印。其中，载细胞微凝胶密堆积方法可以是离心，过滤，以及抽滤等化工操作单元。[0034]本发明另一方面提供一种生产功能组织的方法，主要包括：以载细胞凝胶微球通过上述生物3d打印的方法打印获得功能组织，检测分化或成熟的一种或多种标志物；或检测在功能组织中预期的分化或成熟的一种或多种标志物的表达水平。[0035]本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：[0036](1)本发明功能基团修饰的海藻酸与另一种聚合物材料，可以借助微乳液方法或微流控液滴技术固载细胞，维持了细胞在微凝胶内较高的活性和功能。[0037](2)本专利开发的凝胶微球组装支架材料能显著提升材料内部物质传输效率。传统的整体连续结构的块状水凝胶材料虽然具有高孔隙率，但凝胶网络孔隙尺寸(meshsize)通常小于100nm，因此物质的扩散和传输效率显然比较低；本专利开发的由凝胶微球颗粒组装而成的水凝胶材料，由于凝胶微球颗粒的形态和堆积密度受限，因此在保持足够强度支撑和材料完整结构的同时具有更高的空隙率和百微米尺度的空隙尺寸，因此具有更高的物质传输效率。实施例4中的附图10对比了传统的块状水凝胶和本专利开发的微球组装水凝胶，凝胶微球组装支架材料注射液瞬间就会扩散整个结构。然而，传统的块状水凝胶10分钟后还不能扩散到整个结构中。[0038](3)本专利技术所述的组织工程支架是由载细胞微球组装而成，微球尺寸通过微流控液滴技术可以实现微球尺寸控制和固载细胞数量控制，最小可控制在固载单细胞，且微球尺寸在10-200um直径范围。以这些载细胞微球为基本单元组装而成具有宏观尺寸的细胞化组织工程支架，此时，支架中所有细胞在空间上被包裹于＜200um直径的凝胶球中，这样的结构较传统的均匀包裹于块体凝胶中的细胞化支架材料具有更好的物质(细胞生存所需的养分和细胞分泌的废物)传输，不仅显著提升细胞的长期存活率，且显著增加细胞的代谢活力，因此从功能性上也有显著的优势。[0039](4)该方法构建的类组织，支持干细胞发生快速成骨分化，3天即可矿化，有利于骨再生及修复领域。[0040](5)现有技术多数为在载多细胞的微凝胶或者微凝胶表面培养细胞，均存在结构不稳定、容易粘结等问题，本发明的载单细胞微凝胶经过紫外交联和钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、铜、镍或镓离子交联完成组装，能够获得结构稳定的组织构建块。离子的作用：ca离子具有促进成骨、sr离子有抑制破骨、cu诱导血管化，使得材料具有多功能性。[0041](6)本发明通过生物打印技术将载细胞微凝胶精确排布，微凝胶之间可以发生物理或化学交联固定在一起。其中，载细胞凝胶微球可被用作组织构建块，以创建三维(3d)组织和器官，形成单细胞精度、高细胞密度仿生组织微单元。当微球尺寸小于50μm时，细胞密度不低于1*106个/cm3。[0042](7)本发明涉及的凝胶微球颗粒中也可以包封生物活性物质，进行活性物质的缓慢释放，用于免疫调控，促进伤口愈合。[0043](8)本发明采用的技术能够有效保证细胞活性；且利用生物打印方式能够实现三维复杂结构的构建，在再生医学领域具有良好的应用前景。[0044](9)本发明涉及的凝胶微球颗粒具有两种应用方式，可注射颗粒水凝胶，另一种是打印支架，前者用于微创手术、后者用于定制化组织填充支架。附图说明[0045]为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。[0046]图1为集成微流控芯片制备载细胞微凝胶的连续加工过程图。[0047]图2为本发明所使用的集成化微流控芯片的整体结构示意图(以集成16个生产单元为例)；其中a、c为液相分配基片；b为液相生产基片；1液相输入端口、2阻力控制单元、3输出端口、4输入端口、5液相输入通道、6乳化通道、7输出通道、8局部阻力控制单元、9清洗通道、10清洗相输入端口、11产品输出端口。[0048]图3为集成微流控芯片制备载细胞微凝胶的连续加工过程中芯片内不同位置实际液相流动状况图。其中a实际生产过程中液滴生产单元内液滴形成图；b为生产单元的液相流动状态；c为收集通道的液相流动状态。[0049]图4为集成微流控芯片生产液滴和微凝胶表征，(a)微流控芯片生产率对比图像，其中，1×表示1个生产单元，32×表示32个生产单元；(b)集成微流控技术制备的微液滴图像。[0050]图5为载细胞微凝胶中细胞分布遵从泊松分布。[0051]图6为密堆积微凝胶的剪切变稀(a)、自愈合性能(b)和可挤出性(c：a微凝胶墨水可挤出性和b纯水凝胶预聚溶液挤出效果对比)。[0052]图7为微凝胶作为生物墨水的生物3d打印结构图像。[0053]图8为二次交联的前后的微凝胶墨水挤出稳定性对比图。[0054]图9为剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性。[0055]图10为颗粒凝胶和块状凝胶的物质扩散能力。[0056]图11为颗粒凝胶中的支架中hmscs的活性及增殖，(a)在颗粒凝胶或块状水凝胶中hmscs的存活率和(b)hmscs的dna含量变化。[0057]图12为颗粒凝胶中hmscs不同时间alp活性测定。[0058]图13为颗粒凝胶中hmscs不同时间茜素红染色。[0059]图14为hmscs在培养板(tcp)、块状凝胶(bulkgel)以及颗粒凝胶(cinmg)培养3天和7天后的茜素红染色。[0060]图15为植入4，8和12周后，对sd大鼠颅顶骨的二维和三维重建micro-ct图像(a)，绿色代表髓腔内新形成的骨组织；(b)骨体积与组织体积之比(rbv)；(c)骨小梁数(tn)；(d)小梁间距(ts)；其中，cinmg：缺损填充载细胞颗粒微凝胶(细胞微凝胶首先培养3天然后成骨诱导7天后植入体内)，mg：缺损填充空颗粒微凝胶(与cinmg组处理方式相同)，bg：缺损填充块体凝胶(与cinmg组处理方式相同)，control：缺损无任何填充物(不进行处理)。[0061]图16植入4、8、12周后，sd大鼠颅骨缺损骨形成的h&e染色图。[0062]图17为用alg-ma和gelma制备得到的密堆积凝胶微球进行挤出打印后图片(a)；(b)挤出打印后滴加250mmcacl2溶液二次交联后图片；(c)二次交联后显微镜下4倍图片；(d)荧光染色后显微镜下4倍图片；(e)荧光染色后显微镜下4倍荧光图片；(f)荧光染色后显微镜下10倍荧光图片。[0063]图18为死活细胞荧光染色照片。[0064]图19为绿色荧光标记的海藻酸钠微球打印排列成的图案。[0065]图20为海藻酸盐微凝胶包裹间充质干细胞的皮肤创面愈合能力，(a)治疗7天后创面愈合的代表性图像及创面愈合的痕迹，(b)糖尿病大鼠创面愈合数据(n＝6)；(c)组织切片h&e染色图，蓝色箭头表示微凝胶周围浸润的毛细血管，红色箭头表示微凝胶中保留的间充质干细胞，4×图像的比例尺为500μm，63×图像的比例尺为20μm；(d)上皮间隙的定量；(e)组织切片的h&e染色肉芽组织的厚度；不同处理后伤口cd3阳性(t细胞：红色)和f4/80阳性(巨噬细胞：绿色)的代表性免疫荧光染色(f)和定量分析(g)，dapi(蓝色)染色示细胞核，比例尺为20μm。具体实施方式[0066]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。[0067]本发明使用的集成化微流控芯片即发明专利(cn112275336a)公开的集成化微流控芯片，其基片上至少设置有2个液滴生产单元，并同时包含有多个液相输入模块以及一个清洗输出模块，液相输入模块根据其内部输送的液相种类可分为分散相分配单元、连续相分配单元，且其分类仅与其内部液相种类有关，与芯片内相对位置无关，因而实际生产中通道内液相输入位置可随意调换，达到根据实际需求变换液滴生产方式的目的，提高芯片使用的灵活性。多个分配模块必包含一个连续相分配模块以及一个或多个分散相分配模块，且各个分散相分配模块的相对位置同样不固定；所述液相输入模块均带有各自的进样端口，所述清洗输出模块同时带有清洗相输入通道以及产品输出通道，每个液滴生产单元均与所有液相输入模块以及清洗通道相连；其中，液相输入模块最少含有两个，如有特殊微凝胶制备需求，可额外添加一个以上的包含液相输入模块的基片及其对应的输送管路；连续相、分散相、清洗相采用注射泵、蠕动泵、气压泵、液压泵中的一种或多种方式注入。[0068]根据附图2，在向基片a中的液相输入端口1(a-1)泵入液相后，液相经由液相输入模块内的阻力控制单元2(a-2)控制后，液相从液相输入模块输出端口3输出后(a-3)，穿过基片a注入基片b上的各液滴生产单元输入端口4(b-4)，进而注入液滴生产单元的乳化通道6(b-6)；同理，向其他基片(例：c)液相输入端口1(c-1)注入的液相也以等流量经阻力控制单元2和输出端口3(c-2、c-3)注入基片b上的各液滴生产单元；其中，含细胞或其他搭载相的水凝胶预聚物相中的液相在阻力分配结构控制下能够一直保持较高流速，从而保证了搭载相能够在其中稳定流动，不发生堵塞。[0069]液滴生产单元乳化通道6内(b-6)，不相容液相间经过管路交叉口后以恒定流量相互融合，剪切，实现粒径分布稳定的液滴的乳化，然后经由油相或外源的交联刺激诱发微凝胶的交联固化，实现细胞或其他搭载相的包埋。[0070]液滴生产单元下游，微颗粒经过一段距离标准通道即输出通道7(b-7)后进入局部阻力控制单元8(b-8)，以扩大腔为例，由于扩大腔尺寸与普通通道有一定的尺寸差异，此时微凝胶舒张为圆球状，并进一步固化定型，同时在扩大腔内继续迁移；同时基于其尺寸限制，液相流速仍然保持在较高水平，因此可以避免微凝胶在通道内的堵塞，保持流到畅通。[0071]清洗通道9(b-9)呈环状单路布置，各生产液滴单元下游的扩大腔等距离排布于清洗通道内环。清洗相由清洗相输入端口10(b-10)直接泵入，在清洗通道中与扩大腔排出的两相乳液接触，经由清洗剂或表面活性剂自身特性实现破乳以及水凝胶分离。同时清洗相与排出乳液共通组成的多相流量仍然保持了清洗通道内的流速，因而即使清洗通道尺寸远大于标准通道以及扩大腔，其流速仍然可以保证整个清洗槽内的畅通。更进一步的，基于清洗通道较大的尺寸，其内部流阻远小于标准通道，因而其对各个不同液滴生产单元下游的阻力影响可以忽略，最终由产品输出通道11(b-11)收集得含产品的两相液相。[0072]本芯片的基片a、b、c的材质可以为玻璃、硅、金属、聚合物中的一种或多种的混合物，其中聚合物可以为pdms(聚二甲基硅氧烷)、pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、pc(工程塑料)、coc(环烯烃共聚物)、pet(聚对苯二甲酸乙二酯)中的一种或多种，基片间采用热压、胶粘、激光焊接、超声焊接、螺栓对接、阳极键合、等离子键合中的一种或多种方式封装。[0073]本发明以集成了32个生产单元的多层结构的集成化微流控芯片(微流控芯片的具体设计方法见cn112275336a)制备搭载msc细胞的微凝胶，可以持续稳定的制备多种水凝胶材料的载细胞微凝胶颗粒，并可以通过一个连续的加工过程直接获得载活性物质微凝胶如图1所示。[0074]实施例1[0075]1.细胞培养：[0076]以人骨髓源性干细胞(hmscs)培养为例，增值培养基由α-mem(α-minimumeagle’smedium)，10％胎牛血清(fbs，gibco)组成，培养条件37℃，95％相对湿度与5％co2。细胞培养基每三天后更换。使用前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗，置于胰蛋白酶/edta溶液5分钟，悬浮于培养基中备用。[0077]2.载细胞微凝胶颗粒制备：[0078]将0.1wt％lap(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)，1wt％algma(甲基丙烯酰化海藻酸钠)和2.5wt％gelma(甲基丙烯酸酰化明胶)前体混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。[0079]调整至所有通道稳定生成液滴后，芯片内液滴生产状况如图3所示。如图4a所示，与单通道芯片相比，由该集成芯片30min可得较高产量的微液滴。这些微液滴结构均一(如图4b所示)。如图5所示将该集成芯片应用于载细胞微凝胶的加工制备，载细胞微凝胶尺寸为86.78±4.33μm，载单细胞的微凝胶占36.18±1.09％，空微凝胶占43.83±5.57％可以发现载细胞微凝胶中细胞分布遵从泊松分布。[0080]实施例2[0081]将实施例1中制备的载细胞微凝胶进行离心(1000rpm)收集，然后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积，此时微凝胶的干重为4wt％。然后，对密堆积的微凝胶进行了流变学测试，结果表明该密堆积微凝胶具有剪切变稀的性质，同时具备自修复的性能(如图6a和6b所示)，微凝胶的流变特性满足作为生物墨水可挤出打印的性质。图6c展示了微凝胶作为墨水可挤出的优势。借助3d打印设备，将微凝胶作为生物打印墨水得到不同的组织结构，并且能够进行仿生组织打印，将有利于组织构建(如图7所示)。以上结果说明微凝胶具有可打印性质。[0082]实施例3[0083]实施例2中进行密堆积微凝胶打印后，为了保持密度结构稳定性，将微凝胶通过注射器挤出并进行稳定性测试，二次交联前由注射器挤出的微丝两个横梁间隔变大时，发生弯曲(如图8a所示)，二次交联后(钙离子交联后)，密堆积微凝胶具有结构稳定性(如图8b所示)。进一步测试了恒定频率(1hz)的应变扫描来表示剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性(图9a)。可以发现交联前后，微凝胶在不相同的应变幅值表现出交叉。在交叉点处的模量(g′＝g″)，交联后的微凝胶明显高于未交联的微凝胶。以上结果表明在低应变区间内，交联后的微凝胶具有更高的剪切模量。未交联的微凝胶的剪切模量比交联后的小一个数量级。此外，在1％应变条件下，交联前后的微凝胶在小于10hz的剪切频率下表现为固体材料，而这可能由于密堆积的微凝胶钙离子交联后具有一定的空间稳定性(图9b)。[0084]实施例4[0085]实施例2中进行密堆积微凝胶打印后，为了保持密度结构稳定性，进行交联后(钙离子交联后)，密堆积微凝胶具有结构稳定性(如图8b所示)。进一步测试了恒定频率(1hz)的应变扫描来表示剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性(图9a)。可以发现交联前后，微凝胶在不相同的应变幅值表现出交叉。在交叉点处的模量(g′＝g″)，交联后的微凝胶明显高于未交联的微凝胶。以上结果表明在低应变区间内，交联后的微凝胶具有更高的剪切模量。未交联的微凝胶的剪切模量比交联后的小一个数量级。此外，在1％应变条件下，交联前后的微凝胶在小于10hz的剪切频率下表现为固体材料，而这可能由于密堆积的微凝胶钙离子交联后具有一定的空间稳定性(图9b)。[0086]将实施例2中得到的密堆积微凝胶放到模具成型，然后用钙离子进行交联。用相同模具直接将聚合物预聚液成型得到块体凝胶(所用聚合物与微凝胶制备相同组分及比例)。为了方便观察注射含有红色染料的去离子水，从图10可以看出微凝胶组成的颗粒胶注射瞬间就会扩散整个结构。然而，块体凝胶10分钟后还不能扩散到整个结构中。为了验证微凝胶打印结构对细胞的影响。将含有hmscs的微凝胶打印在6孔细胞培养板上，并在生长培养基中培养。分别在培养1、3、5、7、10和14天后，使用live/试剂盒(invitrogen，china)测定微凝胶墨水中hmscs的活力。采用dsdnahs检测试剂盒(yeasen，china)检测dna含量。实施例1制备的微凝胶生物墨水与块状水凝胶中细胞存活率相比，可以发现颗粒凝胶中的细胞存活率较高(如图11a所示)。此外，dna含量检测显示颗粒凝胶中细胞增殖增加，而块状水凝胶中细胞dna含量逐渐减少(如图11b所示)，活/死细胞染色证明随着培养时间的增加，支架中的hmscs保持着非常高的存活量。进一步表明，载细胞微凝胶作为生物打印墨水能够保持细胞较高的活性。[0087]实施例5[0088]载细胞微凝胶作为墨水打印的组织结构的生物学评价：[0089]1.载细胞微凝胶中细胞的生物学功能[0090]分别在第7、14和21天进行碱性磷酸酶染色(alpstaining)和茜素红染色(alizarinstaining)。碱性磷酸酶染色采用碱性磷酸酶显色试剂盒。茜素红染色用于证实微凝胶中细胞周围的钙化结节。通过离心(500g，5min)在试管中收集细胞负载的微凝胶，并用dpbs洗涤三次。样品用4％多聚甲醛(pfa)固定20min，然后进行试剂染色。alp染色和茜素红染色后用倒置荧光显微镜观察。采用cellsens软件计数和测量alp阳性细胞和茜素红染色微凝胶的厚度。[0091]为了量化alp活性，使用胶原酶和透明质酸酶以1mg/ml的浓度从微凝胶中释放细胞，然后用裂解缓冲液裂解。离心(300g，5min)后，根据试剂制造商的说明，使用碱性磷酸酶测定试剂盒测量细胞裂解的上清液的alp活性。[0092]对颗粒凝胶中hmscs进行alp染色，结果表明alp阳性表达比例逐渐升高(以第一天alp阳性表达量作为对照)，说明hmscs向成骨细胞分化(如图12所示)；茜素红染色，颗粒凝胶被染成红色(如图13所示)。由此可知，载细胞颗粒凝胶中的干细胞维持良好的生物学功能。此外，通过对比培养板(tcp)块状凝胶(bulkgel)以及颗粒凝胶(cinmg)培养3天和7天后的茜素红染色。可以发现颗粒凝胶(cinmg)中的hmscs较早出现成骨分化(如图14所示)。[0093]2.载细胞微凝胶的动物实验[0094]建立sd大鼠颅顶骨缺损(直径8mm)的模型，填充实施例1制备的载细胞微凝胶，分别在4、8和12周后处死sd大鼠取颅骨，4％福尔马林固定48h，70％乙醇保存。然后对颅骨进行micro-ct，以定量大鼠颅骨中的新骨形成，并切片进行h&e染色。所有颅骨均使用19μm分辨率的micro-ct扫描仪(80kv/100μa)进行扫描。使用相关体积重建软件重建ct图像。两个小孔之间的髓腔被确定为感兴趣体积(voi)。根据setfilter的阈值分别测定骨小梁体积(tbv)和骨髓体积(bmv)。计算骨小梁体积与组织体积(rbv)的比值为[0095][0096]单位长度切片中骨小梁数(tn)为[0097][0098]骨小梁结构之间平均距离的骨小梁间距(ts)计算公式为：[0099][0100]其中，根据软件设置获得小梁厚度。[0101]建立了sd大鼠颅顶骨缺损(直径8mm)的模型检测载细胞凝胶颗粒支架的体内生物活性。在材料植入4周，8周和12周后，进行micro-ct分析和组织学分析，通过micro-ct扫描并重建颅顶骨的三维模型，显示感兴趣体积内的放射不透性区域(图15a)。在材料植入4周，8周和12周后，可以观察到骨髓腔内新骨形成情况。载msc颗粒凝胶(cinmg组)处理的缺损形成的新骨数量最多，当植入材料8周时，rbv值为0.29±0.099。而空颗粒凝胶(mg组)和空白组具有较少的新骨生成(图15b)。tn和ts值分别代表新生骨的数量和密度，载msc颗粒凝胶中，tn与rbv值的变化趋势一致。cinmg组的tn值明显高于其他三组，ts值明显低于其他三组(图15c和d)。此外，通过h&e染色分析可以看出，cinmg组处理的颅骨缺损处，随着植入时间的延长，新生骨的量会增加(图16)。而对照组很难观察到新生骨的染色，bg组和mg组等到植入12周后才能观察到新生骨染色。以上结果表明在体内，cinmg具有更快促进骨生成的效果。[0102]实施例6[0103]1.微凝胶颗粒制备：[0104]将algma、gelma和lap溶于蒸馏水中，制成含有2％(w/v)algma、2.5％(w/v)gelma和0.1％(w/v)lap的水相。将0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂溶于电子氟化液7100制成油相。使用高速搅拌器(搅拌杆型号为s18n-19g)在8000rpm下搅拌油相，同时用注射器以油相与水相10∶1的比例(v/v)滴加水相于油相中，滴加完后持续搅拌1min，之后紫外光照(功率：100％、波长355nm)2min使其交联成球。离心去除油相，使用1h，1h，2h，2h-全氟-1-辛醇(pfo)清洗除去凝胶微球表面的表面活性剂，并离心清洗除去pfo及剩余油相，之后将凝胶微球重悬于蒸馏水。[0105]2.微凝胶颗粒的密堆积及3d打印：[0106]使用抽滤泵进行抽滤，并将重悬于水的凝胶微球通过滴管逐滴滴加于滤膜上，抽滤结束后，将凝胶微球收集于注射器内得到密堆积的凝胶微球，并对抽滤后的凝胶微球进行打印测试，结果如图17所示，可以看出打印获得相对稳定性的结构。[0107]3.微凝胶与细胞共混作为墨水打印生物结构及生物学评价：[0108]将制备得到的密堆积凝胶微球，使用含10％(v/v)双抗的dmem培养基浸泡24小时。之后在无菌操作台内抽滤，使凝胶微球再次密堆积，装于螺口注射器内。将培养瓶中的3t3细胞使用胰酶消化，消化完成后加入适量培养基，吸入15ml离心管中，离心去除上清液。使用血球计数板进行细胞计数。计数完成后将所需细胞，重悬于100μl培养基中。将密堆积凝胶微球装于螺口注射器中，重悬好的细胞装于螺口注射器中，两个注射器以转接头相连，相互推拉使细胞与密堆积凝胶微球混匀。1ml密堆积凝胶微球接种5×106个细胞。将接种好细胞的密堆积凝胶微球进行打印测试。之后加入3t3培养基，在含5％co2的细胞培养箱中培养。[0109]通过使用死活荧光染色(live/deadassay)进行考察打印的生物相容性。在微凝胶悬浮液中加入2mm钙黄绿素(绿色荧光染料标记活细胞)和4mm碘化丙啶(红色荧光染料标记死细胞)，孵育20分钟后使用激光共聚焦扫描显微镜观察，结果如图18所示，细胞存活率达85.3％，表明该方法制备的细胞微凝胶保持细胞处于较高的活性。[0110]实施例7[0111]微凝胶作为墨水用于喷墨打印，采用实施例1中的方法制备大量的30μm微凝胶，将该微凝胶以9×105个/ml的浓度，进行喷墨打印，可得如图19所示的打印图案。由此可知，实施例1中的方法制备的微凝胶墨水能够满足生物3d打印根据数字模型提供的空间指令精确定位，微凝胶简单快速且可控制地扩展为复杂的3d微结构，而无需使用额外的工具或模具；能够借助3d打印技术制造单细胞精度、高细胞密度和机械稳定的组织构建体，完全符合生物墨水(载单细胞的微凝胶)需要具有相应的打印特性(自组装、剪切变稀、自修复)，而且能够保证微凝胶中细胞的生物活性，并能发挥功能作用。[0112]实施例8[0113]采用实施例1中的方法大量制备载干细胞的海藻酸。使用抽滤泵进行抽滤，并将重悬于水的凝胶微球通过滴管逐滴滴加于滤膜上，抽滤结束后，将凝胶微球收集于注射器内得到密堆积的凝胶微球，并对抽滤后的凝胶微球进行可注射材料的微创手术开展组织修复。[0114]使用糖尿病sd大鼠全层皮肤创伤模型来证明使用载干细胞微凝胶作为组织再生的可注射填充物的可行性。植入后第7天，分别填充载干细胞的微凝胶和细胞/微凝胶混合物，伤口闭合率分别为40.89±4.10％和46.52±3.63％，而裸微凝胶治疗组伤口闭合率仅为17.29±5.18％，对照组为29.86±5.02％(图20a和b)，一周后，载细胞微凝胶和细胞/微凝胶混合物处理的创面愈合速度明显快于阴性对照组和裸微凝胶处理组。这表明局部引入干细胞微凝胶可以加速伤口愈合。我们进行组织学苏木精-伊红(h&e)染色，以研究不同处理的再生能力(图20c)，显示不同处理1周后创面愈合，肉芽组织生长。上皮间隙测量的结果显示出与伤口闭合相似的趋势(图20d)。颗粒组织厚度的进一步量化证实了伤口愈合的质量，其中新形成的厚颗粒组织表明皮肤再生更好。我们观察到，含有载干细胞的微凝胶组比细胞/微凝胶混合物组(340.6±61.2μm)和对照组(435.1±35.1μm)生成更多的颗粒组织(厚度763.7±56.4μm)(图20e)。与其他组相比，用细胞/微凝胶混合物处理的伤口处观察到大量cd3阳性t细胞(图20f和20g)，这很可能是由于暴露的同种异体骨髓间充质干细胞引起的强免疫原性所致。相比之下，引入载干细胞微凝胶后，t细胞和巨噬细胞的表达量明显减少(f4/80染色)，这可归因于包裹的同种异体干细胞的免疫调节能力以及水凝胶涂层对宿主免疫清除的屏蔽作用。总的来说，这些结果表明载干细胞的微凝胶具有通过免疫调节促进伤口愈合的能力。[0115]实施例9[0116]将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)，1wt％algma(甲基丙烯酰化海藻酸钠)和2wt％hama(甲基丙烯酸酰化透明质酸钠)前体混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以用金属离子进行交联稳定。[0117]实施例10[0118]将1wt％algnb(邻硝基苄醇基团修饰海藻酸钠)，2.5wt％gelma(甲基丙烯酸酰化明胶)和将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，395nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以用金属离子进行交联稳定。[0119]实施例11[0120]将1wt％algma-cd(环糊精基团修饰的甲基丙烯酸化海藻酸钠)，2.5wt％hama-ad(金刚烷基团修饰的甲基丙烯酸化透明质酸钠)和将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以通过主客体相互作用进行稳定，为了提高强度还可继续引入金属离子进行交联反应。[0121]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，特别涉及一种载细胞微凝胶组装的组织工程支架及其制备方法和在骨修复领域的应用。
背景技术：
：：2.针对功能丧失或缺陷的人体组织/器官的修复问题，临床上传统解决方法仍依赖于组织、器官移植。然而，捐献的人体组织短缺且存在传染性疾病潜在风险，引发社会伦理道德问题，使得组织/器官移植面临诸多挑战。组织工程技术提供工程化的组织给器官修复重建带来了希望，并有望缓解器官捐献者短缺的实际问题。目前，组织工程技术已经实现了包括皮肤、软骨等组织的修复并进入临床应用。然而，复杂结构，三维空间和多细胞精确分布的工程化组织或器官尚未成功构建。组织工程有两种构建方式——“自上而下”和“自下而上”的方法。“自上而下”方法是利用大尺寸的块体支架材料来固载细胞或因子，构建工程化的类组织体，以期实现组织/器官的修复和重建。然而这一设计方式获得的组织工程化类组织存在诸多瓶颈问题：(1)作为固载细胞的块体水凝胶尽管富含水和具有多孔性，但纳米尺度的致密孔隙使得细胞间信号交换的活性蛋白或大分子、营养物质、以及细胞排泄物难以有效传输，物质扩散效率低下，最终导致块体支架内部的细胞趋于凋亡，难以正常繁殖并组织化；(2)由于块体材料内部药物分子的扩散效率低下且难以控制，难以实现药物因子的可控释放；(3)对于不规则形状的组织缺损修复手术操作困难，无法实现可注射、可塑性，(4)在构建复杂组织结构过程中，难以在三维支架上精确固载不同种类的细胞等(jiangw，lim，chenz，etal.cell-ladenmicrofluidicmicrogelsfortissueregeneration[j].labonachip，2016，16(23)：4482-4506.)。[0003]人体组织/器官是由不同种类的细胞组成的微小功能单元组装而成。“自下而上”的组织工程构建方式是以微观尺度层面上构建组织工程的模块，然后通过微观模块的组装获得工程化组织体的方法。而获得这些微小的模块需要先进的微加工技术和实现模块组装的技术。微加工技术包括光刻蚀技术、微模塑技术、微流控液滴技术等(dalyac，rileyl，segurat，etal.hydrogelmicroparticlesforbiomedicalapplications[j].naturereviewsmaterials，2020，5(1)：20-43.)。相对与大尺寸支架材料而言，因为凝胶微球有利于物质交换并可对细胞外微环境形成更精确控制，凝胶微球更有利于细胞的固载包埋和三维培养。但现有技术存在的问题：尺寸难以达到单细胞水平，通量不够高，方法的生物相容性问题和模块组装仍是难题(dubayr，urbanjn，darlingem.single-cellmicrogelsfordiagnosticsandtherapeutics[j].advancedfunctionalmaterials，2021：2009946.)。[0004]目前，已有一些利用凝胶微球进行组织或器官仿生构建的报道，如，fernandezjg等人把一个固体表面作为模板来引导凝胶微球的组装，但无法实现连续批量化生产(fernandezjg，khademhosseiniali.micro-masonry：constructionof3dstructuresbymicroscaleself-assembly[j].advancedmaterials，2010，22(23)：2538-2541.)；khademhosseiniali课题组研究报道了通过光刻蚀技术制备凝胶微球，然后利用凝胶微球亲水驱动引发组装，组装体通过二次光交联来稳定结构，然而这种组装方法形成的组装体是无序的且无法形成复杂的组织结构(duy，loe，alis，etal.directedassemblyofcell-ladenmicrogelsforfabricationof3dtissueconstructs[j].proceedingsofthenationalacademyofsciences，2008，105(28)：9522-9527.b)；xuf课题组通过光刻蚀技术制备凝胶微球，采用磁力和声波辅助组装凝胶微球，或采用带正负电荷的凝胶微球组装二维或三维结构，这一方法也无法用于复杂组织结构的组装(xuf，finleytd，turkaydinm，etal.theassemblyofcell-encapsulatingmicroscalehydrogelsusingacousticwaves.biomaterials，2011，32：7847-7855)。donaldr.griffin等人提出了一种用于生物医学领域的可控自退火微凝胶颗粒的制备制备方法，作为细胞迁移支架，用于治疗和密封伤口，但不能批量化或高通量制备凝胶颗粒并且未能实现凝胶颗粒的可控组装。但是这些组装方法无法形成复杂的组织结构，尚不能精确分布不同种类的细胞(griffindr，weaverwm，scumpiapo，etal.acceleratedwoundhealingbyinjectablemicroporousgelscaffoldsassembledfromannealedbuildingblocks[j].naturematerials，2015，14(7)：737-744.)。随着3d打印技术的兴起，3d生物打印技术制备组织工程支架的方法受到极大关注。3d生物打印技术具有个性化制作、高精度和高分辨率的优点，可以在墨水中加入细胞进行打印，实现细胞的分层有序放置。凝胶微球由于其具有良好的生物相容性、自修复能力等性质可作为生物墨水用于3d生物打印(highleycb，songkh，dalyac，etal.jammedmicrogelinksfor3dprintingapplications[j].advancedscience，2019，6(1)：1801076.)。但是包裹生物活性物质的微凝胶作为生物墨水用于生物3d打印还存在诸多挑战：(1)载单细胞的微凝胶作为生物墨水可打印性及作为类组织生物功能性验证尚存在空白；(2)凝胶微球中细胞活性及功能性仍存在挑战。技术实现要素：[0005]本发明目的在于提供一种载单细胞微凝胶生物墨水基于3d打印技术制造类组织的方法及其在组织修复领域的应用。[0006]本发明首先将选用甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物材料采用液滴微流控技术制备载单细胞的凝胶微球，作为生物墨水；采用生物打印的方式进行载细胞的的凝胶微球组装(打印)。本发明利用生物打印方式能够实现三维复杂结构的构建，提高制备效率、保证细胞活性，有利于损伤组织的快速修复；其中载干细胞的微凝胶打印形成的类组织进行成骨诱导具有较快的成骨分化活性，大大缩短成骨时间，为骨再生医学应用奠定基础。[0007]本发明采用如下技术方案来实现。[0008]一种生物3d打印的方法，包括以下几个步骤：[0009](1)将甲基丙烯酸修饰的海藻酸(algma)与另一种聚合物材料通入集成微流控芯片，制备载细胞的微液滴，引发微液滴中所述材料交联，获得载细胞的的凝胶微球；[0010](2)将步骤(1)所述的载细胞的微凝胶作为墨水，经密堆积后，利用生物打印的方式实现载生物活性物质的微凝胶的精确排布，所述的凝胶微球通过钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、镍或镓离子交联完成组装。[0011]上文所述的技术方案中，所述另一种聚合物材料为天然聚合物或合成聚合物的一种或者二种以上的组合，所述天然聚合物包括细胞外基质、海藻酸、海藻酸盐、海藻酸盐衍生物、透明质酸、壳聚糖、琼脂糖、葡聚糖；蛋白类胶原、明胶、明胶衍生物、纤维蛋白、琼脂、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、层连接蛋白；所述合成聚合物包括聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乙烯醇、、聚氧化乙烯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚氨基酸、聚丙烯酰胺、普朗尼克。[0012]上文所述的技术方案中，所述甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物可以紫外光交联反应，以实现步骤(1)中微凝胶的凝胶化，进一步实现步骤(2)所述的凝胶微球颗粒之间的钙交联反应。[0013]上文所述的技术方案中，用于步骤(1)中微凝胶的甲基丙烯酸修饰的海藻酸与另一种聚合物凝胶化交联基团的修饰，例如，将材料修饰为具有紫外光引发聚合反应基团(如甲基丙烯酸酯基，巯基/丙烯酸酯基，四嗪类/丙烯酸酯基)，亦或能与材料本身自带基团反应的基团(如邻硝基苄醇基)紫外光照后能产生与氨基反应的醛基，使材料凝胶化；或修饰巯基和马来酰亚胺，叠氮基和环辛炔基，醛基和氨基，使材料具有自发耦合反应凝胶化；或将材料修饰上主客体反应基团(如环糊精和金刚烷)使得材料发生凝胶化；或通过温度使得凝胶化(如明胶在低温下形成凝胶)；或通过加入交联剂(如，金属离子、连接蛋白多肽、二硫苏糖醇dtt)实现基团交联使得材料凝胶化。[0014]上文所述的技术方案中，所述的载细胞微凝胶再次钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、铜、镍或镓离子交联，能实现凝胶微球颗粒之间的稳定，再次引发交联的方式也可采用其他方式，也包括：自发的基团之间的化学反应，亲核基团(硫醇、胺、氨氧基)的迈克尔加成反应、点击化学反应；通过光或温度引发基团之间的化学反应；通过加入交联剂，如：蛋白多肽、金属离子等实现基团交联。[0015]上文所述的技术方案中，具体而言，步骤(1)中所述的被包埋活体细胞是本领域技术人员可以根据实施目的的不同进行选择；[0016]所述活体细胞一般为原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种或二种以上的组合；[0017]上文所述的技术方案中，利用集成微流控芯片制备载细胞的微液滴的过程，主要包括如下步骤：[0018](1)配制溶液[0019]①甲基丙烯酸修饰的海藻酸(algma)与另一种聚合物溶解于水或pbs或培养基中制备溶液，随后加入交联反应引发剂，得到水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第一相水相溶液，另一相将细胞加入上述溶液中得水凝胶预聚体溶液，作为制备油包水乳液体系的第二相水相溶液；[0020]②将含有非离子表面活性剂的矿物油(石蜡/二甲基硅油)作为油包水乳液体系的油相；或含氟化表面活性剂的氟化油，作为油包水乳液体系的油相。[0021]上文所述的技术方案中，所述集成微流控芯片的微流道采用单通道或多通道，微流控芯片具有流体聚焦结构、t形混合结构、同向流动型或十字结构的微流通道，具有至少4相液体输入口，以及乳化通道和输出通道。所述的4相液体输入口包括：第一水相溶液输入口，第二水相溶液输入口，第一重油相输入口；且所述微通道内壁表面进行疏水处理。[0022]上文所述的技术方案中，所述微流控技术是将所述多重流体组成的第一水相溶液、第二水相溶液、第一重油相通过微量泵或微注射器分别以第一流速为5-2000μl/h、第二流速为5-2000μl/h、第三流速为200-20000μl/h，流速输送至微流控芯片装置的相应微通道中，形成单分散的水/油/水双乳液。[0023]上文所述的技术方案中，所述单通道微流控芯片：[0024]优选的第一流速为10-500μl/h，更优选20-200μl/h；[0025]优选的第二流速为10-500μl/h，更优选20-200μl/h；[0026]优选的第三流速为500-3000μl/h，更优选800-2000μl/h；[0027]上文所述的技术方案中，所述多通道微流控芯片：各通道优先流速及更优选流速为单通道的倍增，例如，两通道微流控芯片为单通道流速的2倍，三通道微流控芯片为单通道的流速的3倍，以此类推。[0028]上文所述的技术方案中，具体而言，多通道微流控能够提高包埋通量，缩短包埋时间至0.5-6h，保证载生物活性物质活性，有利于进一步实施生物打印。[0029]上文所述的技术方案中，具体而言，所述第一相和第二相水相流速总和与第一重油相的流速比为1∶0.01～1之间，优选1∶0.05～0.5；第一重油相流速和第二重油相流速比为1∶0.1～50，优选1∶0.5～10。[0030]上文所述的技术方案中，所述交联反应引发剂包括①配位反应引发剂(选自钙-乙二胺四乙酸的螯合物水溶液、钙-氨三乙酸的螯合物水溶液、碳酸钙纳米颗粒、硫酸钙纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒中一种或几种的组合)，所述引发剂的终浓度以钙含量记为10-1000mm；②具有良好生物相容性的光化学反应引发剂(选自2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，i2959)、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(lithiumphenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，lap)、偶氮引发剂va086(2，2′‑(diazene-1，2-diyl)bis(n-(2-hydroxyethyl)-2-methylpropanamide)、安息香甲基醚(2-methoxy-2-phenyl-acetophenon)、伊红y(eosiny)中一种或几种的组合)，光照波长为365nm-780nm，光照时间0.00001s-600s；③温度介导的交联剂，交联温度为0-40℃；④酶催化反应所用酶(选自歧化酶、凝血酶、谷氨酰胺转氨酶中一种)。[0031]上文所述的技术方案中，所述微流控技术制备得到的载细胞微凝胶产品直径为20～500μm；粒径分布的离散系数在0.01～20％，本发明方法制备的载细胞微凝胶从微流芯片制备成油包水乳液分散在油相中，凝胶化后，经输出口到注入收集水性溶液并自发分散在水性溶液中，载细胞微凝胶在乳液中停留的时间在1～60秒，保证其活性。[0032]上文所述的技术方案中，步骤(2)是将步骤(1)制备的载细胞微凝胶作为可打印的生物墨水，借助三维(3d)移动平台，通过按需逐点打印和层层叠加的方式，载细胞凝胶微球可以同时快速交联和固化，达到精确构建三维复杂结构的目的。[0033]上文所述的技术方案中，将所述的用于生物打印的载细胞微凝胶进行密堆积，置于打印容器中，进行生物打印。其中，载细胞微凝胶密堆积方法可以是离心，过滤，以及抽滤等化工操作单元。[0034]本发明另一方面提供一种生产功能组织的方法，主要包括：以载细胞凝胶微球通过上述生物3d打印的方法打印获得功能组织，检测分化或成熟的一种或多种标志物；或检测在功能组织中预期的分化或成熟的一种或多种标志物的表达水平。[0035]本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：[0036](1)本发明功能基团修饰的海藻酸与另一种聚合物材料，可以借助微乳液方法或微流控液滴技术固载细胞，维持了细胞在微凝胶内较高的活性和功能。[0037](2)本专利开发的凝胶微球组装支架材料能显著提升材料内部物质传输效率。传统的整体连续结构的块状水凝胶材料虽然具有高孔隙率，但凝胶网络孔隙尺寸(meshsize)通常小于100nm，因此物质的扩散和传输效率显然比较低；本专利开发的由凝胶微球颗粒组装而成的水凝胶材料，由于凝胶微球颗粒的形态和堆积密度受限，因此在保持足够强度支撑和材料完整结构的同时具有更高的空隙率和百微米尺度的空隙尺寸，因此具有更高的物质传输效率。实施例4中的附图10对比了传统的块状水凝胶和本专利开发的微球组装水凝胶，凝胶微球组装支架材料注射液瞬间就会扩散整个结构。然而，传统的块状水凝胶10分钟后还不能扩散到整个结构中。[0038](3)本专利技术所述的组织工程支架是由载细胞微球组装而成，微球尺寸通过微流控液滴技术可以实现微球尺寸控制和固载细胞数量控制，最小可控制在固载单细胞，且微球尺寸在10-200um直径范围。以这些载细胞微球为基本单元组装而成具有宏观尺寸的细胞化组织工程支架，此时，支架中所有细胞在空间上被包裹于＜200um直径的凝胶球中，这样的结构较传统的均匀包裹于块体凝胶中的细胞化支架材料具有更好的物质(细胞生存所需的养分和细胞分泌的废物)传输，不仅显著提升细胞的长期存活率，且显著增加细胞的代谢活力，因此从功能性上也有显著的优势。[0039](4)该方法构建的类组织，支持干细胞发生快速成骨分化，3天即可矿化，有利于骨再生及修复领域。[0040](5)现有技术多数为在载多细胞的微凝胶或者微凝胶表面培养细胞，均存在结构不稳定、容易粘结等问题，本发明的载单细胞微凝胶经过紫外交联和钙、钡、锶、镁、铁、锌、铝、铜、镍或镓离子交联完成组装，能够获得结构稳定的组织构建块。离子的作用：ca离子具有促进成骨、sr离子有抑制破骨、cu诱导血管化，使得材料具有多功能性。[0041](6)本发明通过生物打印技术将载细胞微凝胶精确排布，微凝胶之间可以发生物理或化学交联固定在一起。其中，载细胞凝胶微球可被用作组织构建块，以创建三维(3d)组织和器官，形成单细胞精度、高细胞密度仿生组织微单元。当微球尺寸小于50μm时，细胞密度不低于1*106个/cm3。[0042](7)本发明涉及的凝胶微球颗粒中也可以包封生物活性物质，进行活性物质的缓慢释放，用于免疫调控，促进伤口愈合。[0043](8)本发明采用的技术能够有效保证细胞活性；且利用生物打印方式能够实现三维复杂结构的构建，在再生医学领域具有良好的应用前景。[0044](9)本发明涉及的凝胶微球颗粒具有两种应用方式，可注射颗粒水凝胶，另一种是打印支架，前者用于微创手术、后者用于定制化组织填充支架。附图说明[0045]为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。[0046]图1为集成微流控芯片制备载细胞微凝胶的连续加工过程图。[0047]图2为本发明所使用的集成化微流控芯片的整体结构示意图(以集成16个生产单元为例)；其中a、c为液相分配基片；b为液相生产基片；1液相输入端口、2阻力控制单元、3输出端口、4输入端口、5液相输入通道、6乳化通道、7输出通道、8局部阻力控制单元、9清洗通道、10清洗相输入端口、11产品输出端口。[0048]图3为集成微流控芯片制备载细胞微凝胶的连续加工过程中芯片内不同位置实际液相流动状况图。其中a实际生产过程中液滴生产单元内液滴形成图；b为生产单元的液相流动状态；c为收集通道的液相流动状态。[0049]图4为集成微流控芯片生产液滴和微凝胶表征，(a)微流控芯片生产率对比图像，其中，1×表示1个生产单元，32×表示32个生产单元；(b)集成微流控技术制备的微液滴图像。[0050]图5为载细胞微凝胶中细胞分布遵从泊松分布。[0051]图6为密堆积微凝胶的剪切变稀(a)、自愈合性能(b)和可挤出性(c：a微凝胶墨水可挤出性和b纯水凝胶预聚溶液挤出效果对比)。[0052]图7为微凝胶作为生物墨水的生物3d打印结构图像。[0053]图8为二次交联的前后的微凝胶墨水挤出稳定性对比图。[0054]图9为剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性。[0055]图10为颗粒凝胶和块状凝胶的物质扩散能力。[0056]图11为颗粒凝胶中的支架中hmscs的活性及增殖，(a)在颗粒凝胶或块状水凝胶中hmscs的存活率和(b)hmscs的dna含量变化。[0057]图12为颗粒凝胶中hmscs不同时间alp活性测定。[0058]图13为颗粒凝胶中hmscs不同时间茜素红染色。[0059]图14为hmscs在培养板(tcp)、块状凝胶(bulkgel)以及颗粒凝胶(cinmg)培养3天和7天后的茜素红染色。[0060]图15为植入4，8和12周后，对sd大鼠颅顶骨的二维和三维重建micro-ct图像(a)，绿色代表髓腔内新形成的骨组织；(b)骨体积与组织体积之比(rbv)；(c)骨小梁数(tn)；(d)小梁间距(ts)；其中，cinmg：缺损填充载细胞颗粒微凝胶(细胞微凝胶首先培养3天然后成骨诱导7天后植入体内)，mg：缺损填充空颗粒微凝胶(与cinmg组处理方式相同)，bg：缺损填充块体凝胶(与cinmg组处理方式相同)，control：缺损无任何填充物(不进行处理)。[0061]图16植入4、8、12周后，sd大鼠颅骨缺损骨形成的h&e染色图。[0062]图17为用alg-ma和gelma制备得到的密堆积凝胶微球进行挤出打印后图片(a)；(b)挤出打印后滴加250mmcacl2溶液二次交联后图片；(c)二次交联后显微镜下4倍图片；(d)荧光染色后显微镜下4倍图片；(e)荧光染色后显微镜下4倍荧光图片；(f)荧光染色后显微镜下10倍荧光图片。[0063]图18为死活细胞荧光染色照片。[0064]图19为绿色荧光标记的海藻酸钠微球打印排列成的图案。[0065]图20为海藻酸盐微凝胶包裹间充质干细胞的皮肤创面愈合能力，(a)治疗7天后创面愈合的代表性图像及创面愈合的痕迹，(b)糖尿病大鼠创面愈合数据(n＝6)；(c)组织切片h&e染色图，蓝色箭头表示微凝胶周围浸润的毛细血管，红色箭头表示微凝胶中保留的间充质干细胞，4×图像的比例尺为500μm，63×图像的比例尺为20μm；(d)上皮间隙的定量；(e)组织切片的h&e染色肉芽组织的厚度；不同处理后伤口cd3阳性(t细胞：红色)和f4/80阳性(巨噬细胞：绿色)的代表性免疫荧光染色(f)和定量分析(g)，dapi(蓝色)染色示细胞核，比例尺为20μm。具体实施方式[0066]以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。[0067]本发明使用的集成化微流控芯片即发明专利(cn112275336a)公开的集成化微流控芯片，其基片上至少设置有2个液滴生产单元，并同时包含有多个液相输入模块以及一个清洗输出模块，液相输入模块根据其内部输送的液相种类可分为分散相分配单元、连续相分配单元，且其分类仅与其内部液相种类有关，与芯片内相对位置无关，因而实际生产中通道内液相输入位置可随意调换，达到根据实际需求变换液滴生产方式的目的，提高芯片使用的灵活性。多个分配模块必包含一个连续相分配模块以及一个或多个分散相分配模块，且各个分散相分配模块的相对位置同样不固定；所述液相输入模块均带有各自的进样端口，所述清洗输出模块同时带有清洗相输入通道以及产品输出通道，每个液滴生产单元均与所有液相输入模块以及清洗通道相连；其中，液相输入模块最少含有两个，如有特殊微凝胶制备需求，可额外添加一个以上的包含液相输入模块的基片及其对应的输送管路；连续相、分散相、清洗相采用注射泵、蠕动泵、气压泵、液压泵中的一种或多种方式注入。[0068]根据附图2，在向基片a中的液相输入端口1(a-1)泵入液相后，液相经由液相输入模块内的阻力控制单元2(a-2)控制后，液相从液相输入模块输出端口3输出后(a-3)，穿过基片a注入基片b上的各液滴生产单元输入端口4(b-4)，进而注入液滴生产单元的乳化通道6(b-6)；同理，向其他基片(例：c)液相输入端口1(c-1)注入的液相也以等流量经阻力控制单元2和输出端口3(c-2、c-3)注入基片b上的各液滴生产单元；其中，含细胞或其他搭载相的水凝胶预聚物相中的液相在阻力分配结构控制下能够一直保持较高流速，从而保证了搭载相能够在其中稳定流动，不发生堵塞。[0069]液滴生产单元乳化通道6内(b-6)，不相容液相间经过管路交叉口后以恒定流量相互融合，剪切，实现粒径分布稳定的液滴的乳化，然后经由油相或外源的交联刺激诱发微凝胶的交联固化，实现细胞或其他搭载相的包埋。[0070]液滴生产单元下游，微颗粒经过一段距离标准通道即输出通道7(b-7)后进入局部阻力控制单元8(b-8)，以扩大腔为例，由于扩大腔尺寸与普通通道有一定的尺寸差异，此时微凝胶舒张为圆球状，并进一步固化定型，同时在扩大腔内继续迁移；同时基于其尺寸限制，液相流速仍然保持在较高水平，因此可以避免微凝胶在通道内的堵塞，保持流到畅通。[0071]清洗通道9(b-9)呈环状单路布置，各生产液滴单元下游的扩大腔等距离排布于清洗通道内环。清洗相由清洗相输入端口10(b-10)直接泵入，在清洗通道中与扩大腔排出的两相乳液接触，经由清洗剂或表面活性剂自身特性实现破乳以及水凝胶分离。同时清洗相与排出乳液共通组成的多相流量仍然保持了清洗通道内的流速，因而即使清洗通道尺寸远大于标准通道以及扩大腔，其流速仍然可以保证整个清洗槽内的畅通。更进一步的，基于清洗通道较大的尺寸，其内部流阻远小于标准通道，因而其对各个不同液滴生产单元下游的阻力影响可以忽略，最终由产品输出通道11(b-11)收集得含产品的两相液相。[0072]本芯片的基片a、b、c的材质可以为玻璃、硅、金属、聚合物中的一种或多种的混合物，其中聚合物可以为pdms(聚二甲基硅氧烷)、pmma(聚甲基丙烯酸甲酯)、pc(工程塑料)、coc(环烯烃共聚物)、pet(聚对苯二甲酸乙二酯)中的一种或多种，基片间采用热压、胶粘、激光焊接、超声焊接、螺栓对接、阳极键合、等离子键合中的一种或多种方式封装。[0073]本发明以集成了32个生产单元的多层结构的集成化微流控芯片(微流控芯片的具体设计方法见cn112275336a)制备搭载msc细胞的微凝胶，可以持续稳定的制备多种水凝胶材料的载细胞微凝胶颗粒，并可以通过一个连续的加工过程直接获得载活性物质微凝胶如图1所示。[0074]实施例1[0075]1.细胞培养：[0076]以人骨髓源性干细胞(hmscs)培养为例，增值培养基由α-mem(α-minimumeagle’smedium)，10％胎牛血清(fbs，gibco)组成，培养条件37℃，95％相对湿度与5％co2。细胞培养基每三天后更换。使用前，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗，置于胰蛋白酶/edta溶液5分钟，悬浮于培养基中备用。[0077]2.载细胞微凝胶颗粒制备：[0078]将0.1wt％lap(苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)，1wt％algma(甲基丙烯酰化海藻酸钠)和2.5wt％gelma(甲基丙烯酸酰化明胶)前体混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。[0079]调整至所有通道稳定生成液滴后，芯片内液滴生产状况如图3所示。如图4a所示，与单通道芯片相比，由该集成芯片30min可得较高产量的微液滴。这些微液滴结构均一(如图4b所示)。如图5所示将该集成芯片应用于载细胞微凝胶的加工制备，载细胞微凝胶尺寸为86.78±4.33μm，载单细胞的微凝胶占36.18±1.09％，空微凝胶占43.83±5.57％可以发现载细胞微凝胶中细胞分布遵从泊松分布。[0080]实施例2[0081]将实施例1中制备的载细胞微凝胶进行离心(1000rpm)收集，然后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积，此时微凝胶的干重为4wt％。然后，对密堆积的微凝胶进行了流变学测试，结果表明该密堆积微凝胶具有剪切变稀的性质，同时具备自修复的性能(如图6a和6b所示)，微凝胶的流变特性满足作为生物墨水可挤出打印的性质。图6c展示了微凝胶作为墨水可挤出的优势。借助3d打印设备，将微凝胶作为生物打印墨水得到不同的组织结构，并且能够进行仿生组织打印，将有利于组织构建(如图7所示)。以上结果说明微凝胶具有可打印性质。[0082]实施例3[0083]实施例2中进行密堆积微凝胶打印后，为了保持密度结构稳定性，将微凝胶通过注射器挤出并进行稳定性测试，二次交联前由注射器挤出的微丝两个横梁间隔变大时，发生弯曲(如图8a所示)，二次交联后(钙离子交联后)，密堆积微凝胶具有结构稳定性(如图8b所示)。进一步测试了恒定频率(1hz)的应变扫描来表示剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性(图9a)。可以发现交联前后，微凝胶在不相同的应变幅值表现出交叉。在交叉点处的模量(g′＝g″)，交联后的微凝胶明显高于未交联的微凝胶。以上结果表明在低应变区间内，交联后的微凝胶具有更高的剪切模量。未交联的微凝胶的剪切模量比交联后的小一个数量级。此外，在1％应变条件下，交联前后的微凝胶在小于10hz的剪切频率下表现为固体材料，而这可能由于密堆积的微凝胶钙离子交联后具有一定的空间稳定性(图9b)。[0084]实施例4[0085]实施例2中进行密堆积微凝胶打印后，为了保持密度结构稳定性，进行交联后(钙离子交联后)，密堆积微凝胶具有结构稳定性(如图8b所示)。进一步测试了恒定频率(1hz)的应变扫描来表示剪切模量在剪切应变响应下的剪切屈服特性(图9a)。可以发现交联前后，微凝胶在不相同的应变幅值表现出交叉。在交叉点处的模量(g′＝g″)，交联后的微凝胶明显高于未交联的微凝胶。以上结果表明在低应变区间内，交联后的微凝胶具有更高的剪切模量。未交联的微凝胶的剪切模量比交联后的小一个数量级。此外，在1％应变条件下，交联前后的微凝胶在小于10hz的剪切频率下表现为固体材料，而这可能由于密堆积的微凝胶钙离子交联后具有一定的空间稳定性(图9b)。[0086]将实施例2中得到的密堆积微凝胶放到模具成型，然后用钙离子进行交联。用相同模具直接将聚合物预聚液成型得到块体凝胶(所用聚合物与微凝胶制备相同组分及比例)。为了方便观察注射含有红色染料的去离子水，从图10可以看出微凝胶组成的颗粒胶注射瞬间就会扩散整个结构。然而，块体凝胶10分钟后还不能扩散到整个结构中。为了验证微凝胶打印结构对细胞的影响。将含有hmscs的微凝胶打印在6孔细胞培养板上，并在生长培养基中培养。分别在培养1、3、5、7、10和14天后，使用live/试剂盒(invitrogen，china)测定微凝胶墨水中hmscs的活力。采用dsdnahs检测试剂盒(yeasen，china)检测dna含量。实施例1制备的微凝胶生物墨水与块状水凝胶中细胞存活率相比，可以发现颗粒凝胶中的细胞存活率较高(如图11a所示)。此外，dna含量检测显示颗粒凝胶中细胞增殖增加，而块状水凝胶中细胞dna含量逐渐减少(如图11b所示)，活/死细胞染色证明随着培养时间的增加，支架中的hmscs保持着非常高的存活量。进一步表明，载细胞微凝胶作为生物打印墨水能够保持细胞较高的活性。[0087]实施例5[0088]载细胞微凝胶作为墨水打印的组织结构的生物学评价：[0089]1.载细胞微凝胶中细胞的生物学功能[0090]分别在第7、14和21天进行碱性磷酸酶染色(alpstaining)和茜素红染色(alizarinstaining)。碱性磷酸酶染色采用碱性磷酸酶显色试剂盒。茜素红染色用于证实微凝胶中细胞周围的钙化结节。通过离心(500g，5min)在试管中收集细胞负载的微凝胶，并用dpbs洗涤三次。样品用4％多聚甲醛(pfa)固定20min，然后进行试剂染色。alp染色和茜素红染色后用倒置荧光显微镜观察。采用cellsens软件计数和测量alp阳性细胞和茜素红染色微凝胶的厚度。[0091]为了量化alp活性，使用胶原酶和透明质酸酶以1mg/ml的浓度从微凝胶中释放细胞，然后用裂解缓冲液裂解。离心(300g，5min)后，根据试剂制造商的说明，使用碱性磷酸酶测定试剂盒测量细胞裂解的上清液的alp活性。[0092]对颗粒凝胶中hmscs进行alp染色，结果表明alp阳性表达比例逐渐升高(以第一天alp阳性表达量作为对照)，说明hmscs向成骨细胞分化(如图12所示)；茜素红染色，颗粒凝胶被染成红色(如图13所示)。由此可知，载细胞颗粒凝胶中的干细胞维持良好的生物学功能。此外，通过对比培养板(tcp)块状凝胶(bulkgel)以及颗粒凝胶(cinmg)培养3天和7天后的茜素红染色。可以发现颗粒凝胶(cinmg)中的hmscs较早出现成骨分化(如图14所示)。[0093]2.载细胞微凝胶的动物实验[0094]建立sd大鼠颅顶骨缺损(直径8mm)的模型，填充实施例1制备的载细胞微凝胶，分别在4、8和12周后处死sd大鼠取颅骨，4％福尔马林固定48h，70％乙醇保存。然后对颅骨进行micro-ct，以定量大鼠颅骨中的新骨形成，并切片进行h&e染色。所有颅骨均使用19μm分辨率的micro-ct扫描仪(80kv/100μa)进行扫描。使用相关体积重建软件重建ct图像。两个小孔之间的髓腔被确定为感兴趣体积(voi)。根据setfilter的阈值分别测定骨小梁体积(tbv)和骨髓体积(bmv)。计算骨小梁体积与组织体积(rbv)的比值为[0095][0096]单位长度切片中骨小梁数(tn)为[0097][0098]骨小梁结构之间平均距离的骨小梁间距(ts)计算公式为：[0099][0100]其中，根据软件设置获得小梁厚度。[0101]建立了sd大鼠颅顶骨缺损(直径8mm)的模型检测载细胞凝胶颗粒支架的体内生物活性。在材料植入4周，8周和12周后，进行micro-ct分析和组织学分析，通过micro-ct扫描并重建颅顶骨的三维模型，显示感兴趣体积内的放射不透性区域(图15a)。在材料植入4周，8周和12周后，可以观察到骨髓腔内新骨形成情况。载msc颗粒凝胶(cinmg组)处理的缺损形成的新骨数量最多，当植入材料8周时，rbv值为0.29±0.099。而空颗粒凝胶(mg组)和空白组具有较少的新骨生成(图15b)。tn和ts值分别代表新生骨的数量和密度，载msc颗粒凝胶中，tn与rbv值的变化趋势一致。cinmg组的tn值明显高于其他三组，ts值明显低于其他三组(图15c和d)。此外，通过h&e染色分析可以看出，cinmg组处理的颅骨缺损处，随着植入时间的延长，新生骨的量会增加(图16)。而对照组很难观察到新生骨的染色，bg组和mg组等到植入12周后才能观察到新生骨染色。以上结果表明在体内，cinmg具有更快促进骨生成的效果。[0102]实施例6[0103]1.微凝胶颗粒制备：[0104]将algma、gelma和lap溶于蒸馏水中，制成含有2％(w/v)algma、2.5％(w/v)gelma和0.1％(w/v)lap的水相。将0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂溶于电子氟化液7100制成油相。使用高速搅拌器(搅拌杆型号为s18n-19g)在8000rpm下搅拌油相，同时用注射器以油相与水相10∶1的比例(v/v)滴加水相于油相中，滴加完后持续搅拌1min，之后紫外光照(功率：100％、波长355nm)2min使其交联成球。离心去除油相，使用1h，1h，2h，2h-全氟-1-辛醇(pfo)清洗除去凝胶微球表面的表面活性剂，并离心清洗除去pfo及剩余油相，之后将凝胶微球重悬于蒸馏水。[0105]2.微凝胶颗粒的密堆积及3d打印：[0106]使用抽滤泵进行抽滤，并将重悬于水的凝胶微球通过滴管逐滴滴加于滤膜上，抽滤结束后，将凝胶微球收集于注射器内得到密堆积的凝胶微球，并对抽滤后的凝胶微球进行打印测试，结果如图17所示，可以看出打印获得相对稳定性的结构。[0107]3.微凝胶与细胞共混作为墨水打印生物结构及生物学评价：[0108]将制备得到的密堆积凝胶微球，使用含10％(v/v)双抗的dmem培养基浸泡24小时。之后在无菌操作台内抽滤，使凝胶微球再次密堆积，装于螺口注射器内。将培养瓶中的3t3细胞使用胰酶消化，消化完成后加入适量培养基，吸入15ml离心管中，离心去除上清液。使用血球计数板进行细胞计数。计数完成后将所需细胞，重悬于100μl培养基中。将密堆积凝胶微球装于螺口注射器中，重悬好的细胞装于螺口注射器中，两个注射器以转接头相连，相互推拉使细胞与密堆积凝胶微球混匀。1ml密堆积凝胶微球接种5×106个细胞。将接种好细胞的密堆积凝胶微球进行打印测试。之后加入3t3培养基，在含5％co2的细胞培养箱中培养。[0109]通过使用死活荧光染色(live/deadassay)进行考察打印的生物相容性。在微凝胶悬浮液中加入2mm钙黄绿素(绿色荧光染料标记活细胞)和4mm碘化丙啶(红色荧光染料标记死细胞)，孵育20分钟后使用激光共聚焦扫描显微镜观察，结果如图18所示，细胞存活率达85.3％，表明该方法制备的细胞微凝胶保持细胞处于较高的活性。[0110]实施例7[0111]微凝胶作为墨水用于喷墨打印，采用实施例1中的方法制备大量的30μm微凝胶，将该微凝胶以9×105个/ml的浓度，进行喷墨打印，可得如图19所示的打印图案。由此可知，实施例1中的方法制备的微凝胶墨水能够满足生物3d打印根据数字模型提供的空间指令精确定位，微凝胶简单快速且可控制地扩展为复杂的3d微结构，而无需使用额外的工具或模具；能够借助3d打印技术制造单细胞精度、高细胞密度和机械稳定的组织构建体，完全符合生物墨水(载单细胞的微凝胶)需要具有相应的打印特性(自组装、剪切变稀、自修复)，而且能够保证微凝胶中细胞的生物活性，并能发挥功能作用。[0112]实施例8[0113]采用实施例1中的方法大量制备载干细胞的海藻酸。使用抽滤泵进行抽滤，并将重悬于水的凝胶微球通过滴管逐滴滴加于滤膜上，抽滤结束后，将凝胶微球收集于注射器内得到密堆积的凝胶微球，并对抽滤后的凝胶微球进行可注射材料的微创手术开展组织修复。[0114]使用糖尿病sd大鼠全层皮肤创伤模型来证明使用载干细胞微凝胶作为组织再生的可注射填充物的可行性。植入后第7天，分别填充载干细胞的微凝胶和细胞/微凝胶混合物，伤口闭合率分别为40.89±4.10％和46.52±3.63％，而裸微凝胶治疗组伤口闭合率仅为17.29±5.18％，对照组为29.86±5.02％(图20a和b)，一周后，载细胞微凝胶和细胞/微凝胶混合物处理的创面愈合速度明显快于阴性对照组和裸微凝胶处理组。这表明局部引入干细胞微凝胶可以加速伤口愈合。我们进行组织学苏木精-伊红(h&e)染色，以研究不同处理的再生能力(图20c)，显示不同处理1周后创面愈合，肉芽组织生长。上皮间隙测量的结果显示出与伤口闭合相似的趋势(图20d)。颗粒组织厚度的进一步量化证实了伤口愈合的质量，其中新形成的厚颗粒组织表明皮肤再生更好。我们观察到，含有载干细胞的微凝胶组比细胞/微凝胶混合物组(340.6±61.2μm)和对照组(435.1±35.1μm)生成更多的颗粒组织(厚度763.7±56.4μm)(图20e)。与其他组相比，用细胞/微凝胶混合物处理的伤口处观察到大量cd3阳性t细胞(图20f和20g)，这很可能是由于暴露的同种异体骨髓间充质干细胞引起的强免疫原性所致。相比之下，引入载干细胞微凝胶后，t细胞和巨噬细胞的表达量明显减少(f4/80染色)，这可归因于包裹的同种异体干细胞的免疫调节能力以及水凝胶涂层对宿主免疫清除的屏蔽作用。总的来说，这些结果表明载干细胞的微凝胶具有通过免疫调节促进伤口愈合的能力。[0115]实施例9[0116]将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)，1wt％algma(甲基丙烯酰化海藻酸钠)和2wt％hama(甲基丙烯酸酰化透明质酸钠)前体混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以用金属离子进行交联稳定。[0117]实施例10[0118]将1wt％algnb(邻硝基苄醇基团修饰海藻酸钠)，2.5wt％gelma(甲基丙烯酸酰化明胶)和将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，395nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以用金属离子进行交联稳定。[0119]实施例11[0120]将1wt％algma-cd(环糊精基团修饰的甲基丙烯酸化海藻酸钠)，2.5wt％hama-ad(金刚烷基团修饰的甲基丙烯酸化透明质酸钠)和将0.1wt％lap(苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂)混合物溶解在α-mem无血清培养基中。将hmscs细胞分散在该聚合物的预聚液中称为细胞相(载细胞微凝胶浓度9×106个/ml)，连接至基片a的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入；将含有0.1wt％lap光引发剂的聚合物预聚液作为交联相，连接至基片b上的进样端口处，以1.6ml/h的流量泵入，该方法能将细胞和光引发剂分隔开，避免长时间接触。连续相(油相)由hfe7100氟化油和0.5w/v％的三嵌段krytox-peg-krytox表面活性剂组成，连接至基片c上的进样端口处，以32ml/h的流量泵入；清洗相输入通道处做封堵处理，从每个发生器制造的液滴在产品输出通道处通过直径0.68mmpe管连接并经过紫外光照射10s(200mw/cm2，365nm)触发形成凝胶。接下来，通过t型接头加入20v/v％全氟辛醇(pfo)的hfe7100氟化油，除去凝胶微球表面的表面活性剂，并于其上层添加纯培养基用于清洗，静置分层后，载细胞微凝胶分布于上层水相中的底层，取水相分离即可获得载细胞微凝胶，将这些载细胞微凝胶收集在t75瓶中。取上载细胞微凝水相，后采用抽滤的方式进行载细胞微凝胶密堆积作为打印的墨水。打印后的结构可以通过主客体相互作用进行稳定，为了提高强度还可继续引入金属离子进行交联反应。[0121]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12当前第1页12
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