一种同基源不同生长部位药材功能靶点筛选方法与流程

1.本发明属于中药技术领域，涉及一种同基源不同生长部位药材功能靶点筛选方法。


背景技术：

2.中药材使用时，在质量上经常存在同基源不同生长部位药材混淆使用以及同基源不同用药部位药材互相替代的情况；虽然相同基源药材的化学成分种类相似、药效物质相近；但是，仍有很多同基源药材由于用药部位差异，其性味归经也有差别，使得其药效功能不同；因此，在临床用药时，需要考虑药材的用药部位、归经、治疗效果以及作用机制等因素，从同基源药材中筛选出作用于靶点的中药，保证药物的安全性、有效性和可控性。
3.以茯苓类药材的茯神和茯神木为例，茯苓类药材因入药部位不同，其名称亦不尽相同。茯神为茯苓菌核中间抱有松根的白色部分，始载于《名医别录》，甘、淡、平，入心、脾经，具有宁心、安神、利水功效；茯神木为茯苓菌核中间的松根，性甘平，具有平肝安神的作用，两者皆可用于治疗心绪不宁、心慌、心悸，易烦躁或失眠多梦等症状；虽然茯神和茯神木在宁心安神方面都有显著的治疗作用，因生长部位及归经差异，两者的治疗效果仍有不同，其机制差异也有待探索。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种同基源药材功能靶点筛选方法，通过比较同基源不同药用部位药材间功能靶点的差异，阐明其作用机制的不同，以保证复方配伍有效性和临床给药安全性。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.一种同基源不同生长部位药材功能靶点筛选方法，包括以下步骤：
7.1)采用“数据池”方法鉴定出同基源不同部位药材的化学成分；
8.2)根据步骤1)得到的化学成分，通过batman
–
tcm以及tcmsp数据库，对得到同基源不同部位药材的作用靶点分别进行预测，并生成“化学成分-靶点”集合；
9.3)结合同基源不同生长部位药材的功效，通过etcm、ttd和genecards数据库，生成“疾病-靶点”集合；
10.4)根据步骤2)得到的“化学成分-靶点”集合和步骤3)得到的“疾病-靶点”集合，依次得到同基源不同生长部位药材的交集靶点和关键靶点；
11.5)从交集靶点以及关键靶点得到同基源不同生长部位药材的“靶点-通路”信息和蛋白互作网络；
12.6)通过上述蛋白互作网络信息，并结合“化学成分-靶点”集合、“疾病-靶点”集合以及“靶点-通路”信息，构建得到同基源不同生长部位药材的“成分-疾病-靶点”关联网络图；
13.7)根据构建的“成分-疾病-靶点”关联网络图，分析得到同基源不同生长部位药材
的作用机制。
14.所述步骤1)的具体过程是：
15.1.1)取同基源不同生长部位药材粉末0.8g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，密封，称重，浸泡30min，超声处理60min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，滤过，吸取续滤液15ml，置蒸发皿中，水浴蒸至约1ml，加甲醇至5ml，摇匀，过0.22μm微孔滤膜滤，得到滤液；
16.1.2)将步骤1.1)得到的滤液置于色谱柱中，采用高分辨质谱法得到同基源不同生长部位药材的色谱数据；
17.1.3)对步骤1.2)的色谱数据，以ab sciex master view 1.1.0.0中药成分数据库作为同基源药材的成分匹配库，鉴定出同基源药材的化学成分。
18.所述步骤1.2)中，高分辨质谱法的条件参数是，
19.uplc c
18
色谱柱50mm
×
2.1mm，1.7μm；体积流量0.3ml/min；柱温30℃；波长190-500nm；进样量5μl；流动相a为0.1％甲酸，流动相b为乙腈；
20.梯度洗脱程序为0-2min、流动相b为10％；2-50min、流动相b为10％～100％；50-55min、流动相b为100％；后运行5min。
21.所述步骤4)的具体过程是：
22.4.1)通过venny平台得到“化学成分-靶点”集合和“疾病-靶点”集合的交集靶点；
23.4.2)经上述交集靶点上传至string平台，在“multiple proteins”模式下，将得到的tsv数据导入到cytoscape软件，通过network analyzer插件筛选出度值大于20的靶点，即为关键靶点。
24.所述步骤5)的具体过程是：
25.5.1)通过string平台，从同基源药材的交集靶点获得蛋白互作信息；
26.5.2)根据关键靶点从蛋白互作信息中构建得到同基源药材蛋白互作网络；
27.5.3)采用r软件以及kegg数据库，对关键靶点进行生物信息学富集分析和通路注释，得到“靶点-通路”信息。
28.所述步骤6)的“成分-疾病-靶点”关联网络图中，以节点表示成分、疾病以及靶点；且节点大小表示度数大小。
29.本发明的有益效果是：
30.1、本发明提供的同基源药材功能靶点筛选方法，结合化合物鉴定及数据库检索结果，基于高分辨质谱结合网络药理学的研究方法，分别收集不同生长部位药材成分相关靶点和疾病相关靶点，构建“药材-成分-靶点-通路-疾病”网络，通过比较同基源不同药用部位药材间功能靶点的差异，阐明其作用机制的不同，以保证复方配伍有效性和临床给药安全性。
31.2、本发明具体以茯苓类药材的茯神和茯神木为例，针对两者不同部位的同基源药材功能成分对心绪不宁产生的心律失常症状，预测茯神和茯神木在抗心律失常过程中潜在的作用机制，为临床用药的安全性和有用性提供保障。
32.3、本发明在药理学网络的预测基础上，采用氯化钡诱发心律失常斑马鱼模型，进一步收集斑马鱼全代谢物，对差异代谢物及网络药理学筛选出的关键靶点进行共同富集，筛选茯神和茯神木发挥抗心律失常作用最有可能干预的通路；然后借助液质联用技术，比
较各组中关键代谢物的含量，考察茯神和茯神木对富集通路上关键代谢物水平的调节作用。此外，还结合“成分-靶点-通路”网络及蛋白-代谢物共同富集结果，采用实时荧光定量pcr技术对富集通路上与心律失常密切相关的基因的mrna表达进行检测，以验证茯神和茯神木在治疗心律失常方面功能靶点的差异，有利于快速筛选。
附图说明
33.图1为茯神化学成分的初步鉴定总离子流图；
34.图2为茯神木化学成分的初步鉴定总离子流图；
35.图3为茯神“成分-疾病”靶点筛选网络图；
36.图4为茯神木“成分-疾病”靶点筛选网络图；
37.图5为茯神“成分-疾病-靶点”互作网络图；
38.图6为茯神木“成分-靶点-通路”互作网络图；
39.图7为茯神(prp)干预心律失常斑马鱼心脏形态观察；
40.图8为茯神(prp)干预心律失常斑马鱼心脏充血面积计算结果(n＝6)；
41.图9为茯神木(pp)干预心律失常斑马鱼心脏形态观察；
42.图10为茯神木(pp)干预心律失常斑马鱼心脏充血面积计算结果(n＝6)；
43.图11为茯神(prp)干预心律失常斑马鱼心脏sv-ba间距测量(n＝6)；
44.图12为茯神木(pp)干预心律失常斑马鱼心脏sv-ba间距测量(n＝6)；
45.图13为茯神(prp)干预心律失常斑马鱼心肌细胞形态观察；
46.图14为茯神(prp)干预心律失常斑马鱼心肌细胞平均荧光密度计算(n＝6)；
47.图15为茯神木(pp)干预心律失常斑马鱼心肌细胞形态观察；
48.图16为茯神木(pp)干预心律失常斑马鱼心肌细胞平均荧光密度计算(n＝6)；
49.图17为茯神各组差异代谢物pca分析图；
50.图18为茯神木各组差异代谢物pca分析图；
51.图19为茯神/茯神木在调控心律失常斑马鱼时关键靶点表达结果(n＝6)；
52.图20为茯神/茯神木在调控心律失常斑马鱼时关键靶点表达结果(n＝6)；
53.图21为茯神调控心律失常斑马鱼中腺苷和cgmp的代谢水平(n＝6)；
54.图22为茯神木调控心律失常斑马鱼中肾上腺素和环磷酸腺苷代谢水平(n＝6)；
55.图23为茯神的抗心律失常作用机制示意图；
56.图24为茯神木的抗心律失常作用机制示意图。
具体实施方式
57.现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
58.实施例
59.本实施例提供的同基源药草，是以茯苓类药材的茯神和茯神木为例，通过比较同基源不同药用部位药材间功能靶点的差异，阐明其作用机制的不同，以保证复方配伍有效性和临床给药安全性。
60.本实施例中，针对茯神和茯神木两者对心绪不宁产生的心律失常症状，结合化合物鉴定及数据库检索结果，基于高分辨质谱结合网络药理学的研究方法，分别收集茯神和
茯神木成分相关靶点和心律失常疾病相关靶点，构建“药材-成分-靶点-通路-疾病”网络，预测茯神和茯神木在抗心律失常过程中潜在的作用机制。在网络药理学的预测基础上，采用氯化钡诱发心律失常斑马鱼模型，通过对斑马鱼静脉窦-动脉球间距(sinus venous-bulbus arteriosus，sv-ba)、心血管出血面积、心肌细胞凋亡水平进行量化，初步评价茯神和茯神木对氯化钡所致心律失常斑马鱼的作用。进一步收集斑马鱼全代谢物，进行代谢组学分析，通过建立非监督主成分分析(principal component analysis，pca)模型对斑马鱼整体代谢轮廓进行考察；构建有监督模式的偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，pls-da)模型，筛选出符合条件的差异性代谢物；通过joint pathway analysis模块对差异代谢物及网络药理学筛选出的关键靶点进行共同富集，筛选茯神和茯神木发挥抗心律失常作用最有可能干预的通路。然后借助液质联用技术，比较各组中关键代谢物的含量，考察茯神和茯神木对富集通路上关键代谢物水平的调节作用。最后，结合“成分-靶点-通路”网络及蛋白-代谢物共同富集结果，采用实时荧光定量pcr技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，rt-pcr)对富集通路上与心律失常密切相关的基因的mrna表达进行检测，以验证茯神和茯神木在治疗心律失常方面功能靶点的差异。
61.本实施例提供的同基源药材功能靶点筛选方法，包括以下步骤：
62.1、基于高分辨质谱的茯神/茯神木化学成分鉴定
63.1.1液相条件
64.uplc c
18
色谱柱(50mm
×
2.1mm，1.7μm)，0.1％甲酸(a)-乙腈(b)作为流动相，梯度洗脱程序为0-2min，10％b；2-50min，10％-100％b；50-55min，100％b；后运行5min；体积流量0.3ml
·
min-1
；柱温30℃；190-500nm波长；进样量5μl；
65.1.2质谱条件
66.离子源为电喷雾离子源(esi)，正离子模式下，采用信息依赖采集(ida)、动态背景扣除(dbs)和高灵敏度模式采集数据。离子扫描范围m/z 100-2000，源喷射电压(ion spray voltage floating)为5500v，裂解电压(declustering potential，dp)为40v，碰撞能量(collision energy，ce)为10ev，雾化气(ion source gas 1，gs1)和辅助气(ion source gas 2，gs2)为氮气，均为50psi，气帘气(curtain gas，cur)为35psi，雾化温度(temperature，tem)550℃。
67.1.3供试品溶液的制备
68.取茯神/茯神木粉末0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，浸泡30min，超声处理(功率140w、频率42khz)60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，吸取续滤液15ml，置蒸发皿中，水浴蒸至约1ml，加甲醇至5ml，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。1.4成分分析
69.将茯神和茯神木供试品溶液以1:1体积比首先混合制成“数据池”测试样本。按“1.1-1.2”方法进行样品测定。通过peakview 2.2查看采集数据，以ab sciex master view 1.1.0.0中药成分数据库(tcm library 1.0)作为“数据池”的成分匹配库。通过比对精确质量数、同位素峰度比、分子离子峰、子离子峰以及碎片离子裂解规律等信息。将数据池样本导入multiquant软件生成成分辨识模板。再按照“1.1-1.2”方法对茯神和茯神木供试品溶液分别进行测定，将得到的数据直接导入成分辨识模板，然后对茯神和茯神木成分分别进
行匹配。
70.初步鉴定出茯神中的5个化学成分：茯苓酸(c
33h52
o5)、甘草次酸(c6h
14
o6)、齐墩果酸(c
30h48
o3)、腺苷(c
10h13
n5o4)和腺嘌呤(c5h5n5)(参见图1)。
71.茯神木中的5个化学成分：茯苓酸(c
33h52
o5)、腺苷(c
10h13
n5o4)、维甲酸(c
20h28
o2)、乔松素(c
15h12
o4)和松柏醛(c
10h10
o3)(参见图2)。
72.通过比对二级质谱信息，初步鉴定出茯神木中的5个化合物，即茯苓酸、腺苷、维甲酸、乔松素、松柏醛，对应的保留时间分别为33.11min，0.62min，20.18min，17.15min，6.69min，相对应的一级质谱图、二级质谱图及化学结构式分别见图b-f。
73.2、茯神/茯神木作用靶点预测
74.2.1茯神/茯神木化学成分的收集
75.结合高分辨质谱鉴定得到的茯神/茯神木化学成分，并参考batman-tcm(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、tcmsp(http://www.tcmspw.com)数据库中的检索结果，收集用于靶点预测的茯神和茯神木化学成分信息。
76.茯神活性化合物共11个，分别为：茯苓酸、齐墩果酸、甘草次酸、腺嘌呤、麦角胺碱、月桂醛、腺苷、棕榈酸、月桂酸、辛酸和土莫酸。
77.茯神木活性化合物共17个，分别为：茯苓酸、腺苷、维甲酸、乔松素、松柏醛、胆碱、松二糖、麦角胺、棕榈酸、月桂酸、辛酸、土莫酸、去氢伊布里酸、甘松新酮、月桂醛、麦角固醇及尿苷。
78.2.2靶点的收集与筛选
79.整理茯神和茯神木活性化合物在batman-tcm以及etcm(http://www.tcmip.cn/etcm/index.php/home)数据库中相对应的靶点，将该靶点集作为茯神/茯神木的潜在作用靶点群；
[0080]“arrhythmia(心律失常)”输入genecards(https://www.genecards.org/)数据库，检索心律失常相关靶点，通过venny平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)求得成分对应靶点与疾病相关靶点的交集靶点；初步预测茯神/茯神木通过作用于以上靶点，发挥其抗心律失常的作用；
[0081]
为了进一步找到贡献显著的靶点，将上述交集靶点的信息上传至string平台(https://string-db.org/)，在“multiple proteins”模式下，设置种属为“homo sapiens”，将得到的tsv数据导入到cytoscape软件，通过network analyzer插件筛选出度值大于20的靶点作为关键靶点，用于进一步的预测分析。
[0082]
本实施例中，茯神的11个化学成分在batman-tcm和etcm数据库中对应的靶点共有664个，以uniprot数据库搜索校正后生成“成分-靶点”集合。从etcm、ttd和genecards等数据库获得与心律失常疾病相关的靶点共374个，生成“疾病-靶点”集合。以venn工具2.1.0取靶点交集，得到交集靶点58个。将交集内靶点以string 11.0构建ppi(protein to protein interaction)网络(参见图3)。结果显示，ppi网络中共有58个节点，即有58个相互作用蛋白。
[0083]
本实施例中，茯神木的17个潜在活性成分在batman-tcm以及etcm数据库中对应的靶点共有1157个，生成“成分-靶点”集合。从genecards数据中得到与心律失常相关的靶点共计723个，生成“疾病-靶点”集合。通过venny平台对上述得到的“成分-靶点”和“疾病-靶
点”集合取靶点交集，得到交集靶点156个。156个交集靶点的信息上传至string平台后，获得蛋白互作信息，将度值大于20的29个靶点作为主要研究对象，其蛋白互作网络如(参见图4)。
[0084]
2.3go及kegg富集分析
[0085]
本实施例中，为了分析茯神/茯神木的作用机制，采用r软件的clusterprofiler包对关键靶点进行go(gene ontology)生物信息学富集分析；具体的，采用3个本体(ontology)来描述靶点所处的细胞位置(cellular component，cc)、分子功能(molecular function，mf)和参与的生物过程(biological process，bp)。
[0086]
本实施例中，以kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes，https://www.kegg.jp/)数据库对靶点参与的主要生物代谢途径进行富集和注释，通过r软件的ggplot2包进行可视化图的绘制。
[0087]
具体的，茯神的go及kegg富集分析过程是，将“成分-疾病”对应的58个靶点通过r软件的clusterprofiler进行go富集分析和kegg通路注释，共富集到465条生物学过程，58条代谢通路。go分析cc、mf、bp较丰富的20条途径。结果表明，这些靶点主要分布于复杂的离子通道上(go:0034703,cation channel complex)和跨膜转运体(go:1902495,transmembrane transporter complex)上。其分子功能(mf)主要与离子通道活性(go:0005216,ion channel activity)、阳离子通道活性(go:0005261,cation channel activity)和金属离子跨膜转运体活性有关。生物途径(bp)主要涉及心肌收缩(go:0060047,heart contraction)、心肌收缩力的调节(go:0008016,regulation of heart contraction)、心脏过程(go:0003015,heart process)和血液循环的调节(go:1903522,regulation of blood circulation)等。这些靶点主要调控的代谢通路为：cgmp-pkg信号通路(hsa04022,cgmp-pkg signaling pathway)、心肌细胞肾上腺素能信号通路(hsa04261,adrenergic signaling in cardiomyocytes)和钙离子信号通路(hsa04020,calcium signaling pathway)，这表明茯神可能通过作用于这些通路发挥治疗心律失常的作用。
[0088]
具体的，茯神木的go及kegg富集分析过程是采用上述的相同方法。最终，茯神木“成分-靶点”go富集分析共得到2053个条目，其中bp、cc、mf分别占到1887个、60个、106个条目。所涉及到的关键蛋白大多属于离子通道、跨膜转运相关受体；很有可能是通过调控相关离子通道活性从而参与心肌收缩、血液循环等生物学进程；kegg富集分析共得到223个条目，根据p值对富集结果进行排名，预测茯神木主要干预心肌肾上腺素能信号通路(adrenergic signaling in cardiomyocytes)、camp信号通路(camp signaling pathway)、心肌肥厚(hypertrophic cardiomyopathy)等通路。
[0089]
2.4“成分-靶点-通路”网络构建
[0090]
通过string平台绘制关键靶点的蛋白互作网络(protein to protein interaction，ppi)，整合ppi网络的蛋白互作信息、“中药-成分”、“成分-靶点”及“靶点-通路”信息，将数据导入cytoscape软件，关联构建“成分-靶点-通路”预测网络，以网络的节点和边线来描述化合物与靶点、通路、疾病之间的关系。
[0091]
本实施例中，采用cytoscape软件，构建茯神“成分-疾病-靶点”互作网络图(参见图5)。所构建的关联网络图中包括70个节点(1种疾病类型，11个成分，58个靶点)，图中以节
点大小表示度数大小，度数越大，说明该节点在网络中越重要。其中，度数较大的成分有腺苷(度数＝29)、棕榈酸(度数＝18)、辛酸(度数＝18)、月桂酸(度数＝17)、腺嘌呤(度数＝15)5个成分，说明茯神中的这5个成分可能为治疗心律失常的关键成分。同时，度数较大的靶点有adora1(度数＝23)、adrb2(度数＝21)、adora2b(度数＝19)、adra1a(度数＝11)等34个靶点，提示这些靶点可能为治疗心律失常疾病的关键靶点。
[0092]
本实施例中，采用cytoscape软件，构建的茯神木“成分-靶点-通路”网络(参见图6)，度值排名较前的靶点有二型兰尼碱受体(ryanodine receptor 2，ryr2)、l-型电压依赖钙离子通道α1c亚基(calcium channel，voltage-dependent，l type，alpha 1c subunit，cacna1c)、l-型电压依赖钙离子通道α1d亚基(calcium channel，voltage-dependent，l type，alpha 1d subunit，cacna1d)等。
[0093]
3、基于代谢组学的茯神/茯神木治疗斑马鱼心律失常代谢组富集分析
[0094]
3.1模型建立
[0095]
由于化学药物氯化钡能促使浦氏纤维的na

的通透性，促进na

内向电流，抑制k

外流，提高动作电位4相舒张期的除极速率，最大舒张电位的绝对值降低，与阈电位的差距减小，自律性提高，从而诱发心律失常，是一种筛选抗心律失常药物的模型，因此，本实施例采用化学药物氯化钡建立斑马鱼心律失常模型。
[0096]
具体的，取氯化钡1mg，精密称定，置10ml斑马鱼培养液里，现用现配。取60枚受精后发育正常的斑马鱼胚胎放置在48孔板中，设置6个浓度，2孔/浓度，5枚/孔，每孔加入1ml氯化钡溶液，给药24h，记录斑马鱼胚胎的存活数，spss 26.0软件中的回归分析法计算得氯化钡的lc50为0.042mg/ml-1。设置氯化钡给药浓度为1/20lc50(0.0021mg
·
ml-1)建立斑马鱼心律失常模型，给药24h。
[0097]
3.2分组及给药方法
[0098]
将72hpf斑马鱼胚胎随机分为空白组(control)，模型组(氯化钡2.1μg/ml)，盐酸维拉帕米注射液阳性给药组(0.45μg/ml)，茯神高、中、低剂量组，茯神木高、中、低剂量组等9个组，每组30枚，每孔10ml溶液，给药组中加入氯化钡和茯神/茯神木提取液的混合液(氯化钡溶液：茯神/茯神木提取液＝1:1，v/v)，各组斑马鱼给药24h。茯神高、中、低给药组剂量分别为162.6μg/ml、121.95μg/ml和97.56μg/ml。给药24小时后，吸出药液，用pbs冲洗斑马鱼胚胎数次，将一滴3％的甲基纤维素滴于载玻片上，用一次性吸管吸取斑马鱼，将其滴于甲基纤维素表面，调整斑马鱼姿势，尽量使两侧眼、体节重合。用电子显微镜对斑马鱼心脏形态进行观察及记录。
[0099]
3.3茯神/茯神木对心律失常斑马鱼干预作用分析
[0100]
3.3.1斑马鱼心脏形态观察
[0101]
给药24h后，将药液吸出，用培养液冲洗斑马鱼数次。在载玻片上滴一滴3％甲基纤维素，用吸管吸取斑马鱼，竖直放置待斑马鱼下沉到管口，轻轻挤压稍许滴到甲基纤维素表面，用发圈拨动斑马鱼，使两侧眼、体节重合，尾部和身体处于同一水平面。采用电子显微镜，在明场状态下观察斑马鱼的心脏形态(结果参见图7和图9)；通过image j软件计算各组斑马鱼心包充血面积(结果参见图8和图10)。
[0102]
图8和图10中，
**
：和对照组相比，p《0.01；
##
：和模型组相比，p《0.01。
[0103]
通过电子显微镜，在明场状态下观察茯神/茯神木给药处理后氯化钡诱发的斑马
鱼心脏发育状态。结果显示，与对照组相比，模型组斑马鱼心脏部位大量充血；而茯神/茯神木低、中、高剂量给药组充血明显逐渐减弱。进一步表明茯神/茯神木在一定程度上可以减弱氯化钡诱发斑马鱼的心脏充血程度。
[0104]
3.3.2静脉窦-动脉球间距测量
[0105]
通过测量静脉窦与动脉球(sv-ba)之间的距离可量化药物对斑马鱼心脏的影响程度。本实施例采用电子显微镜观察各组斑马鱼的心脏形态，通过image j软件测量sv-ba两者间的距离(结果参见图11和图12)。
[0106]
图11和图12中，
**
：和对照组相比，p《0.01；
##
：和模型组相比，p《0.01。
[0107]
结果显示，与对照组相比，模型组斑马鱼sv-ba间距离显著。与模型组相比，阳性对照组两者间的距离显著缩短，茯神/茯神木高、中、低剂量组sv-ba间距显著缩短，且呈现剂量依赖性，这表明茯神/茯神木皆可缩短氯化钡诱发的斑马鱼sv-ba间距。
[0108]
3.3.3心肌细胞凋亡程度观察
[0109]
采用吖啶橙染色法检测给药处理后各组斑马鱼的心肌细胞凋亡情况。取各组给药处理至96h的斑马鱼，移去药液，用培养液冲洗3次，采用2.5mg/l吖啶橙染液避光染色30min，而后用磷酸盐缓冲液(pbs,ph 7.4)冲洗2次。将染色过后的斑马鱼置于滴有3％甲基纤维素的双凹载玻片中，调整至侧卧位，在电子荧光显微镜下观察(结果参见图13和图15)，荧光显微镜使用绿光光源，再通过image j软件计算平均荧光密度(结果参见图14和图16)，以进一步评估茯神对斑马鱼心肌细胞凋亡程度的影响。
[0110]
图14和图16中，
**
：和对照组相比，p《0.01；
##
：和模型组相比，p《0.01。
[0111]
结果发现，空白对照组斑马鱼心脏处无明显颗粒状荧光斑点，与空白组相比，模型组斑马鱼心脏部位出现大量绿色碎片颗粒。与模型组相比，茯神低、中、高剂量给药组心脏部位绿色碎片颗粒逐渐减少。模型组斑马鱼的平均荧光密度比对照组高1.52倍。和模型组相比，茯神/茯神木各给药组平均荧光密度显著降低，提示茯神/茯神木在一定程度上抑制了心肌细胞的凋亡。
[0112]
3.4茯神/茯神木调节心律失常斑马鱼体内代谢物水平分析
[0113]
分组及给药：将180枚3hpf的ab系斑马鱼胚胎分成空白对照组、模型组、阳性给药组以及茯神木高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组30枚，置于标准六孔板中。
[0114]
给药方式同上述步骤2.1中的给药方式。给药24小时后，将每组30枚的胚胎分别转移至1.5ml离心管中，用pbs清洗后数次后，加入1ml80％的甲醇溶液(在-80℃预冻30分钟)，匀浆，12000r
·
min-1
离心10分钟，取出上清液，真空干燥，进样前用250μl乙腈和水的混合液(乙腈：水＝1:1，v/v)对得到的干燥样品进行复溶。重复实验三次。
[0115]
采用uplc-tof-ms技术进行非靶向代谢组学分析，c
18
液相色谱柱(acquityhss t3 c18 2.1
×
100mm,1.8μm)，柱温保持在30℃，流动相为0.05％甲酸水(溶剂a)，1:1的乙腈和异丙醇(溶剂b)。梯度洗脱程序为：1％-60％b(0-23min)；60％-98％b(23-24min)；98％b(24-27min)；98％-1％b(27-27.1min)；1％b(27.1-33min)。流速设置为0.3ml
·
min-1
，进样体积为5μl。质谱参数与步骤2.2中所述的质谱参数相同。
[0116]
将所得色谱峰信息(.wiff file)导入multiquant 3.0.2application(ab sciex)进行峰面积积分、峰对齐等处理，获得包括样品名称、化合物名称、峰面积、保留时间在内的整齐矩阵，通过excel software(microsoft office)进行missing value分析，删除缺失值
超过80％样本的代谢物，其余缺失值用最小信号的1/2进行补空。将各组数据矩阵以.csv格式导入metaboanalyst的statistical analysis模块进行分析。首先采用通过偏最小二乘法(partial least squares method,pls)建立监督分析模型，以评估两组样本的分类情况。以pls模型中变量重要性投影(variable importance in the projection,vip)识别两组间具有差异的代谢物，选择vip》1的代谢物进行t检验，以p《0.05为差异有统计学意义。将满足vip》1且p《0.05的代谢物确定为差异代谢物。其次对各给药组数据建立主成分分析(principal components analysis,pca)模型，以观察茯神/茯神木的治疗趋势。
[0117]
根据偏最小二乘(pls)模型vip参数评价潜在的生物标志物，筛选对分组贡献度最大(vip》1.0)且t检验p《0.05的变量作为潜在差异代谢物，正负离子模式下共鉴定出21个潜在差异代谢物(见表1)，包括氨基酸类成分如l-tyrosine、l-valine、l-tryptophan、indoleacrylic acid、l-histidine和胆碱类成分glycerophosphocholine、l-acetylcarnitine以及三磷酸腺苷adenosine triphosphate等。
[0118]
与对照组相比，模型组中的l-valine、l-tryptophan、indoleacrylic acid等氨基酸类成分和ureidosuccinic acid、glutathione、benzocaine、inosinic acid、ascorbic acid等代谢水平显著升高，而adenosine triphosphate、triamterene、citric acid、l-tyrosine等代谢水平显著降低。
[0119]
表1心律失常斑马鱼体内发生紊乱的潜在差异代谢物
[0120]
[0121][0122]
对对照组、模型组、阳性组和茯神/茯神木高、中、低剂量组中的差异代谢物数据进行主成分分析(principal components analysis,pca)，结果参见图17和图18。
[0123]
从结果显示看出，对照组、模型组、阳性对照组和茯神给药组组间样本聚类明显，且茯神/茯神木高剂量组和中剂量组向对照组靠近，而偏离模型组，说明茯神/茯神木给药处理在一定程度上可以调节心律失常斑马鱼体内差异代谢物紊乱。
[0124]
3.5网络药理学-代谢组学整合研究
[0125]
通过metaboanalyst中的joint pathway analysis模块分别对网络药理学预测得到的茯神相关58个关键靶点和代谢组学分析得到的17个差异代谢物；茯神木相关29个关键靶点和12个差异代谢物进行关联富集。综合match status、p值、fdr以及impact值等参数，寻找茯神/茯神木治疗心律失常所干预的关键通路。
[0126]
关联分析结果显示，共富集出与茯神治疗相关的72条代谢通路(p＜0.05)，其中cgmp-pkg代谢通路显著性最高，adora1是该通路与治疗相关的关键靶点，其关联代谢物为三磷酸腺苷(atp)及其下游代谢物腺苷和环腺苷酸(camp)。茯神木相关关键靶点和差异代谢物关联富集结果显示心肌肾上腺素能信号通路是茯神木抗心律失常过程中参与调控的最为重要的通路，其中关键靶点为ryr2，其关联代谢物为肾上腺素和环磷腺苷。
[0127]
4、茯神/茯神木治疗关键靶点验证及关联代谢物定量分析
[0128]
4.1茯神/茯神木治疗关键靶点验证
[0129]
给药结束后取斑马鱼胚胎，每组30枚，用trizol reagent试剂提取总rna，稀释至100-500ng/μl，取含2μg rna的溶液加入到pcr管中，加入反应液及反转录酶等，实现反转录，加入引物等制得反应体系，进行pcr的扩增。用于聚合酶链式反应的引物如下：
[0130]
茯神：adora1，ttctgacccaaagttccatcct(正向)和ctcaaactggcaggtgacgat(反向)
[0131]
茯神木：ryr2，aagacgcaacaggtgaggca(上游)，cgtgtaaactgccgttcccata(下游)
[0132]
将上述基因作为荧光定量模板，40次热循环后收集荧光信号，使用相对定量的方
法来确定表达值，使用循环阈值(ct)确定以上基因的表达水平，所有反应一式三份。
[0133]
参见图19和图20，茯神和茯神木的治疗关键靶点pcr结果表明，与对照组相比，模型组adora1 mrna水平降低了5.44倍(p《0.01)，与模型组相比，阳性对照组和茯神高、中、低剂量组adora1 mrna水平分别升高了4.20倍、3.62倍、2.84倍和2.54倍，这说明茯神可以使cgmp-pkg信号通路上adora1 mrna水平增强。
[0134]
4.2茯神/茯神木治疗关联代谢物定量分析
[0135]
4.2.1代谢物标准品制备
[0136]
茯神：取腺苷和cgmp对照品适量，精密称定，加入1:1甲醇水分别制成各对照品质量浓度均为0.1mg/ml的对照品储备溶液，保存在4℃。
[0137]
茯神木：取肾上腺素和环磷腺苷对照品适量，精密称定，加入1:1甲醇水分别制成各对照品质量浓度均为2mg/ml的对照品储备溶液，保存在4℃。
[0138]
4.2.2代谢样品收集与制备
[0139]
给药结束后，吸出药液，将各组斑马鱼胚胎分别置于1.5ml离心管中。加入1ml pbs溶液，用一次性滴管反复清洗斑马鱼数次，吸出pbs洗液，再加入1ml pbs溶液，以12000r/min的转速离心10min，吸出pbs洗液。然后加入1ml 80％甲醇萃取溶液，匀浆2min，再以12000r/min的转速于4℃离心10min，取上清，低温浓缩至干。最后，向干燥的样品中加入250μl溶液(乙腈：水＝1:1)涡旋1min，以12000r/min的转速离心10min，取上清
[0140]
4.2.3色谱条件
[0141]
采用超高效液相色谱串联三重四级杆线性离子阱质谱仪，以外标法对代谢产物进行定量测定。流动相为0.2％甲酸水溶液(a)，乙腈(b)。梯度洗脱程序为：流速为0.3ml/min，柱温40℃，进样量2μl；线性梯度时间：30min；梯度洗脱条件：0-1.5min，10％乙腈；1.5-23min，10％-99％乙腈；23-24min，99％乙腈；24-27min，99％-10％乙腈；27-30min，90％乙腈。
[0142]
4.2.3质谱条件
[0143]
采用esi正、负离子模式进行扫描，检测模式为多反应监测(multiple reaction monitoring，mrm)。正、负离子模式离子喷雾电压为 5500v,-4500v；离子源温度(tem)550℃，gs1和gs2为氮气，皆为50psi，气帘气(cur)35psi。化合物离子对优化采集参数：dp、ce和碰撞池出口电压(cell exit potential,cxp)等信息，如表2所示。所有数据使用analyst software进行分析，代谢物使用multiquant software进行量化。
[0144]
表2离子对质谱优化参数信息
[0145][0146]
4.2.4方法学考察
[0147]
(1)精密度
[0148]
为了确定仪器精密度良好，将代谢物标准品连续进样测定6次，分别计算各代谢物峰面积和保留时间的rsd值。腺苷和cgmp峰面积相对标准偏差分别为0.02％，0.08％，保留时间相对标准偏差为0％。肾上腺素及环磷酸腺苷峰面积相对标准偏差分别为1.61％，0.82％，保留时间相对标准偏差分别为0.49％，0.42％。
[0149]
(2)线性、检测限和定量限
[0150]
在对照组斑马鱼代谢样本除蛋白后定量加入混合标准溶液以获得质量控制qc样本，将其质量浓度分别稀释6个梯度浓度，在的色谱条件下，精密吸取2μl注入液相色谱仪，分别记录样本中代谢物峰面积，以对照品峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，计算各代谢物的回归方程。当信噪比大于3:1时，得检测限；当信噪比大于10:1时，得定量限。
[0151]
以浓度x为横坐标，峰面积响应值y为纵坐标拟合工作曲线。腺苷线性回归方程为y＝112.58x 1214，相关系数r为0.9994，cgmp线性回归方程为y＝3445x 599.45，相关系数r为0.9999，腺苷的检测限和定量限分别为3ng/ml和15ng/ml，cgmp的检测限和定量限分别为0.03ng/ml和0.1ng/ml。
[0152]
肾上腺素在0.03～100μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程式为：y＝2.44
×
105x-86279(r＝0.996)；环磷酸腺苷在60pg/ml～0.1μg/ml浓度范围内线性关系良好，线性方程式为：y＝4
×
106x 603.07(r＝0.999)。肾上腺素的定量检测限为30ng/ml，环磷酸腺苷的定量检测限为0.1ng/ml。
[0153]
(3)重复性
[0154]
通过将同一qc样本，平行制备6份，计算样本中代谢物峰面积的rsd值和保留时间的rsd值，来评估方法重复性。腺苷和cgmp峰面积的rsd值分别为0.10％和0.01％，保留时间rsd值分别为0.02％和0.01％。肾上腺素和环磷酸腺苷的峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)值分别为3.63％，2.01％，保留时间rsd值分别为0.10％，0.50％。
[0155]
(4)稳定性
[0156]
为了确定处理过的qc样本的稳定性，将样本保存在自动进样器中(4℃)，分别在0、24、48h时测定，记录峰面积，分别计算各代谢物峰面积和保留时间的rsd值。分析物在初始点(0h)的峰面积用作参考，以确定后续点的相对稳定性。腺苷和cgmp峰面积的rsd值分别为8.36％和2.87％，保留时间rsd值分别为0.01％和2.18％。肾上腺素和环磷酸腺苷的实测峰面积相对标准偏差分别为12.71％，2.42％，实测保留时间相对标准偏差为2.20％，2.22％。
[0157]
(5)基质效应
[0158]
基质效应是通过在对照组斑马鱼代谢样品除蛋白后加入混合标准溶液，将其峰面积与标准溶液中各标准物的峰面积进行比较。所有测定一式三份。腺苷和cgmp的基质效应分别为90.08％和85.80％。环磷酸腺苷的基质效应为90.02％，肾上腺素的基质效应为90.91％。
[0159]
4.2.5代谢物定量测定
[0160]
在优化的色谱条件下，以外标法对茯神治疗关联代谢物进行定量分析结果参见图21。图21中，
*
：和对照组相比，p《0.05；
**
：和对照组相比，p《0.01；
#
：和模型组相比，p《
0.05；
##
：和模型组相比，p《0.01。
[0161]
图21的结果显示，与对照组相比，模型组中腺苷和cgmp代谢水平分别降低了2.72倍、7.30倍(p＜0.01)；而与模型组相比，茯神高剂量组腺苷和cgmp的代谢水平分别升高了1.76倍、3.31倍，中剂量组分别升高了1.67倍、2.60倍，低剂量组分别升高了1.42倍、1.79倍，且高、中、低剂量组之间存在一定的剂量相应，说明茯神给药处理可以提高cgmp-pkg信号通路上腺苷和cgmp这两个代谢物水平。
[0162]
茯神木治疗关联代谢物定量分析，结果参见图22。图22中，##表示p＜0.01，空白对照组相较于模型组，**表示p＜0.01，各给药组相较于模型组。
[0163]
图22的结果显示，模型组中肾上腺素及环磷酸腺苷的水平相较空白对照组显著升高(p＜0.01)，分别高出空白组1.2倍、0.8倍，可以考虑将肾上腺素及环磷酸腺苷作为判断斑马鱼心律失常发生与否的生物标志物，而茯神木给药组对肾上腺素及环磷酸腺苷有明显的恢复作用，我们认为茯神木可以通过抑制肾上腺素能信号通路上儿茶酚胺类化合物肾上腺素的异常升高，调控第二信使环磷酸腺苷的水平，从而降低心律失常发生及进一步恶化的风险。
[0164]
5、茯神及茯神木作用靶点及机制差异分析
[0165]
本实施例提供的基于针对同基源不同用药部位药材功能靶点快速筛选的方法，通过比较同基源不同药用部位药材间功能靶点的差异，以此阐明其作用机制的差异。
[0166]
参见图23，上述研究结果显示，茯神可通过调控cgmp-pkg信号通路上的蛋白和代谢物发挥治疗心律失常的作用。腺苷受体adora1蛋白激活后与gi蛋白偶联，促进磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶b(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase b,pi3k/akt)信号通路的发生。研究表明，pi3k/akt/enos信号通路具有抗氧化、抗凋亡等心肌保护作用。no是调节心脏舒张的因子，其生成过程是l-精氨酸在一氧化氮合酶(nos)的催化下合成no和l-瓜氨酸，钙离子进入细胞与钙调蛋白结合形成复合物激活enos，产生的no扩散到细胞间隙，穿过临近靶细胞的细胞膜，激活sgc，将gtp转化成cgmp。cgmp激活最重要的下游靶点pkg i，活化的pkg i作用于其下游目标，可调节心肌细胞中的三磷酸肌醇受体(inositol triphosphate receptor,ip3r)，增强肌浆网对钙离子的再摄取，进而抑制血小板活化、减少细胞凋亡以及对心肌细胞的负性肌力作用而保护心血管系统。研究表明，cgmp-pkg信号途径在预处理和后处理的心脏保护机制中发挥重要的作用，可通过防止细胞坏死诱导的应激，减少细胞凋亡以及对心肌细胞的负性肌力作用而保护心血管系统，降低心律失常的发生，以上研究表明，茯神可通过上调cgmp-pkg信号通路上腺苷、cgmp的代谢水平以及关键蛋白adora1 mrna的表达水平，发挥治疗心律失常的作用。
[0167]
参见图24，茯神木靶点及代谢通路分析结果显示，心肌肾上腺素能信号通路是茯神木发挥抗心律失常作用时干预最多的通路，结合ppi网络分析结果，我们认为ryr2是茯神木作用的一个重要靶点。ryr2作为目前已知的位于心肌细胞肌浆网上最大的钙离子通道，对调节胞浆内的钙离子水平具有重要的作用。一般情况下，舒张期胞浆内的低钙浓度使ryr2通道处于关闭状态，当冲动传至心肌细胞上，位于细胞膜上的l-钙离子通道开放，少量钙离子内流，内流的钙离子激动ryr2蛋白，使钙离子释放通道开放，肌浆网中钙离子通过ryr2通道大量释放入胞内，引起心肌细胞收缩。当ryr2的表达出现异常时，往往导致其通道的开放频率异常，最终出现舒张期钙渗漏，引发异位放电，从而导致心律失常的发生和维
持，钙渗漏还直接引起心肌细胞内肌浆网(sarcoplasmicreticulum,sr)中钙离子浓度和钙瞬变幅度的降低，继而产生致心律失常性钙波。camp作为第二信使通过激活pka，使心肌细胞ryr2磷酸化。在camp信号传递途径中，每个激活的受体可以活化多个g蛋白，每个g蛋白激活1个ac，而每个ac可催化生成大量的camp分子，信号得以放大。胞内信使camp又可通过pka以及随后的酶激活系统，催化大量酶底物，信号进一步放大数千倍。这样，整个信息传递系统不仅能将胞外信号跨膜传递至胞内，而且在一系列连锁反应中使信号逐级放大，形成一个高效能的生物放大系统。因此我们认为，茯神木可以通过阻断ryr2磷酸化过程中肾上腺素及camp这两个关键环节，从而抑制肌浆网钙离子渗漏，扭转心律失常进程。