一种功能化水溶性纳米硒、制备方法及应用与流程

1.本发明涉及一种纳米硒，具体涉及一种功能化水溶性纳米硒、制备方法及应用。属于纳米硒制备技术领域。


背景技术：

2.肾脏位于人体腰部腹膜腔的后方，包括左肾与右肾，肾脏在人类的循环与排泄作用中起到很重要的作用，主要包括：排出身体内的废物、药物；维持身体内水份、酸碱值、与电解质的平衡；产生血管加压素以控制血压；产生维他命d以控制钙质吸收与骨质发育；产生红血球生血素以维持红血球的正常代谢。
3.由于肾脏为人体之中所不可或缺的器官，因此，当肾功能开始发生异常之时，除了会导致人体内的废物、药物与代谢产物无法正常排出体以外，肾的调节功效也将会大幅降低；更严重者，当肾功能严重异常时，还会引发尿毒症而危及患者性命。肾癌是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，可怕的是，肾脏癌细胞初期发展缓慢，所以并不会显现早期症状，当肿瘤扩散到邻近的器官或大部份肾组织被侵犯时，才会引起疼痛和血尿的症状。
4.肾脏癌的治疗主要可分为外科手术法、化学疗法、放射治疗、及免疫疗法。近年来，医生通常只会以外科手术摘除带有肿瘤部份的肾脏组织并接着搭配化学疗法或免疫疗法进行后续处理，但是治疗效果并不理想，副作用也很大，化疗失败、耐药性等问题都很难解决。
5.硒是人类和动物体内存在的一种重要的微量必需元素。流行病学研究、临床前调查和临床干预试验支持硒化合物可被用于癌症治疗的观点。专利cn107412280b公开了一种具有抑制胃癌细胞增殖活性的纳米硒水溶胶，是由纳米硒和云芝多糖蛋白组成，其具有抑制胃癌细胞增殖活性，可用于制备抑制胃癌细胞增殖药物。但目前尚无将硒用于肾癌防治的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种功能化水溶性纳米硒、制备方法及应用，水溶性好，可用于防治肾癌保健品或药物的制备。
7.为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
8.一种功能化水溶性纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
9.(1)先以太子参为原料，经甲醇水溶液提取，得到太子参提取液；
10.(2)再将牛樟芝菌种在含亚硒酸钠的发酵培养基中培养，得到牛樟芝菌丝体发酵液；
11.(3)然后向步骤(2)所得牛樟芝菌丝体发酵液中加入亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热反应，并在反应过程中缓慢滴入步骤(1)所得太子参提取液，反应结束后进行透析，冷冻干燥，即得所述的一种功能化水溶性纳米硒。
12.优选的，以重量份计，步骤(1)的具体方法为：先将太子参粉碎成100～200目的太
子参粉末，接着将1份太子参粉末加入5～7份体积浓度40～50％甲醇水溶液中，加热回流30～40分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液。
13.优选的，步骤(2)的具体方法如下：先将牛樟芝菌种经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量5～7％接入含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液。
14.进一步优选的，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：27～29℃培养5～7天；以重量份计，该斜面培养基包含：葡萄糖20～30份，琼脂10～15份，蛋白胨8～10份，硫酸镁0.3～0.4份，马铃薯煮汁1000份。
15.进一步优选的，在种子培养基中的培养条件为：在150～200r/min和27～29℃条件下培养2～3天；以重量份计，所述的种子培养基包含：葡萄糖22～30份，蛋白胨5～7份，硫酸镁1～2份，马铃薯煮汁1000份。
16.进一步优选的，在发酵培养基中的培养条件为：在150～200r/min和27～29℃条件下培养2～3天；以重量份计，所述的发酵培养基包含：葡萄糖25～35份，蛋白胨2～3份，硫酸镁1～2份，亚硒酸钠1～2份，磷酸氢二钾0.5～0.7份，酵母粉0.3～0.4份，马铃薯煮汁1000份。
17.更进一步优选的，以重量份计，所述的马铃薯煮汁是将200～220份马铃薯切块后放入1000份水中煮沸30～40分钟后过滤而得。
18.进一步优选的，以重量份计，酶解的具体方法为：先向100份培养物中加入0.5～0.7份酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.4～0.6份酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.3～0.4份酶活1
×
105u/kg淀粉酶，50～55℃酶解处理2～3小时，灭酶即可。
19.进一步优选的，均质处理的具体方法为：先1000～1200r/min胶体磨处理8～10分钟，接着在45～55mpa条件下均质化处理2～3分钟。
20.优选的，以重量份计，步骤(3)的具体方法如下：先向100份牛樟芝菌丝体发酵液中加入150～160份0.02～0.03mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入150～160份0.04～0.05mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至50～55℃，保温搅拌70～90分钟，然后边搅拌边控制耗时30～40分钟匀速滴入50～60份太子参提取液，滴加完毕后继续保温搅拌50～70分钟，反应结束，透析，冷冻干燥，即得所述的一种功能化水溶性纳米硒。
21.优选的，步骤(3)中，采用截留分子量为3000～4000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为56～70小时。
22.利用上述制备方法得到的一种功能化水溶性纳米硒。
23.上述一种功能化水溶性纳米硒制备防治肾癌保健品或药物中的应用。
24.本发明的有益效果：
25.本发明先以太子参为原料，经甲醇水溶液提取，得到太子参提取液；再将牛樟芝菌种在含亚硒酸钠的发酵培养基中培养，得到牛樟芝菌丝体发酵液；然后向牛樟芝菌丝体发酵液中加入亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热反应，并在反应过程中缓慢滴入太子参提取液，反应结束后进行透析，冷冻干燥，得到纳米硒。该纳米硒的水溶性好，并进行了功能化修饰，可用于防治肾癌保健品或药物的制备。
26.本发明的制备方法简单，是在牛樟芝菌丝体发酵液环境中，通过亚硒酸钠和抗坏
血酸反应生成纳米硒。牛樟芝菌丝体发酵液是将牛樟芝菌种在含亚硒酸钠的发酵培养基中培养而得，故在牛樟芝菌丝体生长过程中富集发酵培养基中的硒并转化为有机硒。在牛樟芝菌丝体发酵液中存在硒，有助于控制亚硒酸钠和抗坏血酸反应节奏，控制生成纳米硒的速度和尺寸、形态，避免在反应过程中纳米硒团聚。
27.在牛樟芝菌丝体发酵液中含有多糖类物质，可随着纳米硒的生成对其进行表面修饰，改善纳米硒的水溶性。并且，在反应过程中缓慢滴入太子参提取液，其中含有的环肽可对纳米硒进一步进行修饰，进一步改善纳米硒的水溶性。
28.另外，牛樟芝菌丝体发酵液中的多糖、太子参提取液中的环肽与纳米硒具协同作用，对肾癌细胞具有明显抑制作用，故本发明所得纳米硒在制备防治肾癌保健品或药物方面具有很大的应用可能性。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
30.本发明涉及的牛樟芝菌种，atcc200183，购自美国菌种保藏中心；a498人肾癌细胞，购自酶联(上海)生物试剂科技有限公司。
31.实施例1：
32.一种功能化水溶性纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
33.(1)将太子参粉碎成100目的太子参粉末，接着将1g太子参粉末加入7g体积浓度40％甲醇水溶液中，加热回流40分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液；
34.(2)将牛樟芝菌种atcc200183经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量5％接入含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液；
35.(3)向100g牛樟芝菌丝体发酵液中加入160g0.02mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入160g0.04mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至55℃，保温搅拌70分钟，然后边搅拌边控制耗时40分钟匀速滴入50g太子参提取液，滴加完毕后继续保温搅拌70分钟，反应结束，透析，冷冻干燥，即得所述的一种功能化水溶性纳米硒。
36.其中，步骤(2)中，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：27℃培养7天；该斜面培养基包含：葡萄糖20g，琼脂15g，蛋白胨8g，硫酸镁0.4g，马铃薯煮汁1000g。
37.在种子培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的种子培养基包含：葡萄糖30g，蛋白胨5g，硫酸镁2g，马铃薯煮汁1000g。
38.在发酵培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的发酵培养基包含：葡萄糖35g，蛋白胨2g，硫酸镁2g，亚硒酸钠1g，磷酸氢二钾0.7g，酵母粉0.3g，马铃薯煮汁1000g。
39.所述的马铃薯煮汁是将220g马铃薯切块后放入1000g水中煮沸30分钟后过滤而得。
40.酶解的具体方法为：先向100g培养物中加入0.7g酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.4g酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.4g酶活1
×
105u/kg淀粉酶，50℃酶解处理3小时，灭酶即
可。
41.均质处理的具体方法为：先1000r/min胶体磨处理10分钟，接着在45mpa条件下均质化处理3分钟。
42.步骤(3)中，采用截留分子量为3000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为70小时。
43.实施例2：
44.一种功能化水溶性纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
45.(1)将太子参粉碎成200目的太子参粉末，接着将1g太子参粉末加入5g体积浓度50％甲醇水溶液中，加热回流30分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液；
46.(2)将牛樟芝菌种atcc200183经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量7％接入含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液；
47.(3)向100g牛樟芝菌丝体发酵液中加入150g 0.03mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入150g 0.05mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至50℃，保温搅拌90分钟，然后边搅拌边控制耗时30分钟匀速滴入60g太子参提取液，滴加完毕后继续保温搅拌50分钟，反应结束，透析，冷冻干燥，即得所述的一种功能化水溶性纳米硒。
48.其中，步骤(2)中，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：29℃培养5天；该斜面培养基包含：葡萄糖30g，琼脂10g，蛋白胨10g，硫酸镁0.3g，马铃薯煮汁1000g。
49.在种子培养基中的培养条件为：在200r/min和27℃条件下培养3天；所述的种子培养基包含：葡萄糖22g，蛋白胨7g，硫酸镁1g，马铃薯煮汁1000g。
50.在发酵培养基中的培养条件为：在200r/min和27℃条件下培养3天；所述的发酵培养基包含：葡萄糖25g，蛋白胨3g，硫酸镁1g，亚硒酸钠2g，磷酸氢二钾0.5g，酵母粉0.4g，马铃薯煮汁1000g。
51.所述的马铃薯煮汁是将200g马铃薯切块后放入1000g水中煮沸40分钟后过滤而得。
52.酶解的具体方法为：先向100g培养物中加入0.5g酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.6g酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.3g酶活1
×
105u/kg淀粉酶，55℃酶解处理2小时，灭酶即可。
53.均质处理的具体方法为：先1200r/min胶体磨处理8分钟，接着在55mpa条件下均质化处理2分钟。
54.步骤(3)中，采用截留分子量为4000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为56小时。
55.实施例3：
56.一种功能化水溶性纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
57.(1)将太子参粉碎成200目的太子参粉末，接着将1g太子参粉末加入6g体积浓度45％甲醇水溶液中，加热回流30～40分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液；
58.(2)将牛樟芝菌种atcc200183经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量6％接入含有亚硒
酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液；
59.(3)向100g牛樟芝菌丝体发酵液中加入155g 0.025mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入155g 0.045mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至52℃，保温搅拌80分钟，然后边搅拌边控制耗时35分钟匀速滴入55g太子参提取液，滴加完毕后继续保温搅拌60分钟，反应结束，透析，冷冻干燥，即得所述的一种功能化水溶性纳米硒。
60.其中，步骤(2)中，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：28℃培养6天；该斜面培养基包含：葡萄糖25g，琼脂12g，蛋白胨9g，硫酸镁0.35g，马铃薯煮汁1000g。
61.在种子培养基中的培养条件为：在150r/min和28℃条件下培养3天；所述的种子培养基包含：葡萄糖28g，蛋白胨6g，硫酸镁1.5g，马铃薯煮汁1000g。
62.在发酵培养基中的培养条件为：在200r/min和28℃条件下培养3天；所述的发酵培养基包含：葡萄糖30g，蛋白胨2.5g，硫酸镁1.5g，亚硒酸钠1.5g，磷酸氢二钾0.6g，酵母粉0.35g，马铃薯煮汁1000g。
63.所述的马铃薯煮汁是将210g马铃薯切块后放入1000g水中煮沸35分钟后过滤而得。
64.酶解的具体方法为：先向100g培养物中加入0.6g酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.5g酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.35g酶活1
×
105u/kg淀粉酶，52℃酶解处理2.5小时，灭酶即可。
65.均质处理的具体方法为：先1100r/min胶体磨处理9分钟，接着在50mpa条件下均质化处理2分钟。
66.步骤(3)中，采用截留分子量为3500da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为65小时。
67.对比例1
68.一种纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
69.(1)将牛樟芝菌种atcc200183经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量5％接入含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液；
70.(2)向100g牛樟芝菌丝体发酵液中加入160g0.02mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入160g0.04mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至55℃，保温搅拌180分钟，透析，冷冻干燥，即得所述的一种纳米硒。
71.其中，步骤(1)中，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：27℃培养7天；该斜面培养基包含：葡萄糖20g，琼脂15g，蛋白胨8g，硫酸镁0.4g，马铃薯煮汁1000g。
72.在种子培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的种子培养基包含：葡萄糖30g，蛋白胨5g，硫酸镁2g，马铃薯煮汁1000g。
73.在发酵培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的发酵培养基包含：葡萄糖35g，蛋白胨2g，硫酸镁2g，亚硒酸钠1g，磷酸氢二钾0.7g，酵母粉0.3g，马铃薯煮汁1000g。
74.所述的马铃薯煮汁是将220g马铃薯切块后放入1000g水中煮沸30分钟后过滤而
得。
75.酶解的具体方法为：先向100g培养物中加入0.7g酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.4g酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.4g酶活1
×
105u/kg淀粉酶，50℃酶解处理3小时，灭酶即可。
76.均质处理的具体方法为：先1000r/min胶体磨处理10分钟，接着在45mpa条件下均质化处理3分钟。
77.步骤(2)中，采用截留分子量为3000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为70小时。
78.对比例2
79.一种纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
80.(1)将太子参粉碎成100目的太子参粉末，接着将1g太子参粉末加入7g体积浓度40％甲醇水溶液中，加热回流40分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液；
81.(2)向100g太子参提取液中加入160g0.02mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入160g0.04mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至55℃，保温搅拌180分钟，透析，冷冻干燥，即得所述的一种纳米硒。
82.其中，步骤(2)中，采用截留分子量为3000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为70小时。
83.对比例3
84.一种纳米硒的制备方法，具体步骤如下：
85.(1)将太子参粉碎成100目的太子参粉末，接着将1g太子参粉末加入7g体积浓度40％甲醇水溶液中，加热回流40分钟，离心取上清，即得所述的太子参提取液；
86.(2)将牛樟芝菌种atcc200183经斜面培养获得长满菌丝体的斜面，接着将该斜面接种于种子培养基中，培养，得到液体种子，再将液体种子以质量接种量5％接入含有亚硒酸钠的发酵培养基中，培养得培养物，酶解，均质处理，离心取上清，即得牛樟芝菌丝体发酵液；
87.(3)将100g牛樟芝菌丝体发酵液和50g太子参提取液搅拌混匀，再加入160g0.02mol/l亚硒酸钠溶液，搅拌混匀，接着缓慢加入160g0.04mol/l抗坏血酸溶液，搅拌均匀，加热至55℃，保温搅拌180分钟，透析，冷冻干燥，即得所述的一种纳米硒。
88.其中，步骤(2)中，在斜面培养基上实现斜面培养，培养条件为：27℃培养7天；该斜面培养基包含：葡萄糖20g，琼脂15g，蛋白胨8g，硫酸镁0.4g，马铃薯煮汁1000g。
89.在种子培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的种子培养基包含：葡萄糖30g，蛋白胨5g，硫酸镁2g，马铃薯煮汁1000g。
90.在发酵培养基中的培养条件为：在150r/min和29℃条件下培养2天；所述的发酵培养基包含：葡萄糖35g，蛋白胨2g，硫酸镁2g，亚硒酸钠1g，磷酸氢二钾0.7g，酵母粉0.3g，马铃薯煮汁1000g。
91.所述的马铃薯煮汁是将220g马铃薯切块后放入1000g水中煮沸30分钟后过滤而得。
92.酶解的具体方法为：先向100g培养物中加入0.7g酶活2
×
105u/kg复合蛋白酶、0.4g酶活1
×
105u/kg纤维素酶、0.4g酶活1
×
105u/kg淀粉酶，50℃酶解处理3小时，灭酶即
可。
93.均质处理的具体方法为：先1000r/min胶体磨处理10分钟，接着在45mpa条件下均质化处理3分钟。
94.步骤(3)中，采用截留分子量为3000da的透析袋进行透析，透析温度为4℃，透析时间为70小时。
95.试验例
96.1、水溶性考察：
97.分别将实施例1～3和对比例1～3所得纳米硒，各取1g加入100ml 8℃的水中，目测溶解情况，结果见表1。
98.表1.水溶性考察结果
[0099] 8℃水中溶解情况实施例1完全溶解，澄清透明实施例2完全溶解，澄清透明实施例3完全溶解，澄清透明对比例1溶解性差，有大量絮状物，底部有沉淀对比例2溶解性差，有大量絮状物，底部有沉淀对比例3基本溶解，有少量絮状物
[0100]
由表1可知，实施例1～3所得纳米硒的水溶性好。对比例1略去太子参提取液，对比例2略去牛樟芝菌丝体，对比例3改变太子参提取液的投料时机，所得纳米硒水溶性明显变差，说明多糖类物质、环肽等的适当配合修饰，协同改善纳米硒的水溶性。
[0101]
2、采用mtt法评价纳米硒对人肾癌细胞的生长抑制作用
[0102]
处于生长对数期的细胞：a498人肾癌细胞以1.5
×
104浓度种于96孔板中。置于37℃、体积百分数5％co2培养箱中培养24小时贴壁后吸去原来的培养基。试验分为空白对照组、药物处理组。空白组更换含体积浓度10％胎牛血清的1640培养基；药物处理组更换含浓度为1μm的实施例1～3或对比例1～3所得纳米硒的培养基。培养48小时后，加入浓度5mg/ml的mtt，继续放于co2培养箱培养4小时，然后沿着培养液上部吸去100μl上清，加入100μldmso，暗处放置10分钟，利用酶标仪测定吸光值(波长560nm)，并根据吸光值计算细胞存活情况，每个处理设6个重复孔。细胞存活率(％)＝δod药物处理/δod空白对照
×
100。结果见表2。
[0103]
表2.人肾癌细胞存活率比较
[0104] 细胞存活率(％)实施例113.12实施例213.05实施例312.93对比例122.87对比例225.69对比例318.73
[0105]
由表2可知，实施例1～3所得纳米硒对人肾癌细胞的生长具有显著的抑制作用，细胞存活率低。
[0106]
对比例1略去太子参提取液，对比例2略去牛樟芝菌丝体，对比例3改变太子参提取液的投料时机，对比例1～3所得纳米硒对人肾癌细胞的抑制效果变差，说明多糖类物质、环肽等的适当配合修饰，共同促进对人肾癌细胞的抑制。
[0107]
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。