一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法与流程

1.本发明属于生物化学、分子生物学和分析化学技术领域，涉及生物传感器检测氟喹诺酮类抗生素，具体涉及一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法。


背景技术：

2.喹诺酮类药物构成了一大类合成类抗生素药物，在治疗多种疾病时具有显著的效果，特别是它们的氟化衍生物，称为氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinones，fqs)。fqs是一种潜在的高污染物质，在低浓度下不仅会污染水环境，还会对地表水造成毒性影响。氧氟沙星(ofloxacin，ofl)作为一种典型的、用途广泛的氟喹诺酮类抗生素，对大多数革兰氏阴性菌和许多革兰氏阳性菌具有广泛药用活性。在机体内广泛使用氧氟沙星会导致其体内代谢不完全，且具有抗降解和高吸收特性，会在环境中积累，特别是在土壤环境中。更为严重的是，抗生素的滥用正在加速微生物耐药性(amr)的出现，这使得微生物诱导的感染难以治疗，有时甚至无法治愈。
3.当前，氟喹诺酮类抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法、电化学方法、荧光检测、萃取分光光度法和液相色谱质谱仪等。尽管它们具有很高的灵敏度和良好的选择性，但昂贵的仪器、专业的操作人员、复杂的预处理和耗时的过程限制了其在废水领域或食品中氧氟沙星检测的应用。许多国家也已经限定了水产品和动物产品中氧氟沙星的浓度标准，日本确定氧氟沙星的最高残留量(maximum residue limit，mrl)为10ppb(约30nm)，而欧洲标准仅规定了300至800ppb之间的fqs总和限值。因此，建立一种有效、快速的检测水环境和食品中ofl的方法是十分必要且具有重要意义的。
4.虽然investigation of a truncated aptamer for ofloxacin detection using a rapid fret-based apta-assay[j].antibiotics，2020，9(12)：860.公开了一种检测氧氟沙星的方法，但其100μm ofl仅可使核酸适配体中修饰的荧光基团fam的荧光恢复40％左右，灵敏度不够高；而且，现有技术中，ofl不能使标记在适配体上的fam的荧光增强，样品中痕量ofl检测受限。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法；基于荧光染料cy3和荧光猝灭剂bhq2的结合与分离导致cy3荧光猝灭-恢复(turn-off/on)及增强的核酸适配体传感器来检测氧氟沙星ofl；本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述方法用于检测氧氟沙星的核酸适配体传感器。
[0006]
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007]
一种用于检测氧氟沙星的核酸适配体传感器，包括cy3荧光标记的ofl核酸适配体与bhq2修饰的互补链cdna，cy3荧光标记的ofl核酸适配体是在seq id no.1所示序列的3
′
端修饰有荧光基团cy3；bhq2修饰的互补链cdna是在seq id no.2所示序列的5
′
端修饰有猝
灭基团bhq2。
[0008]
cy3荧光标记的ofl核酸适配体，在本技术中，记作cy3-适配体；
[0009]
bhq2修饰的互补链cdna，在本技术中，记作bhq2-cdna；
[0010]
cy3-适配体的核苷酸序列为：
[0011]5′‑
aagtgaggttcgtccctttaataaactcgattaggatctcgtgaggt gtgctctacaatcgtaatcagttag-cy3-3
′
；
[0012]
bhq2-cdna的核苷酸序列为：5
′‑
bhq2-ctaactgattac-3
′
。
[0013]
基于上述的核酸适配体传感器高灵敏检测氧氟沙星的方法，包括以下步骤：
[0014]
1)cy3-适配体与bhq2-cdna结合，形成混合物，bhq2猝灭了cy3的荧光；
[0015]
2)将待测样品加入到步骤1)中的混合物，静置反应，当待测样品中存在目标物ofl时，发生亲和力竞争，cy3-适配体与ofl结合形成cy3-适配体/ofl混合物，解开适配体/cdna的碱基对，通过cy3荧光基团释放恢复荧光，以及被ofl增强其cy3的荧光；
[0016]
3)建立ofl浓度与荧光恢复和增强程度之间的线性回归方程，根据荧光的恢复程度，测定待测样品中ofl的浓度。
[0017]
进一步的，步骤1)中，cy3-适配体是seq id no.1所示序列的3
′
端修饰有荧光基团cy3；bhq2-cdna是seq id no.2所示序列的5
′
端修饰有猝灭基团bhq2。
[0018]
进一步的，步骤1)中，cy3-适配体和bhq2-cdna在tris-hcl缓冲溶液中结合。
[0019]
进一步的，tris-hcl缓冲溶液中含1mm mg
2
和2mmk

；tris-hcl缓冲溶液的浓度为10mm，ph＝7.4。
[0020]
进一步的，步骤1)中，cy3-适配体和bhq2-cdna的摩尔比为1∶1-10；cy3-适配体的浓度为50-600nm。
[0021]
进一步的，步骤1)中，cy3-适配体和bhq2-cdna的摩尔比为1∶4；cy3-适配体的浓度为200nm。
[0022]
进一步的，步骤2)中，反应温度为37℃，反应时间为1h。
[0023]
进一步的，氧氟沙星的检测范围为0-100μm，线性检测范围为0-500nm，线性回归方程为y＝0.0526x 5.8391，检出限为0.2nm。
[0024]
所述的核酸适配体传感器用于检测牛奶和水中氧氟沙星。
[0025]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0026]
1)本发明选定的荧光染料cy3-适配体和猝灭剂bhq2-cdna组合，能够有效检测目标物ofl；
[0027]
2)本发明的目标物ofl对荧光染料cy3的荧光强度具有增强作用：在100μm浓度的ofl与fam-适配体结合可使fam-适配体/tamra-cdna中的fam的荧光恢复40％，相比，ofl可使其cy3-适配体/bhq2-cdna中的cy3的荧光恢复率能增强到70％以上；而且能够显著增强该方法的灵敏度，检测限低至0.2nm；
[0028]
3)操作简单，检测快速方便，不需要依赖大型的设备仪器，对检测环境和时间要求不严格；
[0029]
4)本技术方法可用于高灵敏检测牛奶、肉制品、水样中的痕量ofl。
附图说明
[0030]
图1是核酸适配体传感器检测ofl的工作原理图；
[0031]
图2是ofl与cy3-适配体结合对cy3荧光强度影响的图；
[0032]
图3是cy3-适配体与bhq2-cdna摩尔浓度比对cy3荧光强度的影响图；
[0033]
图4是cy3-适配体浓度对ofl恢复cy3荧光强度的影响图；
[0034]
图5是一系列浓度梯度的ofl通过与适配体特异性结合，对cy3荧光强度的影响曲线图；
[0035]
图6是加入ofl体系溶液中cy3的荧光强度和空白对照体系溶液中ofl的荧光强度的差值随ofl浓度变化的标准曲线图；
[0036]
图7是该方法的特异性检测图。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0038]
以下实施例中所使用的适配体为cy3荧光标记的ofl核酸适配体，记作cy3-适配体；
[0039]
cy3-适配体(cy3-apt)的核苷酸序列为：
[0040]5′‑
aagtgaggttcgtccctttaataaactcgattaggatctcgtgaggtgtgctctacaatcgtaatcagttag-cy3-3
′
；
[0041]
其互补cdna为bhq2修饰的互补链cdna，记作bhq2-cdna；
[0042]
bhq2-cdna的核苷酸序列为：5
′‑
bhq2-ctaactgattac-3
′
。
[0043]
实施例1
[0044]
一、可行性分析
[0045]
取一定摩尔浓度的cy3-适配体于tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，依次分别加入一定浓度的ofl、bhq2-cdna及bhq2-cdna和ofl的混合物。在一定温度条件下静置反应一段时间，用perkinelmer荧光分光光度计在激发波长535nm处测荧光，狭缝宽为10nm x 10nm。由图2可知，取565nm处的荧光强度绘制柱状图，当ofl加入到cy3-适配体溶液，ofl会使cy3的荧光增强；当无ofl、且bhq2-cdna存在时，bhq2-cdna使cy3的荧光有效猝灭；而当ofl存在时，通过竞争反应，ofl与cy3-适配体结合，使bhq2-cdna脱落，cy3的荧光恢复及增强。
[0046]
二、适配体与cdna摩尔浓度比的确定
[0047]
取不同摩尔浓度比的cy3-适配体和bhq2-cdna于tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，再加入一定浓度的目标物ofl，在一定的反应温度下静置反应一段时间，用perkinelmer荧光分光光度计在激发波长535nm处测荧光，狭缝宽为10nm x 10nm。由图3可以看出，随着c
aptamer
：c
cdna
比例的减少，cy3的荧光强度恢复程度先增大后降低，当c
aptamer
：c
cdna
比值为1∶4时，cy3的荧光强度恢复程度最大。因此，适配体和互补dna的最适摩尔浓度比为1∶4。
[0048]
三、适配体浓度的确定
[0049]
不同浓度的cy3-适配体和bhq2-cdna(c
aptamer
：c
cdna
比值为1：4)于tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，加入一定浓度的目标物ofl，在一定的反应温度
下静置反应一段时间，用perkinelmer荧光分光光度计在激发波长535nm处测荧光，狭缝宽为10nm x 10nm。由图4可知，当适配体浓度为200nm时，加入ofl，cy3的荧光强度恢复程度效果良好。因此，选取200nm和800nm分别为最佳cy3-适配体和bhq2-cdna浓度。
[0050]
四、标准曲线的建立
[0051]
配制浓度分别为0、10、50、100、200、500、1000、5000、10000、20000、50000和100000nm的氧氟沙星溶液，加入到含200nm cy3-适配体和bhq2-cdna的tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，其中cy3-适配体和bhq2-cdna的摩尔浓度比为1：4。在37℃静置反应1h，将上述溶液置于荧光分光光度计中，得到不同浓度下的荧光光谱图，且每个浓度设计三组平行试验，狭缝宽为10nm x 10nm。最后选取在激发波长为535nm的荧光波谱图，取565nm处的荧光强度绘制标准曲线，以ofl浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，建立氧氟沙星的线性回归方程，计算回归方程及相关系数。如图5和6所示，在ofl的浓度在0～100000nm范围内，相对荧光强度与氧氟沙星浓度之间线性关系为y＝0.0526x 5.8391，r2＝0.993，线性范围为0～500nm，检测限为0.2nm，表明此方法对ofl的高灵敏度。
[0052]
五、特异性检测
[0053]
取摩尔浓度比为1∶4的cy3-适配体(200nm)和bhq2-cdna于tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，依次分别加入氟喹诺酮类抗生素(氧氟沙星(ofl)、环丙沙星(cip)、培氟沙星(pef))、四环素类抗生素(四环素(tc)、金霉素(ctc)、土霉素(otc)、米诺环素(min)、美他环素(metc))和甘氨酸(gly)，使每种抗生素在反应体系中的最终浓度为1μm。在37℃静置反应1h，每种抗生素做三组平行样。用perkinelmer荧光分光光度计在激发波长535am处测荧光，狭缝宽为10nm x 10nm。由图7可知，取565nm处的荧光强度绘制柱状图，其他抗生素对本发明的干扰性不显著，该检测方法对ofl的检测具有良好的特异性。
[0054]
六、实际水样中的回收率
[0055]
在超纯水、饮用水、自来水、湖水、河水五种水质中配制浓度为500nm的氧氟沙星溶液，重复三组实验。取摩尔浓度比为1∶4的cy3-适配体(200nm)和bhq2-cdna于tris-hcl(10mm，ph＝7.4，含2mm k

和1mm mg
2
)缓冲溶液中，分别加入含500nm ofl的不同水质，使各个反应体系中的ofl的浓度为50nm，在37℃静置反应1h，用perkinelmer荧光分光光度计在激发波长535nm处测荧光。
[0056]
如表1所示，饮用水、自来水、湖水、河水等实际四种水样的ofl加标实验中，与超纯水相比ofl的回收率均为90～110％左右。ofl在不同水样中的具体回收率分别为：百岁山天然矿泉水95.63％、实验室自来水110.75％玄武湖105.67％、紫湖溪91.39％。结果显示，该检测方法在实际水样中检测ofl具有准确性和可靠性。
[0057]
表1不同水样中ofl的回收率
[0058]
水样类型饮用水自来水湖水河水来源百岁山天然矿泉水实验室玄武湖紫湖溪回收率95.63％110.75％105.67％91.39％
[0059]
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出
或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。