一种检测药物西地那非和N-去甲基西地那非的方法与流程

一种检测药物西地那非和n
‑
去甲基西地那非的方法
技术领域
1.本发明属于药物浓度检测领域，具体涉及一种采用高效液相色谱串联质谱技术测定人血浆西地那非和n
‑
去甲基西地那非的方法。


背景技术：

2.枸橼酸西地那非是一种 5 型磷酸二酯酶（pde5）抑制剂，pde5 在阴茎海绵体中高度表达。当性刺激引起局部一氧化氮（no）释放时，no 激活鸟苷酸环化酶，导致环磷酸鸟苷（cgmp）水平增高，使海绵体平滑肌松弛，血液流入而使阴茎勃起。西地那非通过选择性抑制 pde5，升高环磷酸鸟苷（cgmp）水平而导致阴茎海绵体平滑肌松弛，从而对阴茎血流水平进行调控。枸橼酸西地那非临床上用于治疗勃起功能障碍（ed），能安全有效地改善各种 ed 患者的勃起功能。
3.枸橼酸西地那非片的原研单位为辉瑞（pfizer）制药有限公司，于 1998 年 3 月在美国批准上市，商品名为 viagra
®
。1998 年 9 月在欧洲批准上市，1999 年在日本上市。2000 年进口 中国，2007 年原研地产化品种上市，商品名为万艾可
®
。
4.目前西地那非和n
‑
去甲基西地那非治疗药物检测的常见方法有：紫外分光光度法、高效液相色谱法。这些方法存在前处理复杂、定性定量不够准确、成本高、分析时间长、或对实验人员技术要求高等问题。液相色谱串联质谱（lc
‑
ms/ms）越来越广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域。lc
‑
ms/ms具有灵敏度高，选择性强，准确性好等特点，在临床检测上适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围，是其他方法无可比拟的。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱（lc
‑
ms/ms）技术检测人血浆中西地那非和n
‑
去甲基西地那非药物的含量的检测方法，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。
6.本发明所述的一种采用高效液相色谱串联质谱技术能分别定量检测血浆中西地那非和n
‑
去甲基西地那非的方法，包括以下步骤：（1）血浆样品预处理在黄光冰浴条件下，移取 100 μl 样品至96 孔板中，加入 10 μl氘代内标工作溶液，加入390 μl 的0.5%氨水甲醇溶液，将样品涡旋5分钟后，在 4000 rpm、4
°
c条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液 150 μl 至 96 孔板中，使用 150 μl 含0.5%氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋5分钟，在 4000 rpm、4
°
c 条件下离心5分钟，得到待测样品。
[0007]
（2）标准曲线和质控血浆样品的配制使用甲醇配制标曲和质控工作溶液，取上述工作溶液10μl与490 μl空白生物基质混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，用西地那非和n
‑
去甲基西地那非和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程。
[0008]
（3）采用液相色谱
‑
质谱联用检测
液相色谱条件：色谱柱：titank c18 5u 50*2.1mm；流动相：水相：5mmol/l乙酸铵溶液，有机相：乙腈，洗针液：甲醇：乙腈：异丙醇：水：甲酸（1:1:1:1:0.0004）溶液；柱温：35℃；自动进样器温度：4℃；采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为4 min，进样体积为2 ml，流速为0.5 ml/min，流动相梯度洗脱参数如下：0 min，20%有机相；2.5 min，90%有机相；3.4 min，90 %有机相；3.5 min，20%有机相；4 min，停止。
[0009]
质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用选择反应监测模式，正离子化方式，离子化电压 (ion)： 3500v，鞘气 (sheath gas)：60 arb，辅助气 (aux gas)：15arb，尾吹气 (sweep gas)：2arb，离子传输管温度 (ion transfer tube temp)：380℃，蒸发器温度 (vaporizer temp)：350℃，循环时间 (cycle time)：0.4sec，离子对分别为：m/z 475.3
→
283.19 (sildenafil)，碰撞能量（ce）和射频电压（rf）分别为39 v和119 v，m/z 483.37
→
283.19 (sildenafil
‑
d8)， 碰撞能量（ce）和射频电压（rf）分别为39v和116 v，m/z 461.3
→
283.17 (n
‑
desmethyl sildenafil)，碰撞能量（ce）和射频电压（rf）分别为38v和108 v，m/z 469.34
→
283.18 (n
‑
desmethyl sildenafil
‑
d8)，碰撞能量（ce）和射频电压（rf）分别为40v和105 v。
[0010]
（4）待测血浆中各物质的浓度测定将待测血浆按步骤（1）样品制备的方法制备，取待测样品按步骤（3）采用液相色谱
‑
质谱联用检测的方法检测，将测得的西地那非和n
‑
去甲基西地那非和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中西地那非和n
‑
去甲基西地那非的浓度。
[0011]
有益效果：本研究建立了一种高效液相色谱串联质谱技术（lc
‑
ms/ms），分别测定人体血浆中西地那非和n
‑
去甲基西地那非的方法。采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。本发明采用蛋白沉淀，前处理过程简单，灵敏度高，单个样品分析时间短，大大降低了耗材成本，缩短了操作时间，采用稳定的同位素内标定量结果准确，所有验证项均满足法规要求，在本发明条件下西地那非和n
‑
去甲基西地那非可准确定量，可用于临床药代动力学研究，为相应的药物浓度监测提供了一种稳定、可靠、简便的检测方法。
附图说明
[0012]
图1为西地那非代表性标准曲线图；图2为n
‑
去甲基西地那非代表性标准曲线图。
具体实施方式
[0013]
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
[0014]
仪器：tsq altis三重四级杆质谱仪（美国thermo公司），vanquish uhplc超高效液相系统（美国thermo公司）；xpr2百万分之一天平（瑞士mettler公司）；万分之一天平（双杰电子）；milli
‑
q纯水仪（默克化工）；centrifuge 5810r离心机（eppendorf，hettich）；可调
移液器（eppendorf 2
‑
20μl，10
‑
100μl，20
‑
200μl，100
‑
1000μl）；96孔板、样品瓶等。
[0015]
空白基质、试剂和对照品：本发明所用空白基质均来自于长沙泰和医院；乙腈（hplc，merck），水为自制超纯水，甲醇（hplc，merck），甲酸（hplc，dikma），乙酸铵（ar，永华化学），氨水（hplc，aladdin），异丙醇（hplc，merck）；枸橼酸西地那非（中国食品药品检定研究院，420012
‑
202003，含量98.9%）和n
‑
去甲基西地那非（tlc，2617
‑
056a6，含量98.4%），西地那非
‑
d8（tlc，1390
‑
029a2，含量98.4%）和n
‑
去甲基西地那非
‑
d8（tlc，1180
‑
021a4，含量98.2%）。
[0016]
实施例1 实验过程1.血浆样品预处理；移取 100 μl 样品（空白样品和内标空白样品加100μl空白生物基质）至96 孔板中，加入 10 μl氘代内标工作溶液（空白样品加入10 μl甲醇：水（1:1）代替），加入390 μl 的0.5%氨水甲醇溶液，将样品涡旋5分钟后，在 4000 rpm、4
°
c条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液 150 μl 至 96 孔板中，使用 150 μl 含0.5%氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋5分钟，在 4000 rpm、4
°
c条件下离心5分钟，交由lc
‑
ms/ms进样分析。
[0017]
标准曲线和质控血浆样品的配制（1）西地那非和n
‑
去甲基西地那非储备液和工作溶液的配制：西地那非和n
‑
去甲基西地那非储备液a（s
‑
ss
‑
a）精密称取枸橼酸西地那非对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为1.00 mg/ml的储备液s
‑
ss
‑
a（使用校正因子）。
[0018]
n
‑
去甲基西地那非储备液a（n
‑
d s
‑
ss
‑
a）精密称取n
‑
去甲基西地那非对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为1.00 mg/ml的储备液n
‑
d s
‑
ss
‑
a（使用校正因子）。
[0019]
③
储备液b（ss
‑
b）取1.50ml的s
‑
ss
‑
a和0.750mln
‑ꢀ
d s
‑
ss
‑
a加到0.750ml的甲醇溶液中，混合均匀配制成储备液ss
‑
b（西地那非500 μg/ml/ n
‑
去甲基西地那非 250 μg/ml）。
[0020]
④
储备液c（ss
‑
c）取0.0600 ml的ss
‑
b加到2.94ml甲醇中，混合均匀配制成储备液ss
‑
c（西地那非10.0 μg/ml/ n
‑
去甲基西地那非5.00 μg/ml的）。
[0021]
表1：按照下表使用甲醇配制标曲和质控工作溶液，标曲和质控工作液来自于不同的储备液以下表为指导，用甲醇为溶剂来配制标准曲线工作液
ꢀ
以下表为指导，用甲醇为溶剂来配制质控工作液（3）内标储备液及工作液配制：
①
西地那非
‑
d8内标储备液a（s
‑
is
‑
a）将西地那非
‑
d8对照品用适量的甲醇溶解，配制成浓度为4.00 mg/ml的内标溶液（使用校正因子）。移取200 μl该溶液加入至600 μl甲醇中，配制成浓度为1.00 mg/ml的内标储备液储备液s
‑
is
‑
a。
[0022]
②
n
‑
去甲基西地那非
‑
d8内标储备液a（n
‑ꢀ
d s
‑
is
‑
a）将n
‑
去甲基西地那非
‑
d8对照品用适量的甲醇溶解，配制成浓度为4.00 mg/ml的内标溶液（使用校正因子）。移取200 μl该溶液分加入至600 μl甲醇中，配制成浓度为1.00 mg/ml的内标储备液储备液n
‑ꢀ
d s
‑
is
‑
a。
[0023]
③
内标储备液b（is
‑
b）分别取0.100 ml的s
‑
is
‑
a和0.0500 ml的n
‑ꢀ
d s
‑
is
‑
a加到4.85ml甲醇溶液中，混合均匀配制成西地那非
‑
d8 20.0 g/ml/ n
‑
去甲基西地那非
‑
d8 10.0 g/ml的内标储备溶液is
‑
b。
[0024]
④
内标溶液c（is
‑
c）（使用前新鲜配制）取0.100 ml的is
‑
b加到3.90 ml的甲醇：水(1:1)溶液中，混合均匀配制成西地那非
‑
d8 500 ng/ml/ n
‑
去甲基西地那非
‑
d8 250 ng/ml的内标工作溶液is
‑
c。
[0025]
（4）标准曲线和质控血浆样品的配制：各取上述工作溶液10μl与490 μl空白生物基质混合配制成不同浓度的标准曲线
样品和质控样品，标曲浓度分别为：4.00/2.00 ng/ml、8.00/4.00 ng/ml、20.0/10.0 ng/ml、80.0/40.0 ng/ml、250/125 ng/ml、600/300 ng/ml、900/450 ng/ml、1000/500 ng/ml；质控浓度分别为：4.00/2.00 ng/ml、12.0/6.00 ng/ml、60.0/30.0 ng/ml、500/250 ng/ml、800/400 ng/ml、4000/2000 ng/ml）。
[0026]
检测：（1）液相色谱条件：流动相：水相：5mmol/l乙酸铵溶液，有机相：乙腈，洗针液：甲醇：乙腈：异丙醇：水：甲酸（1:1:1:1:0.0004）溶液；柱温：35℃；自动进样器温度：4℃；采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，详见表3，每个样品采集时间为5min，进样体积为10 ml，流速为0.5 ml/min。
[0027]
表3：流动相梯度洗脱参数时间（min）02.53.43.54.0%有机相20909020stop（2）质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描的负离子模式，待测物及内标相应的质谱参数见表4。
[0028]
表4：质谱参数4.待测血浆中各物质的浓度测定：将待测血浆按步骤（1）样品制备的方法制备，取待测样品按步骤（3）采用液相色谱
‑
质谱联用检测的方法检测，用西地那非和n
‑
去甲基西地那非和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程，将测得的西地那非和n
‑
去甲基西地那非和各自内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中西地那非和n
‑
去甲基西地那非的浓度。
[0029]
实施例2 方法学考察：（1）准确度和精密度试验：各取上述对应工作液10 μl与490 μl空白基质混合，配制成lloq、lqc、gmqc、mqc、hqc 5个不同浓度的质控样品，每个浓度6个重复，随行新鲜配制的标准曲线进行测定，结果显示，西地那非re%在
‑
2.20~4.17之间，%cv在2.25~5.42之间；n
‑
去甲基西地那非，re%在
‑
2.91~5.63之间，%cv在2.67~4.30之间。
[0030]
（2）基质效应、提取回收率试验：以至少6个不同来源的空白人血浆制备的空白样品，前处理后加入一定量的待测物和内标，使其最终浓度分别与lqc、hqc的进样浓度一致，同时配制含有一定量待测物和内标的纯溶液，其最终浓度分别与lqc、hqc的进样浓度一致，每个浓度平行测定至少6份。对于每个来源基质，应该通过计算基质存在下的峰面积（由空白人血浆前处理后加入待测物和内标测得），与不含基质的样品（待测物和内标的纯溶液）相应峰面积平均值的比值，计算每一待测物和内标的基质因子。进一步通过待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。结果显示，西地那非内标归一化基质效应因子分别为1.00和1.01，%cv分别为1.40和0.83；n
‑
去甲基西地那非经内标归一化基质效应因子分别为0.938和0.961，%cv分别为2.31和1.78。
[0031]
（3）回收率试验：6个重复的lqc、mqc、hqc与18个混合空白血浆样品一同处理。处理后，将含有待测物和内标的溶液加入空白样品中，以使其最终浓度与高、中、低质控样品的进样浓度一致。通过比较单个质控样品中待测物或内标响应值与前处理后加入待测物、内标的空白样品的响应值的平均值来评价回收率。结果显示，西地那非待测物提取回收率分别为84.75%、83.52%、82.32%，%cv分别为2.04、1.80、1.68，内标提取回收率为99.69%，%cv为3.45；n
‑
去甲基西地那非待测物提取回收率分别为84.42%、83.54%、78.40%，%cv分别为4.96、1.75、3.48，内标提取回收率为98.3%，%cv为3.29。
[0032]
（4）稳定性试验：稳定性试验考察了稳定性样品在不同条件下（前处理过程中，制备后，冻融循环，长期稳定性，全血中）放置一段时间后，用新鲜配置的标准曲线定量稳定性样品与理论浓度的偏差，结果表明，西地那非和n
‑
去甲基西地那非基质样品在不同条件下放置一段时间后均保持稳定。
[0033]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。