葡甘六糖、其制备方法、其应用和毛发再生制剂与流程

1.本发明涉及皮肤毛发再生技术领域，具体而言，涉及葡甘六糖、其制备方法、其应用和毛发再生制剂。


背景技术：

2.如今社会，随着人们生活压力的不断增大以及对外在形象的关注度的逐步提高，越来越普遍的脱发症状不仅会对患者的社交质量造成影响，甚至可能使得患者产生一定的精神压力，进一步发展成严重的心理健康问题。健康的毛发对于人类不仅仅具有重要的生理功能，例如可以保护皮肤抵御紫外线、引流汗液以及调节体温等，还具有重要的社会学功能。因此，研究者们一直在不断地尝试通过安全有效的方法来预防和治疗脱发问题。但目前，临床治疗脱发的手段十分局限，主要有药物治疗和手术治疗。其中经fda批准的外用药—米诺地尔以及口服药—非那雄胺一定程度上可以有效改善雄激素性脱发，但存在有效率不高、停药后脱发复发等问题。同时，毛发移植手术虽然可以作为一种替代治疗方式，但其有创、自体毛囊供体数量有限、毛囊移植存活率低以及费用高等特点限制了其进一步应用。因此，针对脱发问题亟需一些安全有效的治疗方法。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供葡甘六糖、其制备方法、其应用和毛发再生制剂。该葡甘六糖能够有效激活毛囊隆突处以及隆突部位下端的毛囊干细胞快速增殖分化，显著促进毛囊的周期性再生，加速驱动毛囊从休止期进入生长期的过程，从而达到治疗脱发的效果。
5.本发明是这样实现的：
6.第一方面，本发明提供一种葡甘六糖，所述葡甘六糖的分子结构为：man
‑
man
‑
man
‑
man
‑
glc
‑
glc。
7.在可选的实施方式中，所述葡甘六糖含有天然来源的乙酰基，当然也可以不含有天然来源的乙酰基。
8.在可选的实施方式中，所述葡甘六糖的糖单元连接方式为α
‑
1，4、α
‑
1，3、β
‑
1，4和β
‑
1，3中的任意一种。
9.优选地，所述葡甘六糖为直链结构。
10.第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的葡甘六糖的制备方法，包括：利用纤维素醚对葡甘聚糖进行酶降解形成所述葡甘六糖。
11.在可选的实施方式中，所述葡甘聚糖为天然多糖，优选为白芨多糖或魔芋多糖；
12.优选地，酶底比为1:5
‑
1:20，酶降解温度为35
‑
50℃，酶降解时间为24
‑
37小时。
13.在可选的实施方式中，包括：在进行酶降解之前，将葡甘聚糖原料溶解而后冻干形成冻干粉，而后进行酶降解；
14.优选地，酶降解完成后进行后处理；
15.优选地，后处理包括酶降解结束后，将反应体系加热至80
‑
100℃，而后离心形成上清液，而后对所述上清液进行柱层析分离。
16.第三方面，本发明提供一种前述实施方式任一项所述的葡甘六糖或前述实施方式任一项所述的葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖在制备治疗脱发的药物中的应用。
17.在可选的实施方式中，所述药物为激活毛囊隆突处以及隆突部位下端的毛囊干细胞快速增殖分化的药物；
18.优选地，所述药物为促进毛囊的周期性再生的药物；
19.优选地，所述药物为加速驱动毛囊从休止期进入生长期的药物；
20.优选地，所述药物为激活巨噬细胞释放以ccl5趋化因子为主的细胞因子网络的药物；
21.优选地，所述葡甘六糖通过直接涂抹皮肤给药、皮下注射给药和微针释放给药的方式中的任意一种进行应用。
22.第四方面，本发明提供一种前述实施方式任一项所述的葡甘六糖或前述实施方式任一项所述的葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖在制备促进毛发再生的制剂中的应用。
23.第五方面，本发明提供一种毛发再生制剂，其包括前述实施方式任一项所述的葡甘六糖或前述实施方式任一项所述的葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖；
24.优选地，所述毛发再生制剂还包括医学或药学上可接受的载体或者添加剂；
25.优选地，所述毛发再生制剂通过直接涂抹皮肤给药、皮下注射给药和微针释放给药的方式中的任意一种进行应用。
26.本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供的葡甘六糖能够特异性刺激局部的巨噬细胞释放ccl5趋化因子为主的细胞因子网络，招募以调节性t细胞为主的淋巴细胞，诱导免疫级联反应，调节免疫微环境，激活毛囊隆突处以及隆突部位下端的毛囊干细胞快速增殖分化，显著促进毛囊的周期性再生，加速驱动毛囊从休止期进入生长期的过程，从而达到治疗脱发的效果。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
28.图1为本发明实验例1的检测结果图；
29.图2为本发明实验例2的检测结果图；
30.图3为本发明实验例3的检测结果图；
31.图4为本发明实验例4的检测结果图；
32.图5为本发明实验例1的检测结果图；
33.图6为本发明实施例提供的葡甘六糖的核磁氢谱图。
具体实施方式
34.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.本发明实施例提供一种葡甘六糖，其糖单元数为六个单糖元，且其由葡萄糖单元和甘露糖单元构成，具体地，其分子结构为：man
‑
man
‑
man
‑
man
‑
glc
‑
glc。该结构的葡甘六糖可以特异性激活巨噬细胞，介导免疫应答，使皮肤局部的巨噬细胞释放ccl5趋化因子为主的细胞因子网络，进一步招募以调节性t细胞为主的淋巴细胞，诱导免疫级联反应，调节免疫微环境，激活毛囊隆突处以及隆突部位下端的毛囊干细胞快速增殖分化，显著促进毛囊的周期性再生，加速驱动毛囊从休止期进入生长期的过程，从而达到治疗脱发的效果。这为开发新型，有效，安全的毛发再生制剂以及治疗脱发途径提供了新思路。
36.进一步地，葡甘六糖含有天然来源的乙酰基或不含有天然来源的乙酰基，由于根据葡苷六糖的来源不同，其含有的乙酰基的数量也为不同，同时，葡甘六糖的糖单元连接方式为α
‑
1，4、α
‑
1，3、β
‑
1，4和β
‑
1，3中的任意一种。其为直链结构。
37.第二方面，本发明实施例提供一种葡甘六糖的制备方法，包括：
38.将葡甘聚糖原料溶解于水中，而后对形成的葡苷聚糖原料溶液进行冻干，继而形成冻干粉。
39.而后，利用纤维素酶对葡甘聚糖即上述冻干粉进行酶降解，具体地，将上述冻干粉和纤维素酶充分溶解在水中，其中，酶底比为1:5
‑
1:20，例如，酶底比为1:5、1：6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19以及1:20等1:5
‑
1:20之间的任意数值。酶降解温度为35
‑
50℃，例如，温度为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃以及50℃等35
‑
50℃之间的任意数值。酶降解时间为24
‑
37小时，例如，时间为24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时和37小时等24
‑
37小时之间的任意数值。酶降解结束后，将反应体系加热至80
‑
100℃，例如，80℃、82℃、85℃、86℃、89℃、90℃、91℃、93℃、95℃、97℃、99℃以及100℃等80
‑
100℃之间的任意数值。使得纤维素酶识货，而后离心形成上清液，而后对所述上清液进行柱层析分离。
40.进一步地，葡甘聚糖为天然多糖，优选为白芨多糖或魔芋多糖；该白芨多糖和魔芋多糖分别为从白芨或魔芋植物根茎中提取得到的多糖。
41.第三方面，本发明实施例提供一种上述葡甘六糖或葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖在制备治疗脱发的药物中的应用。该药物可以是激活毛囊隆突处以及隆突部位下端的毛囊干细胞快速增殖分化的药物；也可以是促进毛囊的周期性再生的药物；或者是加速驱动毛囊从休止期进入生长期的药物；或者为激活巨噬细胞释放以ccl5趋化因子为主的细胞因子网络的药物；也可以是同时实现上述功效的药物。
42.且本发明采用的葡甘六糖可以通过直接涂抹皮肤给药、皮下注射给药和微针释放给药的方式中的任意一种治疗方式对雄激素性脱发模型小鼠进行治疗，观察毛发形成情况，发现使用葡甘六糖进行脱发治疗均能有效地促进小鼠背部毛发生长，且无严重的不良反应发生，表明是一种安全有效的治疗方法，为解决毛发生长障碍提供了新思路。
43.第四方面，本发明实施例还提供一种上述葡甘六糖或葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖在制备促进毛发再生的制剂中的应用。
44.第五方面，本发明实施例还提供一种毛发再生制剂，其包括上述葡甘六糖或葡甘六糖的制备方法制备得到的葡甘六糖，该毛发再生制剂还包括医学或药学上可接受的载体或者添加剂；且毛发再生制剂通过直接涂抹皮肤给药、皮下注射给药和微针释放给药的方式中的任意一种进行应用。
45.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
46.实施例1
47.本发明实施例提供一种葡甘六糖的制备方法，包括：
48.称取从天然魔芋植物的块茎部提取而来的魔芋粉末5g完全溶解在100ml去离子水中，进行充分的搅拌，搅拌时间为24h，然后对魔芋多糖溶液进行冻干处理，得到魔芋葡甘多糖冻干粉。其中，该魔芋多糖的制备方法如下：取天然魔芋的根茎部分，利用中药粉碎机对其进行粉碎，得到魔芋粉。对魔芋粉用含水乙醇溶液进行反复洗涤，获取粗提之后的魔芋多糖物。
49.接下来，对魔芋多糖冻干粉进行纤维素酶(采购来源：阿拉丁试剂(上海)有限公司)降解处理。首先，称取魔芋葡甘多糖冻干粉500mg充分溶解在100ml去离子水中，反应温度40℃，反应时间24h。反应结束后，将反应体系加热至100℃使得纤维素酶灭活，终止反应后过滤离心，去除纤维素酶以及未完全反应的葡甘多糖，保留上清液，即为寡糖溶液；将寡糖溶液进行分离纯化操作获取葡甘六糖目标产物，通过sephadex g
‑
25葡聚糖层析进行分离纯化，分部收集分离洗脱液，冻干后获得纯度95％以上的葡甘六糖。其中，柱层析分离条件包括：室温下，流动相为100％去离子水。在洗脱过程中，收集部分的鉴定通过薄层层析tlc确定收集产物。
50.对以上的制备方法制备得到的葡甘六糖进行表征(参见图6)，继而得到其分子结构为：man
‑
man
‑
man
‑
man
‑
glc
‑
glc。
51.实验例1
52.诱导激化实验
53.利用上述实施例1中制备的葡甘六糖样品对小鼠骨髓来源的巨噬细胞(mbmdm，实验室方法从c57bl/6j小鼠体内提取原代细胞)进行诱导激化实验：具体地:
54.将小鼠骨髓来源的单核细胞(5
×
106个细胞/每个10cm petri培养皿)接种在10cm petri培养皿中，用培养7天的l929细胞上清培液 rpmi
‑
1640培养基 10％胎牛血清 1％青霉素
‑
链霉素培养，置入37℃，5％co2培养箱中待细胞贴壁后，用50ug/ml的葡甘六糖共同孵育24h，记为og6组，同时，设空白组(空白组为未添加葡苷六糖的实验组)，记为pbs组。共同孵育24h后，利用trizol(invitrogen)提取样本中的总rna，进行真核mrna测序实验分析和生物信息学分析，比较得到葡甘六糖刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞与空白组释放细胞因子的差异表达水平，本实验重复两次。
55.结果参见图1，根据图1可知，葡甘六糖可以特异性激活巨噬细胞释放以ccl5趋化因子为主的细胞因子网络。
56.实验例2
57.核验实验
58.为了验证真核mrna测序分析的实验结果，利用实时荧光定量pcr实验测定ccl5基因在葡甘六糖刺激的巨噬细胞中的表达水平。利用实施例1制备得到的葡甘六糖对小鼠骨髓来源的巨噬细胞(mbmdm，实验室方法从c57bl/6j小鼠体内提取原代细胞)进行诱导激化实验：具体地:
59.将小鼠骨髓来源的单核细胞(5
×
106个细胞/每个10cmpetri培养皿)接种在10cmpetri培养皿中，用培养7天的l929细胞上清培液 rpmi
‑
1640培养基 10％胎牛血清 1％青霉素
‑
链霉素培养，置入37℃，5％co2培养箱中待细胞贴壁后，用50ug/ml的葡甘六糖共同孵育1h，12h以及24h，依次记为1hr组、12hr组和24hr组。同时设空白组((空白组为未添加葡苷六糖的实验组)，记为pbs组。)分别设置三组平行实验。共同孵育不同时间段后，分别提取样本中的总rna，用实时定量pcr法检测小鼠骨髓来源的巨噬细胞前后ccl5细胞因子的表达水平。
60.结果参见图2，根据图2可知，葡甘六糖能够特异性刺激巨噬细胞快速上调ccl5细胞因子的表达水平，刺激12小时后有显著性差异变化，在刺激24小时后仍维持巨噬细胞ccl5细胞因子的高表达水平。
61.实验例3
62.动物实验——直接涂抹
63.考察实施例1制备得到的葡甘六糖样品对促进毛囊再生的生物学效果。
64.方法如下：对健康雄性7周龄c57bl/6j小鼠进行背部脱毛处理，用脱毛膏(veet公司)将背部区域毛发除净。从d
‑
0开始，每天对小鼠背部脱毛区域外用睾酮进行涂抹，建立雄激素性脱发(androgenetic alopecia，aga)的小鼠模型，并拍照记录小鼠毛发生长的情况。每隔七天外用葡甘六糖对小鼠背部脱毛区域进行直接涂抹(d
‑
0，d
‑
7，d
‑
1 4)，记为og6组。设空白组(不进行涂抹)，记为control组。观察21天时小鼠背部毛发生长情况。
65.结果参见图3，根据图3可知，直接涂抹葡甘六糖进行脱发治疗实验组的小鼠，与空白组相比，背部治疗区域的毛囊已经由休止期进入生长期，且长出毛发。说明葡甘六糖通过皮肤吸收，特异性刺激皮肤组织局部的巨噬细胞释放以ccl5为主的细胞因子网络，调控局部的免疫微环境，促进毛囊干细胞增殖，从而加速小鼠脱毛处理区域的毛囊从休止期向生长期过渡。在第21天时，葡甘六糖直接涂抹处理部位的毛发生长情况明显优于空白组小鼠。
66.实验例4
67.动物实验——皮下注射
68.方法如下：对健康雄性7周龄c57bl/6j小鼠进行背部脱毛处理，用脱毛膏(veet公司)将背部区域毛发除净。从d
‑
0开始，每天对小鼠背部脱毛区域外用睾酮进行涂抹，模拟雄激素性脱发(androgenetic alopecia，aga)，并拍照记录小鼠毛发生长的情况。每七天利用葡甘六糖对小鼠背部脱毛区域进行皮下注射处理(d
‑
0，d
‑
7，d
‑
14)，记为og6组。设空白组(不进行涂抹)，记为control组。观察第21天时小鼠背部毛发生长情况。
69.结果参见图4，根据图4可知，通过皮下注射葡甘六糖实验组的小鼠，与空白组相比，背部治疗区域的毛囊已经由休止期进入生长期，且长出毛发。皮下注射的葡甘六糖能够特异性刺激皮肤组织局部的巨噬细胞释放以ccl5为主的细胞因子网络，调控局部的免疫微环境，促进毛囊干细胞增殖，从而明显诱导小鼠背部脱毛区域的毛囊进入再生周期。在第21天时，皮下注射葡甘六糖处理的实验组小鼠的毛发生长情况明显优于空白组小鼠。
70.实验例5
71.动物实验——微针给药
72.方法如下：对健康雄性7周龄c57bl/6j小鼠进行背部脱毛处理，用脱毛膏(veet公司)将背部区域毛发除净。从d
‑
0开始，每天对小鼠背部脱毛区域外用睾酮进行涂抹，模拟雄激素性脱发(androgenetic alopecia，aga)造模，并拍照记录小鼠毛发生长的情况。利用葡甘六糖对小鼠背部脱毛区域进行每七天微针给药(d
‑
0，d
‑
7，d
‑
14)，记为og6组。设空白组(不进行涂抹)，记为control组。观察21天时小鼠背部毛发生长情况。
73.结果参见图5，根据图5可知，葡甘六糖微针治疗实验组的小鼠，与空白组相比，背部治疗区域的毛囊最先由休止期进入生长期，且最先长出毛发。葡甘六糖促进表皮干细胞及毛囊干细胞增殖，显著促进小鼠休止期晚期毛囊向生长期转化，葡甘六糖处理部位的毛发生长情况明显茂密于空白组小鼠。
74.基于葡甘六糖的微针治疗脱发，不仅可以通过适当的创伤激活皮肤启动修复反应，避免了临床应用时大块创伤导致瘢痕生成以及毛囊结构破坏的可能性，还可以充分发挥葡甘六糖刺激诱导巨噬细胞释放以ccl5为主的细胞因子网络的从而调节免疫微环境作用，进一步激活毛囊干细胞进行增殖，促进毛囊再生，改善脱发情况。
75.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。