裸小鼠肝癌原位移植模型的建立的制作方法

1.本发明涉及肝癌原位移植技术领域，具体为裸小鼠肝癌原位移植模型的建立。


背景技术：

2.2014年中国卫生统计提要数据表明，肝癌高居各种恶性肿瘤相关死亡原因的总体第2位，在全球范围内，每年约有75万新增肝癌病例，同时又有约70万例肝癌死亡病例，其中我国所占比例超过50％，肝癌具有恶性程度高、治疗复杂和生存时间短等特点，是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一，目前，常见的肝癌移植模型按接种部位分主要有皮下移植和原位移植，按接种类型又可分为细胞混悬液法和肿瘤组织块法(较为常用)。
3.常见的肿瘤组织块原位移植模型的建立方法是用套管针在动物肝脏扎入约2～3mm深，塞入肿瘤组织块，无菌干棉签按压止血或用医用止血贴止血，逐层缝合皮肤，但由于动物肝脏比较脆弱，操作过程中容易造成肝脏大量出血，操作时间较长，在大批量建立该模型时需要耗费大量的时间和精力。
4.目前，国内外所采用的裸小鼠肝癌原位移植模型主要是包埋法和细胞混悬液接种法，但是这些方法都有各自的缺点:包埋法溶液造成动物肝脏大量出血并引起动物死亡，手术时间较长，具有较大的操作难度，在人员有限的情况下不适用于制备大批量的肝癌原位移植动物模型；细胞混悬液接种法成瘤率较低，且形成实体瘤时间较长，肿瘤生长较慢，并且注入肝脏的细胞混悬液溶液溢出，造成肿瘤腹腔内广泛种植。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供裸小鼠肝癌原位移植模型的建立，以解决上述背景技术中提出的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.裸小鼠肝癌原位移植模型的建立，包括如下步骤：
8.(1)体外培养好的细胞混悬液备用；
9.(2)取0.2ml步骤(1)的细胞混悬液，接种于4只裸小鼠右侧腋窝皮下，待成瘤后备用；
10.(3)实验动物的麻醉：实验采用matrx vip 3000型气体麻醉系统对实验动物进行气体麻醉，麻醉剂为异氟烷,该麻醉系统有1根通向小动物活体成像系统的管路，以确保动物在活体成像仪内进行发光检测时能持续麻醉。将此管路改造成一个独立的麻醉装置，用于动物手术时的持续麻醉。或者采用其他麻醉剂对动物进行麻醉；
11.(4)肝癌原位移植瘤模型的制备：将生长良好的皮下移植瘤剪成大小约为2mm
×
2mm
×
1mm的肿瘤组织块备用，按步骤(3)对动物进行麻醉，取仰卧位，皮肤表面消毒，开腹，开口长度约为1cm，暴露出肝脏，制备原位肝癌荷瘤动物模型，逐层缝合好腹腔，创口消毒，小心饲养。
12.在本发明一较佳实施例中，所述步骤(1)中细胞混悬液由肝癌细胞bel
‑
7402制成，
用无菌pbs缓冲液冲洗2次，再用无菌pbs缓冲液制备成浓度为107个细胞/ml的细胞混悬液。
13.在本发明一较佳实施例中，所述步骤(2)和(4)中，裸小鼠均采用spf级balb/c裸小鼠，6～8周龄，雄性，体重18～22g。
14.在本发明一较佳实施例中，所述步骤(3)中，混合气体是用具有一定气压的纯氧气带动异氟烷，形成气化的异氟烷和氧气混合制作而成，亦可用其它麻醉剂。
15.在本发明一较佳实施例中，所述步骤(4)中，“包埋法”的步骤是：在肝左叶中间部位轻轻戳一个约3mm深度的隧道，用无菌棉签局部轻压止血，将准备好的人癌组织小心塞入，再用棉签轻压止血，亦可用生物胶粘合伤口；“夹心法”的步骤是：用手术线将肿瘤组织块直接缝在肝右叶内侧:先用带缝合线的缝合针穿过肿瘤组织，再从肝右叶内侧穿至外侧，然后打一个手术结，轻轻拉紧，剪断手术线即可。
16.本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
17.本发明建立的动物模型能够准确模拟肝癌肿瘤发生发展的原位肿瘤发生模型；本发明解决了现有模型的缺陷问题：
18.本发明的动物模型可用于研究肝癌原位移植模型发生发展、药物筛选、快速诊断以及手术方法探索，进一步提供一种肝癌原位移植模型、肝癌皮下移植模型发展的影响学研究模型、肝癌原位移植新型诊断分子和方法的研究模型等，应用范围广，可以让人们更深入的了解肝癌肿瘤，在其早期诊断、治疗和预防复发上能有所突破。
附图说明
19.图1为本发明荷瘤裸小鼠的生物发光检测和实体瘤图；
20.图2为本发明实体瘤组织病理切片观察图。
具体实施方式
21.实施例1：
22.请参阅图1和图2，本发明提供一种技术方案：
23.裸小鼠肝癌原位移植模型的建立，包括如下步骤：
24.(1)体外培养好的细胞混悬液备用；
25.(2)取0.2ml步骤1的细胞混悬液，接种于4只裸小鼠右侧腋窝皮下，待成瘤后备用；
26.(3)实验动物的麻醉：实验采用matrx vip 3000型气体麻醉系统对实验动物进行气体麻醉，麻醉剂为异氟烷。该麻醉系统有1根通向小动物活体成像系统的管路，以确保动物在活体成像仪内进行发光检测时能持续麻醉。将此管路改造成一个独立的麻醉装置，用于动物手术时的持续麻醉。或者采用其他麻醉剂对动物进行麻醉；
27.(4)肝癌原位移植瘤模型的制备：将生长良好的皮下移植瘤剪成大小约为2mm
×
2mm
×
1mm的肿瘤组织块备用，按步骤3对动物进行麻醉，取仰卧位，皮肤表面消毒，开腹，开口长度约为1cm，暴露出肝脏，制备原位肝癌荷瘤动物模型，逐层缝合好腹腔，创口消毒，小心饲养。
28.工作流程：建立小鼠肝癌原位移植模型后，用小动物活体成像系统对动物体内肿瘤生长情况进行实时监控，将生物发光标记好的肝癌细胞bel
‑
7402制备成细胞混悬液，接种到balb/c裸小鼠皮下，待成瘤后挑选生长良好的实体瘤，制备成肿瘤组织块原位接种于
动物肝脏部位，检测时腹腔注射30mg/ml的底物d
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荧光素钾盐，注射体积为0.1ml/10g体重，5～10min后用小动物活体成像系统进行生物发光检测，图1中a和c为模型建立4周时的肿瘤在体生物发光检测，只有活的肿瘤细胞才能被检测到，图1中b和d为动物肝脏及实体瘤，结果表明，用新方法建立的balb/c裸小鼠肝癌原位移植模型与常用的方法比较，肿瘤生长良好，无明显差异，成瘤率均为100％，且均未形成肿瘤在腹腔内广泛种植的现象，利用bx41显微镜系统100倍光镜下观察肿瘤组织标本，结果表明，包埋法和夹心法建立的小鼠肝癌原位移植瘤肿瘤细胞及组织生长良好，未出现坏死，细胞形态一致，癌细胞成癌巢状分布，癌巢周围为纤维结缔组织(图2)，a和b分别为包埋法和夹心法建立balb/c裸小鼠肝癌原位移植瘤的病理照片，两种方法建立的肝癌原位癌实体瘤生长良好，癌细胞形态一致，成巢状分布，未出现坏死，通过以上结果，进一步提供一种肝癌原位移植模型、肝癌皮下移植模型发展的影像学研究模型、肝癌原位移植新型诊断分子和方法的研究模型等，应用范围广，可以让人们更深入的了解肝癌肿瘤，在其早期诊断、治疗和预防复发上能有所突破。
29.本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。