一种鳜卵子的体外保存液及其应用的制作方法

1.本发明提出一种鳜卵子的体外保存液及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.随着我国鳜鱼资源量的逐步减少，针对鳜鱼的遗传改良工作在各地广泛进行。鳜由于性成熟的时间差异较大，杂交工作对性腺成熟度要求较高，过熟或未完全成熟都将严重影响杂交育种繁殖受精率。
3.鱼类主要为体外受精、体外发育的繁殖方式。真骨鱼类的卵巢为封闭型卵巢，由卵巢腹膜所形成的卵巢膜包围，成熟的卵子不落在腹腔而落于卵巢腔中，经输卵管输出体外。鱼类卵子在排出体外后，会发生形态和生物化学变化，从而导致卵子的活力下降。因此，如何在水产养殖工作中延长鱼类卵子的活力时间显得越来越重要。温度、光照、氧气、ph、保存液等多种因素均会影响鱼类卵子短期保存的效果。成熟排出的鱼类卵子外面包有透明胶状的卵胶膜，一方面能起到防御保护的作用，另一方面卵胶膜内的胶质具有维持渗透压等作用，确保卵子处于最佳的受精状态。卵子在卵巢液中较为稳定，但是鱼类卵巢液少，获取量有限。鳜在人工催产过程中常出现雌鱼产卵和雄鱼产精不同步的问题，如何在短期内保持卵子的活力，开展卵子体外操作时，维持卵子的较高受精率和孵化率，是鳜人工繁殖中必须要解决的一个实际问题。因此，如何设计一种鳜卵子的体外保存液，成为本领域技术人员有待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是：提供一种适用于维持鳜卵子活力的体外保存液及其应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
6.一种鳜卵子的体外保存液，按照体积分数计其包含以下各组分：培养液60％～70％、营养液15％～20％、鱼卵巢液9％～23％和抗菌液1％～2％。
7.上述的鳜卵子的体外保存液，优选的，所述体外保存液按体积分数计其包含以下各组分：培养液65％、营养液17.5％、鱼卵巢液16％和抗菌液1.5％。
8.优选的，所述培养液包括以下各组分及其浓度：甘氨酸500～600mg/l、葡萄糖1000～2000mg/l、hepes800～1200mg/l、磷酸二氢钠200～400mg/l、氯化钾170～380mg/l、硫酸镁200～230mg/l、氯化钠5000～7250mg/l、氯化钙110～130mg/l、碳酸氢钠2000～2500mg/l。
9.优选的，所述营养液按体积分数计其包含以下各组分：牛血清白蛋白40％和鱼血清60％。
10.优选的，所述牛血清白蛋白包括以下组分及其浓度：牛血清白蛋白200～1000mg/l。
11.优选的，所述鱼血清通过以下方法得到：将鱼的血液收集于离心管中，4℃下静置4
～5小时，然后吸取析出血清，4℃、4500rpm离心5～7分钟，在无菌超净工作台中使用0.22微米滤器过滤后收集，于
‑
20℃保存。
12.优选的，所述鱼卵巢液由以下方法得到：将鱼卵在4℃、8500～9000rpm离心8～10分钟，收集上清液，于
‑
80℃保存。
13.优选的，所述抗菌液包括以下各组分及其浓度：青霉素300000～350000iu/l，硫酸链霉素200～400mg/l。
14.优选的，所述鳜卵子的体外保存液的ph值为7.8～8.2，采用磷酸二氢钠作为ph调节剂。
15.本发明还提供了一种鳜卵子的体外保存液的应用，将离体的成熟鳜卵子浸泡于所述的鳜卵子的体外保存液中，浸泡条件为0.8～1毫升/150～200粒，16～20℃下浸泡2～3小时。在此条件下浸泡的离体成熟鳜卵子的形态完整、卵胶膜结构也无明显变化，且受精率在90％以上、孵化率在89％以上，畸形率在0.5％以下。
16.有益效果
17.本发明提出了一种鳜卵子的体外保存液及其应用，能够有效的维持卵胶膜的结构，确保卵子的活力，保证了卵子的受精能力，实现了鳜卵子的短期保存，经保存后的鳜卵子受精率在90％以上、孵化率在89％以上，畸形率在0.5％以下，解决了鳜雌雄催产效应时间不同步所带来的技术难题。
具体实施方式
18.下面给出实施例并对本发明进行具体描述。此次公开的实施方式可以认为在所有方面均为例示，不具限制性。本发明的范围不受以下实施方式的说明所限，仅由权利要求书的范围所示，而且包括与权利要求范围具有同样意思及权利要求范围内的所有变形。
19.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
20.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
21.实施例1：鳜卵子体外保存液的配制
22.一种鳜卵子的体外保存液，其配方包括以下各组分及其体积分数：培养液60％～70％、营养液15％～20％、鱼卵巢液9％～23％和抗菌液1％～2％。
23.其中，培养液配方：甘氨酸500～600mg/l、葡萄糖1000～2000mg/l、hepes800～1200mg/l、磷酸二氢钠200～400mg/l、氯化钾170～380mg/l、硫酸镁200～230mg/l、氯化钠5000～7250mg/l、氯化钙110～130mg/l、碳酸氢钠2000～2500mg/l。
24.其中，营养液包括以下各组分及其体积分数：牛血清白蛋白40％和鱼血清60％。
25.其中牛血清白蛋白配方：牛血清白蛋白500～1000mg/l。
26.鱼血清通过以下方法得到：将鱼的血液收集于离心管中，4℃下静置4～5小时，然后吸取析出血清，4℃、4500rpm离心5～7分钟，在无菌超净工作台中使用0.22微米滤器过滤后收集，于
‑
20℃保存。
27.鱼卵巢液通过以下方法得到：将鱼卵在4℃、8500～9000rpm离心8～10分钟，收集
上清液，于
‑
80℃保存。
28.其中，抗菌液配方：青霉素300000～350000iu/l，硫酸链霉素200～400mg/l。
29.采用磷酸二氢钠作为ph调节剂，调节鳜卵子的体外保存液的ph值为7.8～8.2。
30.实施例2：最佳保存液各组分及其体积分数
31.依据培养液、营养液、鱼卵巢液和抗菌液的不同配比，设计了三种不同体积分数的混合实验，实验组一包含以下各组分及其体积分数：培养液60％、营养液15％、鱼卵巢液23％和抗菌液2％，实验组二包含以下各组分及其体积分数：培养液65％、营养液17.5％、鱼卵巢液16％和抗菌液1.5％，实验组三包含以下各组分及其体积分数：培养液70％、营养液20％、鱼卵巢液9％和抗菌液1％。
32.其中，培养液配方：甘氨酸550mg/l、葡萄糖1500mg/l、hepes1000mg/l、磷酸二氢钠300mg/l、氯化钾280mg/l、硫酸镁220mg/l、氯化钠6000mg/l、氯化钙120mg/l、碳酸氢钠2300mg/l。
33.其中，营养液包括以下各组分及其体积分数：牛血清白蛋白40％和鱼血清60％。
34.其中牛血清白蛋白配方：牛血清白蛋白750mg/l。
35.鱼血清通过以下方法得到：将鱼的血液收集于离心管中，4℃下静置4.5小时，然后吸取析出血清，4℃、4500rpm离心6分钟，在无菌超净工作台中使用0.22微米滤器过滤后收集，于
‑
20℃保存。
36.鱼卵巢液通过以下方法得到：将鱼卵在4℃、8750rpm离心9分钟，收集上清液，于
‑
80℃保存。
37.其中，抗菌液配方：青霉素330000iu/l，硫酸链霉素300mg/l。
38.各实验组的鳜卵子的体外保存液用磷酸二氢钠调节ph至8.00，现用现配，将收集的排出体外的鳜成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中(1毫升/200粒)，16～20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表1：
39.表1不同体积分数体外培养液对鳜卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
[0040][0041]
从表1中可以看出，本发明提出的一种鳜卵子的体外保存液在16～20℃下，保存液的最佳组分及其体积分数应该为培养液65％、营养液17.5％、鱼卵巢液16％和抗菌液1.5％。
[0042]
实施例3：鳜卵子体外保存
[0043]
实施例2的最佳体积分数鳜卵子体外保存液的应用，采用如下步骤：将实施例2的培养液6.5ml、营养液1.75ml、鱼卵巢液1.6ml和抗菌液0.15ml混匀后，用磷酸二氢钠调节ph至8.00，现用现配，将收集的排出体外的鳜成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中(1毫升/200粒)，16～20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表2：
[0044]
表2不同处理对鳜卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
[0045][0046]
从表2中可以看出，本发明提出的一种鳜卵子的体外保存液在16～20℃下，保存鳜卵子2小时后，其仍然具有较高的受精率和孵化率。
[0047]
实施例4：最佳保存方法的确定
[0048]
设定了3个保存时间：2小时、3小时、6小时，相同的保存温度为16～20℃，共计三个实验组和一个对照组。
[0049]
将实施例2中的最佳体积分数鳜卵子的体外保存液按照比例现用现配，挑选健康的雌鱼作为实验材料，将收集的排出体外的鳜成熟卵子浸泡在含有鳜卵子的体外保存液的玻璃皿中(1毫升/200粒)，16～20℃下分别在浸泡2小时、3小时和6小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表3：
[0050]
表3不同保存时间对鳜卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
[0051][0052][0053]
从表3中可以看出，本发明提出的一种鳜卵子的体外保存液在16～20℃下，保存鳜卵子长达6小时后，其仍然具有较高的受精率和孵化率，但相比于2小时和3小时的保存时间，6小时的保存时间受精率和孵化率有所下降，建议鳜卵子的保存时间为2～3小时。
[0054]
实施例5：最佳保存量的确定
[0055]
将实施例2中的最佳体积分数鳜卵子的体外保存液按照比例现用现配，挑选健康的雌鱼作为实验材料，将收集的排出体外的鳜成熟卵子按照1毫升/100粒、1毫升/200粒、1毫升/500粒浸泡在含有鳜卵子的体外保存液的玻璃皿中，16～20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表4：
[0056]
表4不同保存量对鳜卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
[0057][0058]
从表4中可以看出，本发明提出的一种鳜卵子的体外保存液在16～20℃下，按照1毫升/200粒，保存鳜卵子2小时后，鳜卵子受精率和孵化率较高，随着保存量的增加，鳜卵子受精率和孵化率有所下降，建议保存量为1毫升/200粒。