一种甲苯磺酸艾多沙班异构体检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析化学领域，具体涉及一种甲苯磺酸艾多沙班异构体检测方法。


背景技术：

2.艾多沙班是日本第一三共株式会社研制的小分子口服抗凝药，为凝血因子x(fxa)阻滞剂，2015年1月8日经美国fda批准上市，用于降低非瓣膜性心房颤动(房颤)患者的卒中和系统性栓塞风险。其化学名为：n
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n，
‑
[(1s，2r，4s)
‑4‑
(n，n
‑
二甲氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢[1，3]噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺，单(4
‑
甲基苯磺酸盐)一水合物，cas no.912273
‑
65
‑
5，分子式c
24
h
30
c
l
n7o4s
·
c7h8o3s
·
h2o，分子量738.27。艾多沙班是xa的选择性抑制剂。抗血栓活性不需要抗凝血酶iii。抑制游离xa和凝血酶原活性，抑制凝血酶诱导的血小板聚集。抑制凝血级联中的xa可减少凝血酶的生成，减少血栓的形成。其化学结构式为：
[0003][0004]
甲苯磺酸艾多沙班结构种含有3个手性中心，应存在7种异构体，其中有5种异构体在反相色谱条件下与艾多沙班主峰无法实现分离。有文献报道用chiralpak ia手性柱拆分了艾多沙班及其对映异构体，或用一种手性固定相hplc法分离艾多沙班中的一种非对映异构体与对映异构体，但未见能对甲苯磺酸艾多沙班与7种异构体同时检测的文献报道。
[0005]
申请号为201610354097.5在中国专利申请公开了依度沙班及其异构体的分离方法。提供一种采用色谱法分离纯化依度沙班的方法，通过色谱条件的选择，能够同时将依度沙班及其七种对映、非对应异构体相互分离。该方法仅将依度沙班及其七种对映、非对应异构体相互分离，但未显示解决了检测的问题。
[0006]
申请号为201610499243.3在中国专利申请公开了通过手性高效液相色谱法分离测定甲苯磺酸依度沙班水合物与其异构体杂质的方法。采用本发明的方法，可以实现依度沙班与异构体edox
‑ⅱ
和edox
‑ⅲ
的完全分离及定量分析。该方法仅将依度沙班及其两种异构体分离检测，但未显示解决了其他五种异构体的检测问题。
[0007]
根据其合成工艺分析，甲苯磺酸艾多沙班水合物原料中可能含有的异构体为，结构见表1：
[0008]
表1 甲苯磺酸艾多沙班水合物及其异构体信息表
[0009]
[0010]


技术实现要素：

[0011]
本发明针对现有技术中的不足，提供甲苯磺酸艾多沙班异构体检测方法，本发明操作方便，专属性好，灵敏度高，精密准确，可适用于甲苯磺酸艾多沙班6种非对映异构体及对映异构体的测定。以解决现有无法在一种色谱条件下进行甲苯磺酸艾多沙班中对映异构体与6种非对映异构体的检测的问题，
[0012]
本发明的一种甲苯磺酸艾多沙班异构体检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0013]
(1)配制流动相：
[0014]
流动相a：甲醇
[0015]
流动相b：乙醇
[0016]
(2)制备供试品溶液：取本品适量，精密称定，用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含艾多沙班0.5～1.5mg的溶液；
[0017]
(3)制备对照品溶液：精密量取供试品溶液1ml，置于量瓶中，用流动相稀释至1000ml，摇匀；
[0018]
(4)制备灵敏度溶液：精密量取对照品溶液5ml，置于量瓶中，用流动相稀释至10ml，摇匀；
[0019]
(5)分别吸取上述供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱进行测定，其色谱条件为：
[0020]
色谱柱：c18柱
[0021]
检测器：uv检测器
[0022]
检测波长：265nm～315nm
[0023]
柱温：30℃～50℃
[0024]
流速：0.8ml/min～1.2ml/min
[0025]
采用上述色谱条件，使用流动相a及流动相b，以述程序进行梯度洗脱：
[0026][0027]
进一步地，所述的色谱柱为大赛璐chiralpak ic。
[0028]
进一步地，所述色谱柱长200mm～350mm，内径3mm～10mm，填充料粒径3μm～10μm。
[0029]
进一步地，所述检测波长为为290nm。
[0030]
进一步地，所述柱温为40℃。
[0031]
进一步地，所述流速为1.0ml/min。
[0032]
进一步地，所述的甲苯磺酸艾多沙班异构体为：
[0033]
异构体1：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1s，2s，4s)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0034]
异构体2：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1r，2s，4s)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0035]
异构体3：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1r，2r，4s)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0036]
异构体4：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1r，2r，4r)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0037]
异构体5：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1s，2r，4r)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0038]
异构体6：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1s，2s，4r)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐；
[0039]
对映异构体：n1
‑
(5
‑
氯吡啶
‑2‑
基)
‑
n2((1r，2s，4r)
‑4‑
(二甲基氨甲酰基)
‑2‑
(5
‑
甲基
‑
4，5，6，7
‑
四氢噻唑并[5，4
‑
c]吡啶
‑2‑
甲酰胺基)环己基)草酰胺4
‑
甲基苯磺酸盐。
[0040]
进一步地，所述的系统适用性要求为灵敏度溶液色谱图中主峰信噪比大于10；供试品溶液色谱图中主峰与相邻杂质峰的分离度不小于1.5；各异构体峰与相邻杂质峰的分离度不小于1.0，与艾多沙班峰相比，异构体1的相对保留时间为0.69
±
0.02，异构体2和3的相对保留时间为0.75
±
0.02，异构体4的相对保留时间为0.87
±
0.02，异构体5的相对保留时间为1.21
±
0.02，异构体6的相对保留时间为1.30
±
0.02，对映异构体的相对保留时间为1.76
±
0.02。
[0041]
进一步地，以艾多沙班计，所述的甲苯磺酸艾多沙班供试品溶液浓度为1.0mg/ml；对照溶液浓度为1.0μg/ml；灵敏度溶液浓度为0.5μg/ml。
[0042]
本发明包含以下有益效果：
[0043]
本发明考虑对映异构体与主峰及非对映异构体间的分离度应符合要求外，还要考虑对映异构体与艾多沙班其他有关物质的分离。
[0044]
波长的选择：根据甲苯磺酸艾多沙班及其异构体均在290nm的波长处有最大吸收，因此选择该波长作为检测波长。
[0045]
色谱柱的选择：分别选用大赛璐公司的chiralpak ic及chiralpak ox
‑
h色谱柱，使用以甲醇
‑
乙醇(50:50)为流动相的等度洗脱色谱系统对色谱柱进行筛选，采用chiralpak ox
‑
h色谱柱时虽对映异构体峰与主峰及非对映异构体峰之间能达到基线分离，但非对映异构体峰之间达不到基线分离；采用chiralpak ic色谱柱时，对映异构体峰与主峰及非对映异构体峰之间能达到基线分离，非对映异构体中仅有2种异构体完全重合(可以通过合计进行控制)，其他异构体峰之间均能达到基线分离。因此选用chiralpak ic色谱柱为本方法的色谱柱。
[0046]
洗脱方式的选择：通过甲醇
‑
乙醇(50:50)为流动相进行等度洗脱，对其他有关物质在该色谱系统条件下定位，其中杂质28与对映异构体完全重合，影响对映异构体的测定，调整流动相配比虽然杂质28与对映异构体能达到基线分离，但主峰前的异构体2及3与供试品中的有关杂质9达不到基线分离，且供试品中含有杂质9，影响异构体测定，因此将洗脱方式改为梯度洗脱。
[0047]
本发明经过研究，开发出具有众多优点的甲苯磺酸艾多沙班异构体检测方法：能在控制对映异构体含量的同时，针对其他异构体进行逐一控制，专属性强，能准确地检测出甲苯磺酸艾多沙班的7种异构体，能有效地控制甲苯磺酸艾多沙班的安全性及疗效性。
附图说明
[0048]
图1为甲苯磺酸艾多沙班与异构体及有关杂质的分离图谱。
具体实施方式
[0049]
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
[0050]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
[0051]
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
[0052]
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例所述的甲苯磺酸艾多沙班水合物中的异构体和对映异构体测定。
[0055]
所使用的原料与仪器同实施例1。
[0056]
色谱柱：chiralpak ic色谱柱(规格250mm
×
4.6mm，5μm)；
[0057]
流动相a：甲醇
[0058]
流动相b：乙醇；
[0059]
溶剂：甲醇
‑
乙醇(45:55)
[0060]
检测波长：290nm；
[0061]
流速：1.0ml/min；
[0062]
柱温：40℃。
[0063]
系统适用性试验
[0064]
取异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体各适量，加溶剂溶解并制成每1m l中含异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体的混合溶液，精密量取20μl，照上述色谱条件进样分析。
[0065]
结果显示：异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体依次出峰，主峰与相邻杂质分离度为2.4和3.2，异构体与相邻杂质之间分离度在1.2～3.4之间，均能达基线分离(见图1)。
[0066]
灵敏度溶液浓度为0.5μg/ml(以艾多沙班计)。
[0067]
系统适用性要求为灵敏度溶液色谱图中主峰信噪比应大于10；供试品溶液色谱图中主峰与相邻杂质峰的分离度应不小于1.5，各异构体峰与相邻杂质峰的分离度应不小于1.0，与艾多沙班峰相比，异构体1的相对保留时间为0.69
±
0.02，异构体2和3的相对保留时间为0.75
±
0.02，异构体4的相对保留时间为0.87
±
0.02，异构体5的相对保留时间为1.21
±
0.02，异构体6的相对保留时间为1.30
±
0.02，对映异构体的相对保留时间为1.76
±
0.02。
[0068]
取异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体各适量，加溶剂溶解并制成每1ml含异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对应异构体各5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
[0069]
取甲苯磺酸艾多沙班适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含艾多沙班1mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0ml，置1000ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别吸取上述供试品溶液和对照品溶液20μl，注入高效液相色谱进行测定，照所述色谱条件进样分析。使用流动相a及流动相b，以下表进行梯度洗脱。
[0070]
梯度洗脱程序
[0071][0072]
按主成分自身对照法计算各样品中异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体的量。结果，202108005
‑
4、202108022
‑4‑
gf、202109001
‑4‑
gf三批原料中异构体1对照品、异构体2对照品、异构体3对照品、异构体4对照品、异构体5对照品、异构体6对照品和对映异构体均＜0.05％。见图1。