一种诱导半夏愈伤组织的方法及其专用培养基与流程

1.本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地说，涉及一种诱导半夏愈伤组织的方法及其专用培养基。


背景技术：

2.半夏属于天南星科半夏属，是一种多年生的草本植物，又被称为野芋头、三步跳等等，中药宝库中记载是一种重要的中药材，其产地在我国和日本。半夏以块茎干燥后入药。半夏在我国主要分布于云南、江南、四川、贵州、湖北等地.。根据调查统计，在传统的558种中药处方之中，半夏的使用频率达到第前22位。
3.半夏较喜沙性的土壤，一般分夏秋两个季节采挖，块茎圆球或扁圆球形。它是一种应用相对广泛、疗效比较确切的传统中药材。但是目前市场上的半夏供应越来越少，尤其是优质半夏多数被“水半夏”替代而入药，虽都被称之为“半夏”，可“水半夏”相对于“川半夏”而言不管在药价或是药性上都存在着天壤之别。在上世纪八十年代时“水半夏”属查处、罚款、没收性药材。但尽管如此，曾被查收的“水半夏”依旧代替了半夏而大行其道，这一问题根本原因在于对环境的污染破坏、对土地过度开发、对野生资源大肆开采，而造成半夏野生资源的日渐枯竭，加上半夏繁殖的特殊性，其块茎繁殖，需种量较大，尤其是连作种植时极易致使病毒侵染，重茬时病害很严重，品质产量均大幅度下降，从而导致了人工种植滞后。而另一方面就市场本身来说对于川半夏的需求量也在持续增长，供不应求的现实情况导致“水半夏”滥竽充数且无法遏制，并极大限制了川半夏产业发展。
4.虽然人工种植半夏能够取得部分成功，但若想要扩大种植却仍然存在繁殖系数较低的问题：其一，半夏局限于珠芽繁殖、块茎繁殖繁殖方法，其种子繁殖的方式在实际生产过程中很少运用甚至几乎不运用；其二，病虫害的防治技术与生产的不匹配，如病毒病、腐烂病、疫病等都对生产有较大影响；其三，规模化的种植面积少；其四，应用到实际生产较为复杂，且种植成本高。那么半夏开放式组织培养体系的建立，对于半夏的连作病害控制具有重要作用，无菌苗的种植能够大大的减少其病害发生率，进而提高半夏的产量以及品质，并使其保持优良性状，实现半夏的大面积种植，达到市场需求量的供应。目前，研究人员用半夏的叶柄、叶片、珠芽等部位作为外植体，用以研究其愈伤组织诱导及分化的特征，并在半夏组织培养的关键技术上取得了一定进展，但是基于现有激素配方对于半夏外植体愈伤组织的诱导及根系的分化效率偏低，导致荆半夏的组织培养技术迄今为止都未得到大规模的推广。有关于半夏的组织培养快繁研究报道比较多,半夏的组培苗具备繁殖系数较高、生长速度较快、不携带病毒且药用含量高于野生半夏等特点，所以说，运用组织培养再生苗已经成了半夏生产发展的一种趋势。
5.对比文件：申请号为“cn201410023655.0”，名称为“一种半夏一步成苗的组织培养方法以及新的半夏培养基”公开了一种半夏一步成苗的组织培养方法，以6
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ba和naa激素组合，对株芽、块茎、叶片和叶柄为外植体，进行一步成苗诱导，块茎分化效率最高，每块愈伤组织分化出12
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14个小苗，成苗率95％。块茎成苗天数35
‑
40d，叶片和叶柄需要2
‑
3个月。然
而该案存在愈伤组织增殖速度慢、器官分化效率低等显著不足的缺点。此外，该案在外植体选择上存在较多限制因素，块茎和株芽作为外植体存在消毒不彻底，污染率高的问题；且成苗时间过长，难以满足市场的需求。
6.因而，如何开发一种半夏的快速培养方法，且提高其增值效率以及分化效率减少污染，以满足市场需求，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种诱导半夏愈伤组织的方法；本发明所要解决的另一技术问题是提供一种诱导半夏愈伤组织的专用培养基。
8.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
9.一种诱导半夏愈伤组织的方法，将半夏外植体置于诱导培养基上进行诱导培养，获得生长迅速、活力旺盛的愈伤组织，所述诱导培养基以ms培养基为基础培养基，添加有1.0mg/ml的6
‑
ba、0.5mg/ml的naa以及油樟精油。
10.进一步的，培养基的ph值为6.0。
11.进一步的，半夏外植体采用的是半夏的叶柄或者叶片。
12.进一步的，外植体消毒为：将叶柄或叶片先用流水冲洗20min，再置于0.2％的多菌灵中振荡浸泡30min，然后用75％酒精消毒45s，无菌水冲洗2
‑
3次，最后将其置于放有无菌滤纸的接种盘中，吸干叶柄或叶片表面水分，最后将叶柄切成1.0cm左右的小段，叶片切成约0.5cm
×
0.5cm小方块。进一步的，诱导培养的条件为培养温度25
±
1℃，湿度60％
‑
65％，光照周期每天12h培养。
13.本发明还提供一种诱导半夏愈伤组织的专用培养基，专用培养基以ms培养基为基础培养基，添加有6
‑
ba、naa以及油樟精油。
14.进一步的，专用培养基中油樟精油的浓度为0.1ml/l
‑
0.25ml/l。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1油樟精油浓度为0.1ml/l的培养基中，培养10天的结果图；
17.图2油樟精油浓度为0.2ml/l的培养基中，培养15天的结果图；
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
19.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
20.实施例1
21.一种诱导半夏愈伤组织的方法，包括以下步骤：
22.1.外植体消毒处理
23.将叶柄或叶片先用流水冲洗20min，再置于0.2％的多菌灵中振荡浸泡30min，然后用75％酒精消毒45s，无菌水冲洗2
‑
3次，最后将其置于放有无菌滤纸的接种盘中，吸干叶柄或叶片表面水分，最后将叶柄切成1.0cm左右的小段，叶片切成约0.5cm
×
0.5cm小方块。
24.2.诱导培养基制备
25.半夏愈伤组织诱导培养基的制备包括如下步骤：
26.以ms培养基为基础培养基，添加1.0mg/ml的6
‑
ba、0.5mg/ml的naa，按下表油樟精油浓度制备含不同浓度的油樟精油培养基。
[0027][0028][0029]
3.诱导培养
[0030]
将外植体置于专用诱导培养基中，设置25℃左右，光照周期每天12h，根据外植体生长状态定期观察外植体愈伤组织诱导情况，约5～10天观察一次，记录愈伤组织生长情况并统计愈伤诱导率。
[0031]
4.诱导率统计
[0032]
愈伤组织诱导率(％)＝(形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数)
×
100％，具体结果如下表：
[0033]
编号叶片叶柄珠芽污染率死亡率诱导率126个28个2个7.14％12.5％78.63％224个31个3个5.7％7.7％89.2％322个24个1个2.12％4.12％93.1％429个22个1个3.44％5.17％91.39％521个30个3个3.7％5.55％90.75％619个32个2个6.16％8.9％84.54％727个31个3个7.7％12.7％68.4％
[0034]
本实验中中所取半夏的叶柄、叶片在同样的条件下培养，愈伤的诱导率有差异，在0.05ml/l
‑
0.25ml/l浓度的油樟精油使用浓度下，可以有效的降低污染长菌问题，并且有助于提高诱导愈伤组织。
[0035]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。