可溶性CD206在制备抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂盒中的应用的制作方法

可溶性cd206在制备抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及可溶性cd206在制备抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎疾病活动诊断试剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

2.抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，anca)相关性血管炎(anca-associated vasculitis，aav)是一类以中小血管损害为主，累及多脏器的自身免疫性疾病。当疾病累及肾脏时，可引起以肾小球纤维素样坏死和新月体形成为主要病理特征的寡免疫复合物型肾小球肾炎。既往认为，aav是一种少见病，故而未受到临床重视，但近来研究表明，aav发病率有逐年增高的趋势，已不再是罕见病和少见病。aav病情重，预后差，若未得以及时诊断或治疗，死亡率可达90％甚至更高。血清中出现anca是aav的重要发病原因和特征之一，anca与中性粒细胞表面蛋白酶3(proteinase 3，pr3)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)等靶抗原结合，激活中性粒细胞释放炎症因子、超氧化物等促炎性物质损伤血管壁是aav的主要发病机制之一。
3.近年来，多项研究表明单核/巨噬细胞在aav的发病过程中也起重要作用。anca靶抗原不仅表达于中性粒细胞胞浆，也表达于单核细胞中过氧化物酶阳性的溶酶体中。anca相关性肾小球肾炎发病早期即有大量的单核/巨噬细胞浸润，不仅存在于纤维素样坏死和细胞性新月体等早期损伤部位，也存在于尚为正常的肾小球中。伴随病情进展，单核/巨噬细胞主要聚集于新月体、纤维素样坏死等肾脏损伤部位，提示单核/巨噬细胞与aav肾损伤的起始和发展密切相关。
4.单核/巨噬细胞是一类重要的免疫细胞。激活的单核细胞可分化为巨噬细胞，巨噬细胞在不同的微环境中具有较强的异质性，根据其表型和功能的不同主要分为经典激活巨噬细胞(classically activated macrophage,m1巨噬细胞)和替代激活巨噬细胞(alternatively activated macrophage,m2巨噬细胞)，这一过程称为巨噬细胞极化。m1巨噬细胞具有促炎能力，细胞表面高表达cd80分子，可以与t细胞表面受体结合激活t细胞，同时胞内高表达一氧化氮合酶inos，将精氨酸代谢为一氧化氮，参与炎症反应；m2巨噬细胞则与抗炎、组织修复和纤维化有关，胞内高表达精氨酸酶arg-1，在不同刺激因子作用下，m2巨噬细胞进一步可分为m2a、m2b、m2c巨噬细胞等亚型。m2a巨噬细胞表面高表达甘露糖受体cd206，m2c巨噬细胞表面高表达清道夫受体cd163。
5.正常生理情况下，cd206可识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式，介导抗原呈递、内化损伤成分、调节细胞活性与细胞转运。有研究表明，当细胞受到脂多糖(lipopolysaccharide，lps)、酵母多糖或atp等炎性刺激时，cd206可被蛋白酶切割，其胞外段脱落，形成可溶性cd206(soluble cd206，scd206)。目前暂无cd206

巨噬细胞活化和scd206在aav中表达特点的相关报道。
6.评估aav疾病活动性对改善aav预后至关重要。尽管aav发病与anca密切相关，但以
anca滴度评估aav疾病活动性存在较大争议。金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等感染可引起血清anca滴度升高，但并不代表aav出现进展。此外，有研究表明，约40％的aav患者在非活动期仍出现anca滴度的上升，并在缓解期仍维持在较高水平。因此，anca滴度并不能准确反映aav的疾病活动性。
7.目前临床上常用于评估aav疾病活动性的其他指标包括血沉、c反应蛋白、血肌酐和伯明翰血管炎活动性评分量表(birmingham vasculitis activity score，bvas)等。血沉和c反应蛋白水平虽然在一定程度上可以作为aav疾病活动的佐证，但特异性较差，极易受到感染或其他潜在疾病的影响。血肌酐则难以分辨出疾病活动期的肾功能受累和疾病慢性化所致肾功能受累。bvas量表较为全面，但内容繁多，使用复杂，需要有经验的专业医师进行评估。此外，这些常用指标依赖于静脉血的采集，有创操作难免给患者带来痛苦和感染等风险。因此，探寻其他无创或者创伤小的新型检测方法，对检测aav患者转归具有重要意义。


技术实现要素：

8.本发明的第一个目的在于，提供抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎疾病诊断标志物，可溶性cd206作为抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎活动度诊断标志物的应用，通过检测可溶性cd206水平，可预测抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等自身免疫疾病活动。
9.本发明的第二个目的在于，提供检测可溶性cd206表达水平的试剂在制备抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂或试剂盒中的应用。
10.本发明的第三个目的在于，提供一种特异性强、灵敏度高的抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂盒。
11.为了实现上述第一个目的，本发明提供了可溶性cd206作为抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断标志物的应用。
12.为了实现上述第二个目的，本发明提供了检测可溶性cd206表达水平的试剂在制备抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
13.作为一个优选方案，所述诊断试剂为检测生物样品中可溶性cd206含量的试剂。
14.作为一个优选方案，所述诊断试剂盒包含了检测生物样品中可溶性cd206含量的试剂。
15.作为一个优选方案，所述生物样品获自对象的尿液、血液或者组织液。尤其优选尿液样本，利用无创性尿液样本进行检测，留取标本便捷，方便临床应用。将可溶性cd206水平与尿液标本结合检测即可实现对中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等疾病活动度检测的目的，同时也发挥尿液标本无创和检测便捷的特点。
16.为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断试剂盒，所述试剂盒包含了检测生物样品中可溶性cd206含量的试剂。
17.作为一个优选方案，所述试剂盒包含羊抗人cd206抗体、鼠抗人cd206抗体和辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠igg抗体。
18.本发明的优点在于，本发明公开了可溶性cd206可以作为抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎诊断标志物，特异性强并且灵敏度高。通过检测可溶性cd206水平，可预测抗
中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等自身免疫疾病活动，为临床治疗提供参考依据。
附图说明
19.图1采用scd206试剂盒检测活动期aav患者、缓解期aav患者和健康志愿者尿液中scd206水平。
20.图2检测活动期aav患者、缓解期aav患者和健康志愿者血清中scd206水平。
21.图3采用免疫组化方法检测aav小鼠模型与正常小鼠肾脏中cd206

巨噬细胞表达。
22.图4采用流式细胞术检测活动期aav患者、缓解期aav患者及健康志愿者外周血cd206

巨噬细胞分布差异。
具体实施方式
23.以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
24.实施例1.构建可溶性cd206检测试剂盒用于活动性aav患者与缓解期aav患者尿液中scd206水平检测
25.1)、试剂盒构成及操作步骤
26.(1)、scd206检测试剂盒组成
27.■
标准96孔透明酶标板；
28.■
捕获抗体(羊抗人cd206抗体，免疫原序列leu19-lys1383(thr399ala、leu407phe))0.2mg；
29.■
检测抗体(鼠抗人cd206抗体，clone id：7-450)1mg；
30.■
辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠igg抗体0.6mg；
31.■
tmb显色液；
32.■
显色终止液；
33.■
磷酸盐缓冲盐溶液(pbs)；
34.■
牛血清白蛋白(bsa)；
35.■
包被缓冲液；
36.■
tween-20；
37.■
封板膜。
38.(2)、样本处理前试剂盒准备工作
39.■
a液配制：捕获抗体以溶于1ml pbs中(终浓度0.2mg/ml)，-20℃保存；
40.■
b液配制：检测抗体溶于1ml pbs(终浓度1mg/ml)，-20℃保存；
41.■
c液配制：辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠igg抗体溶于1ml pbs(终浓度0.6mg/ml)，-20℃保存；
42.■
pbs-t配制：将tween-20加入pbs中，配成pbs-t(终浓度为0.05％tween-20)，室温保存；
43.■
bsa溶液配制：将bsa加入pbs中，构成1％bsa溶液，4℃保存；
44.■
使用包被缓冲液将a液稀释200倍，每孔100μl加入96孔透明酶标板中。贴上封板膜，4℃静置过夜。
45.(3)、样本处理
46.■
尿液样本室温2000r离心10分钟；
47.■
吸取上清，使用pbs稀释20倍。
48.(4)、样本检测
49.■
弃去孔内液体，每孔加入200μl pbs-t，5分钟后弃去，在吸水纸上拍干残留液体，重复3次；
50.■
每孔加入100μl 1％bsa溶液，贴上封板膜，37℃封闭1小时；
51.■
重复第1步洗板操作；
52.■
每孔加入100μl稀释后样本，贴上封板膜，37℃孵育2小时；
53.■
重复第1步洗板操作；
54.■
使用1％bsa将b液稀释1000倍，每孔加入100μl，贴上封板膜，37℃孵育1小时；
55.■
重复第1步洗板操作；
56.■
使用1％bsa将c液稀释3000倍，每孔加入100ul，贴上封板膜，37度孵育1小时；
57.■
弃去孔内液体，每孔加入200μl pbs-t，5分钟后弃，在吸水纸上拍干残留液体，重复5次；
58.■
每孔加入100μl tmb显色液，室温避光孵育15分钟；
59.■
不弃tmb显色液，每孔加入终止液100μl，酶标仪检测450nm处吸光度值；
60.3)、临床标本实例检测(以3名未经治疗的初发aav患者尿液标本为例)。
61.患者1：男，69岁，因“纳差伴肌酐进行性升高十天”入院。入院查肌酐945umol/l，egfr 5.1ml/min/1.73m2，尿蛋白 ，c-反应蛋白《10mg/ml，p-anca阳性，mpo-anca滴度为198ru/ml。肾穿病理提示新月体肾炎，结合病史符合anca相关性肾炎肾脏病理表现。bvas评分18分，患者处于血管炎活动期。
62.患者2：男，72岁，因“发现泡沫尿四月余，肌酐升高半月”入院。入院查肌酐508umol/l，egfr 9ml/min/1.73m2，尿蛋白 ，血沉9mm/h，c-反应蛋白0.52mg/l，p-anca阳性，mpo-anca滴度为132.52ru/ml。肾穿病理提示局灶节段性肾小球硬化伴新月体形成，结合病史符合anca相关性肾炎肾脏病理表现。bvas评分19分，患者处于血管炎活动期。
63.患者3：男，65岁，因“泡沫尿一年余伴双下肢浮肿十余天”入院。入院查肌酐197umol/l，egfr 31.6ml/min/1.73m2，尿蛋白 ，血沉26mm/h，c-反应蛋白《10mg/l，p-anca阳性，mpo-anca滴度为162.4ru/ml。肾穿病理提示局灶节段增生、坏死、硬化性肾小球肾炎伴新月体形成，结合病史符合anca相关性肾炎肾脏病理表现。bvas评分17分，患者处于血管炎活动期。
64.经过检测，上述三例血管炎患者尿液scd206表达明显增高。
65.在进一步研究中，我们选取健康志愿者，活动期及缓解期aav患者，留取尿液进行scd206表达研究。如图1所示，以健康志愿者吸光度值均值为基准，活动期aav患者尿液中scd206水平升高，差异有统计学意义(p《0.05)；与活动期aav患者相比，缓解期aav患者血清中scd206水平下降，差异有统计学意义(p《0.05)。scd206可作为aav活动性的无创生物指标。
66.实施例2.活动性aav患者与缓解期aav患者血清中scd206水平检测
67.1)、样品收集
68.招募年龄性别相匹配健康志愿者4名、未接受治疗的aav患者12名和缓解期aav患者6名，使用促凝管收集2ml外周血。所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。
69.2)、样品处理
70.新鲜收集的外周血于室温下2000rpm离心10分钟，吸取上层血清，-80℃冰箱中保存。
71.3)、血清scd206水平检测
72.具体步骤同实施例1。
73.4)、统计学分析
74.统计学分析应用软件spss 13.0(spss inc)，其中计量数据用中位数
±
四分位数间距表示，组间比较采用采用曼-惠特尼非参数检验；p《0.05表示差异具有统计学意义。
75.5)、结果
76.如图2所示，与健康志愿者相比，活动期aav患者血清中scd206水平升高，差异有统计学意义(p《0.01)；与活动期aav患者相比，缓解期aav患者血清中scd206水平下降，差异有统计学意义(p《0.01)。
77.实施例3.aav小鼠模型肾脏组织中cd206

巨噬细胞检测
78.1)、组织采集与处理
79.构建aav小鼠模型，经生理盐水灌注后采集肾脏，使用4％多聚甲醛固定，制备蜡块，2μm切片。
80.2)、免疫组织化学检测组织中cd206

巨噬细胞
81.(1)脱蜡水化：石蜡切片60℃烘箱2小时；二甲苯ⅰ、ⅱ、ⅲ各脱蜡30min，无水乙醇ⅰ、ⅱ各10min，95％乙醇3min，80％乙醇3min，自来水洗5min；
82.(2)煮沸加热抗原修复：0.01m枸橼酸缓冲液(ph 6.0)加热至100℃，放入切片，修复15min，室温冷却30min；
83.(3)封闭内源性过氧化物酶活性：3％h2o2避光孵育30min，pbs浸洗2min
×
2次；
84.(4)bsa封闭、一抗孵育：1％bsa室温封闭60min，洗涤后抗cd206抗体(1:200)4℃孵育过夜。
85.(5)二抗孵育：pbs/t冲洗3min
×
3次，二抗37度孵育30min，pbs/t冲洗3min
×
3次；
86.(6)dab显色，显微镜下控制显色时间，纯水冲洗终止反应；自来水冲洗10min；
87.(7)细胞核复染：苏木素染色3min，自来水冲洗1min；1％盐酸酒精分化2秒；自来水洗15min返蓝；
88.(8)脱水封片：切片先后过95％乙醇ⅰ、ⅱ，无水乙醇ⅰ、ⅱ、ⅲ中脱水各1min；二甲苯ⅰ、ⅱ透明各2min。
89.(9)中性树胶封片。
90.3)、结果
91.如图3所示，与对照组小鼠相比，aav小鼠模型肾脏组织中cd206

巨噬细胞明显增多。
92.实施例4.活动性aav患者与缓解期aav患者外周血中cd206

巨噬细胞检测
93.1)、样品收集
94.招募年龄性别相匹配健康志愿者9名、未接受治疗的aav患者13名和缓解期aav患者8名，使用肝素抗凝管收集2ml外周血。所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。
95.2)、单个核细胞分离
96.(1)将新鲜收集的外周血倒入50ml离心管中，加rpmi 1640培养基稀释至30ml；
97.(2)在50ml离心管中倒入15ml的淋巴细胞分离液，将离心管倾斜45
°
角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释的血液叠于分层液上，保持两者界面清晰(稀释血液与分层液体积比例约为3:1)；
98.(3)室温下水平离心机以1800rpm离心45min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆，中间层为分离液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层(薄)。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞；
99.(4)使用吸引器将上层血浆去除，随后用1m巴氏吸管轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中；
100.(5)加入30ml的pbs缓冲液洗涤2次。
101.3)、流式细胞术检测巨噬细胞分型
102.(1)洗涤后的pbmc用100μl的stain buffer重悬，随后转移至流式管；
103.(2)加0.1μl的fixable viability stain 780，室温避光孵育10min；
104.(3)试管中加入2ml的pbs离心，1000rpm，5min，弃去上清；
105.(4)加入250μl的固定液，4度避光孵育20min；
106.(5)加入2ml破膜液后离心，1000rpm，5min，加入100μl破膜液进行重悬；
107.(6)分别加5μl的human cd68[pe-cy7]、5μl的hu cd206[bv421]，室温避光孵育20min；
[0108]
(7)加入2ml破膜液离心洗涤2次，1000rpm，5min，加入700μl的stain buffer后流式细胞仪进行检测。
[0109]
4)、统计学分析
[0110]
统计学分析应用软件spss 13.0(spss inc)，其中计量数据用均数
±
标准差表示，组间比较采用采用t检验；p《0.05表示差异具有统计学意义。
[0111]
5)、结果
[0112]
结果如图4所示，与健康志愿者相比，在初发anca血管炎患者中，外周血cd206

巨噬细胞比例较健康志愿者明显升高，差异具有显著统计学意义(p《0.001)；而缓解期aav患者外周血中cd206

巨噬细胞比例较出发aav患者明显下降，差异具有显著统计学意义(p《0.001)。提示cd206可作为活动性血管炎巨噬细胞标志物。
[0113]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。