Salipro颗粒的生产的制作方法

salipro颗粒的生产
技术领域
1.本发明涉及制备鞘脂激活蛋白(saposin)脂蛋白颗粒的方法，鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白、脂质和任选的疏水剂。


背景技术：

2.膜围绕所有活细胞并形成许多病毒(例如，hiv)的包膜。在活细胞中，细胞膜作为半渗透屏障以保存细胞的内容物。膜组分、特别是诸如受体和转运体之类的膜蛋白也决定并调节细胞如何与其环境相互作用。包括诸如信号转导、分子转运、能量代谢、形成细胞
‑
细胞接触和细胞内稳态之类的生物过程的调节细胞如何与其环境相互作用的功能是关键的，并且依赖于膜蛋白。全部orf的约30％编码膜蛋白(参见文献“wallin和von heijne，protein science 1998 apr；7(4):1029
‑
38”)，因此大体上代表四分之一的细胞蛋白。病毒包膜的膜蛋白也用于介导与诸如宿主细胞膜之类的环境的相互作用，使得病毒衣壳和病毒基因组能够进入并感染宿主细胞。
3.由于膜蛋白的上述关键功能，因此膜蛋白是生命科学、特别是药物探索方面研究的极大热点。事实上，大多数药物、即大于60％的药物靶向膜蛋白(参见文献“overington等人，nature reviews drug discovery 5，993
‑
996(2006年12月)”)。因此，对于研究目的和临床药物开发而言关键在于，可以将膜蛋白以及其他疏水剂(例如，疏水性药物)用于最先进的技术平台，而不会损害疏水剂或技术的功能。这提出了一个悖论，因为大多数膜蛋白和其他疏水剂需要疏水环境(理想地嵌入模拟其天然膜环境的结构中)以正常运行。然而，通常在最先进技术平台上进行的大多数生化试验均基于这些试验和平台正常运行所需要的水性系统。因此，本发明的目的是提供改进的和更有效的配制疏水剂的方法，以使疏水剂可溶于水性系统，同时保持或模拟疏水剂的天然膜和脂质环境。
4.这也将使得能够在高通量筛选(hts)中采用膜蛋白或其他疏水剂，在高通量筛选的最先进装置中，通常也需要在水性系统中的溶解度以正常运行。分子生物学、计算、机器人学和检测技术的进步已经使hts发展成为制药学、生物技术和生命科学研究的“主力”。通过快速且并行执行生化测试，hts能够快速鉴定调节特定生物分子通路的药物、抗体、分子相互作用和蛋白质。所获得的结果为进一步的药物设计以及理解特定生化过程在生命系统中的作用提供了起点和重要的线索。
5.缩小hts规模的迫切需求结合微流体学的进步已经使得生物化学芯片实验室(lab
‑
on
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a
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chip)方法不断发展，其中可以在小规模装置中更快速并且以更低的成本进行分析。如果人们能够在此类hts或芯片实验室应用中常规地也采用膜蛋白和其他疏水剂，那么将展现出重大进步。为此，通常需要将测试试剂固定在诸如芯片之类的表面上。因此，本发明的另一目的是提供将疏水剂固定在支持物上的改进且更有效的方式，特别是通过使疏水剂与水性测试系统相容，而同时保持或模拟疏水剂的天然膜和脂质环境。
6.用于测定生物化学相互作用和反应(例如，配体与其相应受体的结合、抗体与其相应抗原的相互作用或者通过酶转化底物)的许多最先进装置依赖于生物传感器和连接至固
a1”)。
15.saplip家族基于4种鞘脂激活蛋白基础成员。这些鞘脂激活蛋白为小(大约80个氨基酸)蛋白，包括鞘脂激活蛋白a到d，其与脂质结合和/或相互作用，并且在鞘脂的分解代谢中作为几种溶酶体酶的重要辅因子(参见“bruhn，biochem j.(2005)389，249
‑
257”和其所引用的文献)。据描述，鞘脂激活蛋白更偏好带负电荷的脂质和低ph环境，在酸性ph环境中显示出明显提高的活性，最佳ph值为溶酶体内4.75的ph值。鞘脂激活蛋白a、b、c和d由单一的大的前体蛋白，即鞘脂激活蛋白原(prosaposin)通过蛋白水解作用水解而得。已经报道了鞘脂激活蛋白a、b、c和d的完整氨基酸序列、以及鞘脂激活蛋白原的基因组结构和cdna序列(请参见“o'brien等人(1988)science 241，1098
‑
1101；furst等人(1992)biochim biophys acta 1126:1
‑
16”)。
16.鞘脂激活蛋白c在酸性环境中能够诱导含磷脂的囊泡发生膜融合(参见“archives of biochemistry and biophysics 2003 jul 1；415(1):43
‑
53”)，其他鞘脂激活蛋白没有表现出该特征。文献“qi等人(2009)clin cancer res 15(18):5840
–
5851”报道了鞘脂激活蛋白c偶联的二油酰基磷脂酰丝氨酸纳米囊泡(sapc
‑
dops)，其包括含水内部、大约190nm的平均直径，并且在体内表现出肿瘤靶向活性。在sapc
‑
dops中，鞘脂激活蛋白c或其衍生肽作为其结合的脂质体的导向肽(homing peptide)。鞘脂激活蛋白c而后使脂质体靶向到细胞膜外叶暴露有磷酯酰丝氨酸的癌细胞。作者认为，由于溶酶体酶的细胞外泄漏而导致的癌细胞周围的独特酸性微环境使得肿瘤组织成为鞘脂激活蛋白c的最佳靶标。根据qi等人所述，sapc
‑
dops溶酶体通过以下方法制备：在n2(g)下干燥溶剂溶解的纯化的磷脂，将干燥的磷脂分散在含有纯化的鞘脂激活蛋白c的酸性缓冲液(ph 5)中，在生理水溶液中将混合物稀释50倍，以及通过后续的超声处理促进纳米囊泡组装。
17.文献“popovic等人，pnas，vol.109，no.8(2012)2908
‑
2912”报道了鞘脂激活蛋白a去垢剂盘的结构。鞘脂激活蛋白a以可溶的、脂质/去垢剂
‑
结合的状态存在。在脂质缺乏时，鞘脂激活蛋白a采取封闭的无配体(apo)构象。相反，popovic等报道的鞘脂激活蛋白a去垢剂盘结构显示了开放构象的鞘脂激活蛋白a的两条链，其包裹了40个内部结合的去垢剂分子，它们被组织在高度有序的双层样疏水核心中。
18.除了鞘脂激活蛋白a去垢剂盘的结晶作用，popovic等还描述了可溶性脂质
‑
鞘脂激活蛋白a复合物的制备，在ph 4.75时通过需要多步的方法进行制备。首先，通过如下方式制备均匀级分的大单层脂质体囊泡：在n2(g)下干燥用氯仿溶解的纯化的脂质，通过涡旋混合将干燥的脂质分散在酸性缓冲液(50mm乙酸钠ph 4.8，150mm nacl)中，对悬浮液进行10个冻融循环，在涡旋混合器中混合5分钟，并将混合物挤压通过200nm过滤器。在酸性缓冲液中将由此制备的大单层人造脂质体囊泡与纯化的鞘脂激活蛋白a混合，由此获得可溶性脂质
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鞘脂激活蛋白a颗粒。该颗粒表现出窄的尺寸分布，即，大约平均3.2nm的流体动力学(斯托克斯)半径，并且每个鞘脂激活蛋白a链含有大约5:1的脂质分子。颗粒的精确尺寸仅适度地受到脂质与蛋白的摩尔比以及脂质体的组成的影响。无论在脂质体混合物中是否存在阴离子磷脂、胆固醇或鞘糖脂，作者均观察到了相似的3.2nm的颗粒。在所有情况下，在3.2nm斯托克斯半径的尺寸范围内观察到了单一的峰，这表明了相对窄的种类分布。因此，该文献公开的技术受限于4.75的ph值、上述颗粒尺寸以及包括繁复的上游脂质体制备步骤。
19.wo 2014/095576 a1首次表明，可以使用去垢剂溶解的且纯化的脂质将纯化的、去
垢剂溶解的疏水性货物分子或纯化的、去垢剂溶解的膜蛋白纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中。wo 2014/095576 a1所述的方法使得能够通过使液体环境中的鞘脂激活蛋白样蛋白与溶解的脂质和疏水剂接触而进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装，所述疏水剂为纯化的、去垢剂溶解的疏水性货物分子的形式或纯化的、去垢剂溶解的膜蛋白的形式。单独的组分全部以游离和可溶形式存在，并且它们自组装成鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒是基于所有涉及的颗粒组分在液体环境中的自由随机运动。
20.wo 2015/036549 a1将wo 2014/095576 a1中描述的方法扩展到纳入来自定义明确且纯化的hiv
‑
1病毒样颗粒(vlp)的溶解的抗原分子(示于病毒膜蛋白)。根据wo 2015/036549 a1的例子，将预纯化的vlp裂解，利用去垢剂溶解hiv
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1膜刺突蛋白，然后在液体环境中使游离刺突蛋白与游离鞘脂激活蛋白a蛋白接触。这样，鞘脂激活蛋白样蛋白提供脂质模拟环境，使得抗原分子在其中组装。同样地，在此，单独的组分全部以游离和可溶形式存在，并且它们自组装成鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒是基于所有涉及的颗粒组分在液体环境中的自由随机运动。
21.wo 2018/033647 a1公开了一种由细胞或细胞器膜制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的文库的方法。wo 2018/033647 a1使得能够直接使用粗制细胞或细胞器膜作为起始材料以组装鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，而不是必须采用溶解的、纯化的脂质和蛋白质组分。这样，获得了包括具有不同膜脂质和/或膜蛋白组分的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的异质混合物的文库。因此，通过wo 2018/033647 a1的方法获得的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库提供了产生鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的真实膜的微结构域和组分的快照。wo 2018/033647 a1的方法通过在液体环境中提供与鞘脂激活蛋白样蛋白接触的粗制膜或粗制膜囊泡，使得能够进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装。同样地，在此，在组装过程中，单独的组分全部以游离(即，非支持物结合的)形式存在，并且它们自组装成鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒是基于所有涉及的颗粒组分在液体环境中的自由随机运动。
22.尽管wo 2014/095576 a1、wo 2015/036549 a1和wo 2018/033647 a1通过提供一类新的源于鞘脂激活蛋白蛋白质的纳米颗粒而表现出显著的改进，该纳米颗粒具有许多优于现有纳米盘技术的优点，但是仍然需要进一步改进用于制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法。
23.对于鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒在商业应用中的用途，需要以降低的生产成本提供大量的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。因此，在效率、成本和资源使用方面，需要用于组装鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的改进方法。
24.鉴于如上说明的在制药学和生命科学研究中的技术平台日益增加的重要性，关键是纳入到可溶性纳米颗粒中的疏水剂可在这些平台中使用。然而，如在生物传感器应用的情况下，这通常需要将纳米颗粒固定到支持物上。
25.可以进一步优化用于制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的现有技术方法，以有效、节约成本和节约资源地生产纳米颗粒。特别地，现有技术方法要求并假定在颗粒组装期间起始材料在液体环境中的流动性不受限制。此外，现有技术不提供将多余的颗粒组分再循环以用于另一颗粒组装反应的简单可能性。
26.本发明的目的是解决一个或多个上述缺点。


技术实现要素：

27.本发明的根本问题大体上体现在提供一种改进的、节约成本和节约资源的方法以生产鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。
28.通过权利要求1限定的方法解决该问题。在从属权利要求中描述有利的实施方案，并且在下文中进一步描述有利的实施方案。
29.本发明提供了一种用于生产鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其中生产的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒包含
30.‑
鞘脂激活蛋白样蛋白，
31.‑
脂质，以及
32.‑
任选的疏水剂，其中该疏水剂不同于脂质，并且
33.(i)其中该方法包括以下步骤：
34.a)提供脂质和任选的疏水剂；
35.b.1)使鞘脂激活蛋白样蛋白与支持物在液体环境中接触，该支持物能够使鞘脂激活蛋白样蛋白选择性结合至支持物；
36.c.1)使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与脂质和任选的疏水剂接触，以使得能够在支持物上进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装；
37.d)任选地，洗脱支持物结合的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒；或
38.(ii)其中可选地，该方法包括以下步骤：
39.a)提供疏水剂和脂质；
40.b.2)使疏水剂与支持物接触，该支持物能够使疏水剂选择性结合至支持物；
41.c.2)使支持物结合的疏水剂与鞘脂激活蛋白样蛋白接触，以使得能够在支持物上进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装；
42.d)任选地，洗脱支持物结合的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。
43.在根据本发明的方法中，将疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白这两者中的一者选择性结合至支持物，并且通过使支持物结合的疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白与鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的其余组分接触从而以该支持物结合的状态发生颗粒组装，这使得能够在支持物上进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装。这不同于依赖于组装方法的现有技术的方法，在现有技术的组装方法中，单独的组分全部以游离(即，非支持物结合的)形式存在，并且它们自组装成鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒是基于所有涉及的颗粒组分在液体环境中的自由随机运动。
44.本发明方法的优点是，鞘脂激活蛋白样蛋白或疏水剂选择性结合至支持物，这直接产生了支持物结合的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，或者后来组装的颗粒可以从支持物上洗脱。这将形成的salipro颗粒的量限制为预先结合的颗粒组分的量，即结合的鞘脂激活蛋白样蛋白或结合的疏水剂这两者中的一者的量。因此，任何保持未结合的物质都可以再利用。再利用可以分别涉及步骤b.2)和b.1)中未结合至支持物的鞘脂激活蛋白样蛋白或疏水剂。然而，再利用也可涉及多余的颗粒组分，多余的颗粒组分与支持物结合的物质接触以使得能够在步骤c.1)/c.2)中进行salipro颗粒的自组装，但未纳入到颗粒中。“未使用的”组分的这种再利用使得能够进行节约成本和节约资源的颗粒组装。
45.如果无论如何都需要以支持物结合的状态使用鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，那么将
鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒直接组装到支持物上是特别有利的。这是许多基于芯片的分析应用的情况，例如生物传感器应用，特别是光学生物传感器应用如表面等离子体共振。这些将在下文中更详细地描述。过去，必须首先通过现有技术方法制备游离的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，然后需要第二偶联步骤以将它们固定在支持物上。利用本发明的方法，能够在支持物上进行实际颗粒组装，这节省了额外的成本和工艺步骤。
46.令人惊讶地，当一种颗粒组分，即鞘脂激活蛋白样蛋白或疏水剂结合至支持物时，也能组装salipro颗粒。颗粒组分中的一者与支持物的结合限制了其与溶液中其他颗粒组分接触的自由度，以及其与颗粒组分空间相互作用的自由度。因此，预期颗粒组装的效率受损，最终也会影响所获得的颗粒的总收率。
47.必须记住，必须假定鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒组装涉及鞘脂激活蛋白脂蛋白结构和脂质组织的显著重排(例如，从游离脂质的随机运动到高度有序的纳米膜双层结构)。当从闭合的游离脂质形式转换为开放的脂质结合状态时，鞘脂激活蛋白蛋白质可能经历构象变化。据认为，颗粒自组装涉及鞘脂激活蛋白样蛋白捕获并包围将纳入颗粒的脂质和疏水剂的步骤。尽管已知在溶液中发生该自组装，但是完全出乎意料地观察到，当将主要颗粒组分中的一者(即，鞘脂激活蛋白蛋白质或疏水剂)固定在固体支持物上时，它同样良好且快速地起作用。
48.出乎意料地发现，用根据本发明的方法可以获得高质量的支持物结合的salipro颗粒，该方法提供了容易、快速且有效的生产支持物结合的salipro颗粒的方法，所述salipro颗粒随着时间的推移保持均匀的质量和组成。本发明原则上提供了通过salipro颗粒的缠绕组装和偶联获得支持物结合的salipro颗粒的更有效且更直接的方法。这样，疏水剂可以在一个连续的过程中溶入模拟它们天然膜环境的稳定颗粒，同时固定在支持物上，以直接用于诸如芯片实验室或生物传感器(例如spr)的应用。
49.通过本发明的方法获得的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒原则上与现有技术中已知的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒相同，只是它们直接处于支持物结合形式。在本文中也将鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒称为“salipro颗粒”。它们是包含鞘脂激活蛋白样蛋白、疏水剂和脂质的纳米颗粒。将在下文进一步定义这些组分及其有利的实施方案。鞘脂激活蛋白样蛋白属于公知且保守的saplip家族的脂质相互作用蛋白或者是其衍生物或截短形式。
50.本发明人的实际实验表明，salipro颗粒的尺寸可根据纳入的疏水剂和脂质的性质而自我调节，例如根据纳入的膜蛋白的尺寸而自我调节。令人惊讶地，salipro颗粒在尺寸方面是灵活的。此外，在根据本发明的方法中，还观察到根据纳入的疏水剂的性质调节salipro颗粒的尺寸。这优于其他非鞘脂激活蛋白衍生的现有技术颗粒的尺寸限制。这种灵活性也使得能够纳入非常大的疏水剂，例如(多聚体)膜蛋白。因此，本发明的方法特别具有的优点是它们可以在其天然环境中重构，例如膜脂质或与膜蛋白相关并且可能是维持蛋白质的结构和/或功能所必需的其他细胞组分。
51.令人惊讶地，salipro颗粒表现出一定程度的热稳定性，并且当结合至支持物时，看起来也易于冷冻干燥和再水合，而没有观察到大的质量劣化。这使得通过本发明的方法获得的salipro颗粒能够用于具有便携性和储存稳定性的问题的应用中。使用本发明的方法，能够获得支持物结合的salipro颗粒，这些颗粒可以预先定制、储存并随后运送至最终用户。也能够将这些颗粒用于在较长时间段的应用中，例如多次重复使用相同芯片的芯片
实验室。
52.已经证明用本发明的方法获得的支持物结合的salipro颗粒能够在生理ph的条件下纳入各种脂质、膜蛋白和疏水性化合物，从而产生在水性环境中可溶、但支持物结合且稳定的纳米级复合物。对于迄今为止进行试验的疏水剂、特别是对于许多复合膜蛋白而言，纳入支持物结合的salipro颗粒对这些疏水剂的生物学功能没有负面影响。相比之下，对于许多上述疏水剂而言，将其纳入salipro颗粒有效地模拟了疏水剂的天然膜环境，因此对疏水剂的生物学功能具有积极影响。
53.本发明还提供了以下优点，可通过纳入到根据本发明的方法(i)制备的salipro颗粒中而间接固定不能够直接固定在支持物上而不损害或丧失其生物学功能的疏水剂，即，其中salipro颗粒不是经由疏水剂结合至支持物，而是经由鞘脂激活蛋白样蛋白中的结合部分结合至支持物。这使得疏水剂保持未改性和/或不与支持物直接接触，同时仍然有效地结合至支持物。
54.如上所述，在诸如芯片实验室或生物传感器(例如，spr)应用之类的基于芯片的应用中，提供支持物结合的salipro颗粒(其也可任选地从支持物洗脱)是非常有用的工具。
55.看起来，通过将疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白选择性结合至支持物并使它们与各自的其他强制性颗粒组分接触，本发明的方法提供了强有力的技术以组装salipro颗粒，该颗粒在宽的ph范围(特别是在生理ph下)的含水溶液中是稳定的，从而能够得到比根据popovic等人的现有技术教导而得自合成制备的脂质体的3.2nm鞘脂激活蛋白a衍生的脂蛋白颗粒更大的颗粒。
56.如在背景技术中所述，膜蛋白在治疗性研发中的重要性使得需要探索用于在无细胞培养基中(优选在无去垢剂的环境中)查询(interrogating)膜蛋白的创新方法。
57.通过本发明的方法获得的salipro颗粒满足该要求。salipro颗粒一经获得，则在无细胞培养基和无去垢剂的环境中是稳定的，并且直接结合至它们随后可以使用的支持物上。
58.在本发明的特别有利的实施方案中，以包含待纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的疏水剂和脂质的生物膜的形式提供待纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的疏水剂和脂质。特别地，病毒、古细菌、真核生物或原核生物的膜可以作为疏水剂和脂质的源材料直接用于本发明的方法。可以以细胞、病毒或细胞器的形式提供生物膜，所有这些细胞、病毒或细胞器都可以是完整的、用两亲性试剂处理的或裂解的。两亲性试剂可以选自由去垢剂、两亲性肽、两亲性聚合物、其他两亲性化合物和它们的混合物组成的组。根据本发明可以使用的两亲性聚合物的实例为马来酸共聚物，特别是苯乙烯
‑
马来酸共聚物(sma)或二异丁烯
‑
马来酸共聚物(dibma)。可以将两亲性肽和两亲性聚合物认为是专用去垢剂。合适的sma(例如)描述于postis，vincent等人的文献“the use of smalps as a novel membrane protein scaffold for structure study by negative stain electron microscopy.”biochimica et biophysica acta(bba)
‑
biomembranes 1848.2(2015):496
‑
501。dibma是市售可得的，例如从anatrace作为bma101市售的。优选地，两亲性试剂是如本文所定义的去垢剂。优选地，细胞是真核生物细胞、特别是非人动物或人的细胞。令人惊讶地，本发明之前的研究已经表明不需要纯化生物膜。当然，当使用本发明的方法时，可以直接由完整的、用两亲性试剂处理的或裂解的细胞、病毒或细胞器制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。
59.通过在本发明的方法中使用生物膜作为起始材料，疏水剂可与其天然的膜环境一起纳入salipro颗粒。与wo 2018/033647 a1的方法相比，本发明的方法的可选方案(ii)的优点是仅制备包含目的疏水剂的salipro颗粒，而不是制备代表整个膜蛋白质组/脂质组的salipro颗粒的完整文库，需要从该文库中再次分离出包含目的疏水剂的颗粒。此外，本发明的方法优于wo 2018/033647 a1之处在于，可以以直接、简化且连续的“一步法”获得支持物结合的颗粒，这是成本有效且理想的，特别是如果salipro颗粒以支持物结合的形式使用，则更是如此。
60.通过在本发明的方法的可选方案(i)中使用生物膜作为起始材料，可以获得salipro颗粒的文库，其中该文库包括具有不同膜脂质和膜蛋白组分的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的异质混合物。与wo 2018/033647 a1的方法相比，本发明方法的该实施方案的优点是可以在连续的“一步法”中获得支持物结合的颗粒，这是成本有效且理想的，特别是如果salipro颗粒库以支持物结合的形式使用，则更是如此。
61.通过本发明的方法获得的salipro颗粒或salipro颗粒的文库可用于医药、用于诊断方法、美容治疗或用作疫苗接种制剂。此外，通过本发明的方法可获得的颗粒可用作以下方面的工具：诊断、药物研发、药物筛选、药物探索、抗体开发、治疗性生物制剂开发、膜或膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究、膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或膜蛋白质组数据库。
62.发明详述
63.本发明提供了用于生产鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其中生产的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒包含
64.‑
鞘脂激活蛋白样蛋白，
65.‑
脂质，以及
66.‑
任选的疏水剂，其中该疏水剂不同于脂质，并且
67.(i)其中该方法包括以下步骤：
68.a)提供脂质和任选的疏水剂；
69.b.1)使鞘脂激活蛋白样蛋白与支持物接触，该支持物能够使鞘脂激活蛋白样蛋白在液体环境中选择性结合至支持物；
70.c.1)使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与脂质和任选的疏水剂接触，以使得能够在支持物上进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装；
71.d)任选地，洗脱支持物结合的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒；或
72.(ii)其中可选地，该方法包括以下步骤：
73.a)提供疏水剂和脂质；
74.b.2)使疏水剂与支持物接触，该支持物能够使疏水剂选择性结合至支持物；
75.c.2)使支持物结合的疏水剂与鞘脂激活蛋白样蛋白接触，以使得能够在支持物上进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装；
76.d)任选地，洗脱支持物结合的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。
77.特别地，根据本发明的方法能够提供支持物结合的salipro颗粒，其中各salipro颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白、脂质和疏水剂。当在步骤a)中(例如)以生物膜的形式提供了一组复杂的脂质和疏水剂时，在本发明的方法的可选方案(i)中产生salipro颗粒的文
库。该文库将包括含有鞘脂激活蛋白样蛋白、疏水剂(例如，膜蛋白)和脂质的salipro颗粒，但也可包括仅由脂质和鞘脂激活蛋白样蛋白组成的salipro颗粒。
78.在本文中也将鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒称为“salipro颗粒”。它们包含鞘脂激活蛋白样蛋白和脂质作为强制性组分。通常，salipro颗粒包含一种类型的鞘脂激活蛋白样蛋白。通常，而且也根据优选的实施方案，根据本发明制备的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白、脂质和疏水剂。
79.本发明的salipro颗粒还可以包含多种疏水剂，这些疏水剂可彼此相同或不同。salipro颗粒中相同疏水剂的多聚体的实例是多聚体膜蛋白或多种疏水性化合物。salipro颗粒中不同的疏水剂的实例是包含膜蛋白和疏水性化合物的salipro颗粒。
80.本发明的salipro颗粒包含多种脂质，这些脂质可以彼此相同或不同。
81.本发明的方法中使用的鞘脂激活蛋白样蛋白是鞘脂激活蛋白样蛋白(saplip)或其衍生物或截短形式。术语“鞘脂激活蛋白样蛋白”(saplip)是本领域熟知的，并且包括脂质相互作用蛋白的保守鞘脂激活蛋白样蛋白(saplip)家族的所有成员。所使用的缩写“saplip”与术语“鞘脂激活蛋白样蛋白”同义。saplip家族的特征是具有鞘脂激活蛋白折叠，其为通过高度保守的分子内二硫键保持稳定的保守的α螺旋三维结构(参见文献“munford等人(1995)，journal of lipid research，vol.36，no.8，1653
‑
1663”和“bruhn(2005)，biochem j 389(15):249
‑
257”)。本发明所述的鞘脂激活蛋白样蛋白(saplip)家族的成员的例子在文献“munford等人(1995)，journal of lipid research，vol.36，no.8，1653
‑
1663”和“bruhn(2005)，biochem j 389(15):249
‑
257”中有所描述，在此通过引用的方式将其全部内容并入本文。
82.在无配体(即，无去垢剂/无脂质)的“封闭”状态下，saplip采取单体紧凑四螺旋束型结构，即，鞘脂激活蛋白折叠。该折叠可以列举以下结构：人脂激活蛋白a的封闭无配体形式的结构(蛋白数据库(pdb)id编号:2dob，参见“ahn等人(2006)protein sci.15:1849
‑
1857”)或鞘脂激活蛋白c的结构(pdb id编号:1m12；参见“de alba等人(2003)biochemistry 42，14729
‑
14740”)、nk
‑
溶素(nk
‑
lysin)的结构(pdb id编号:1nkl；参见“liepinsh等人(1997)nat.struct.biol.4，793
‑
795”)、阿米巴穿孔素a(amoebapore a)的结构(pdb id编号:1of9)和颗粒溶素(granulysin)的结构(pdb id编号:1l9l；参见“anderson等人(2003)j.mol.biol.325，355
‑
365”)，它们的结构均几乎相同并且易于重叠(super
‑
imposable)。
83.saplip在结合至配体(例如脂质或去垢剂分子)后发生构象变化。在配体结合“开放”构象中，saplip采取v形或飞旋标形构象，暴露出与所结合的脂质接触的疏水表面。该开放构象可列举以下结构：现有技术中的鞘脂激活蛋白a去垢剂盘结构(pdb id编号:4ddj；参见“popovic等人，pnas，vol.109，no.8(2012)2908
‑
2912”)、和结合至sds去垢剂胶束的鞘脂激活蛋白c的结构(pdb id编号:1sn6；参见“hawkins等人(2005)j.mol.biol.346:1381
‑
1392”)。
84.在salipro颗粒中，鞘脂激活蛋白样蛋白优选为两亲性的，其结构的一部分或多或少是亲水的并且面向水性溶剂，另一部分或多或少是疏水的并且面向所述颗粒的包含脂质的疏水中心。鞘脂激活蛋白样蛋白优选具有如下特点：具有这样的两亲性α螺旋，其具有更多的主要位于螺旋的一面上的疏水残基(如a、c、f、g、i、l、m、v、w或y)、以及更多的位于螺旋
的另一面上的极性或带电荷的残基(如d、e、n、q、s、t、h、k或r)。
85.本文所使用的氨基酸残基的缩写如下：a、ala、丙氨酸；v、val、缬氨酸；l、leu、亮氨酸；i、lie、异亮氨酸；p、pro、脯氨酸；f、phe、苯丙氨酸；w、trp、色氨酸；m、met、甲硫氨酸；g、gly、甘氨酸；s、ser、丝氨酸；t、thr、苏氨酸；c、cys、半胱氨酸；y、tyr、酪氨酸；n、asn、天冬酰胺；q、gln、谷氨酰胺；d、asp、天冬氨酸；e、glu、谷氨酸；k、lys、赖氨酸；r、arg、精氨酸和h、his、组氨酸。
86.与现有技术中的载脂蛋白衍生纳米盘不同，本发明的鞘脂激活蛋白样蛋白不以双带样形式包封脂质，相反，salipro颗粒通过包含脂质的核心保持在一起，所述脂质被两个或更多个近似v形或飞旋标形状的定向排列的鞘脂激活蛋白样蛋白围绕，并且在给定的salipro颗粒中，每个鞘脂激活蛋白样蛋白之间实质上没有直接的蛋白与蛋白的接触。希望不限于理论，据认为salipro颗粒中的鞘脂激活蛋白样蛋白和脂质的这种排列方式提供了尺寸灵活性，这在体积大的疏水剂或量增加的脂质被纳入本发明的方法的颗粒中时可以观察到。
87.尽管saplip具有与脂质相互作用的能力以及上述的两亲性性质，并且三维结构高度保守，但是它们在氨基酸序列水平上是高度多变的，其序列同一性低于定义同源性通常所用的25％至30％同一性的阈值范围(参见“bruhn(2005)，biochem j 389(15):249
‑
257”的图4a和4b中的序列比对，其在所附的图13a和13b中再现)。
88.在脂蛋白salipro颗粒中，鞘脂激活蛋白样蛋白主要作为结构蛋白，为脂蛋白salipro颗粒的结构(例如，盘状结构)提供框架。由于这个原因，与仅仅作为序列决定簇相比，结构特征、特别是saplip的鞘脂激活蛋白折叠这一特征对于限定本发明的鞘脂激活蛋白样蛋白更加重要。
89.本发明所述splip的例子为鞘脂激活蛋白a、b、c或d(例如以下来源的：人(homo sapiens)[参见seq id no.1
‑
4]、马(equus caballus)、牛(bos taurus)、小家鼠(mus musculus)、家兔(oryctolagus cuniculus)、大家鼠(rattus norvegicus)或非洲爪蟾(xenopus laevis))；表面活性蛋白b(例如以下来源的：人、家犬(canis familiaris)、小家鼠、家兔、绵羊(ovis aries)或大家鼠)；颗粒溶素(例如人源的，参见seq id no.5)；nk溶素(如野猪(sus scrofa)源的；参见seq id no.6)；nk溶素直系同源物(orthologues)(如马或牛来源的)；阿米巴穿孔素(如溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)来源的)；阿米巴穿孔素直系同源物(如迪斯帕内阿米巴(entamoeba dispar)或侵袭内阿米巴(entamoeba invadens)来源的)；阿米巴穿孔素样蛋白(如肝片吸虫(fasciola hepatica)来源的)；耐格里属阿米巴穿孔素(naegleriapores)(如福氏耐格里阿米巴(naegleria fowleri)来源的)；华支睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(clornorin)(如华支睾吸虫(clonorchis sinensis)来源的)；鞘脂激活蛋白原(如人、马、牛、小家鼠、家兔、大家鼠或非洲爪蟾来源的)和msap(如人源的)。
[0090]
根据本发明所用的特定的saplip的序列在文献“bruhn(2005)，biochem j 389(15)：249
‑
257”的图4a和4b中给出，其在所附的图13a和13b中再现，并且其中的序列特别通过引用并入本文。在如下序列表中给出根据本发明使用的特定saplip的序列：
[0091]
表1
(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_stretcher/)，使用程序的默认设置。
[0101]
在另一实施方案中，saplip衍生物为包括这样的序列的多肽，在相应的saplip的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。例如，saplip衍生物可以为包括特定的saplip序列的多肽，所述特定的saplip序列中有1到40个、优选1到30个、以及特别为1到20个或1到15个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。
[0102]
本文所用术语“缺失”是指从各自的起始序列中移除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
[0103]
本文所用术语“插入”或“添加”是指向各自起始序列中插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
[0104]
本文所用术语“置换”是指将位于某一位点的氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基。
[0105]
在优选的实施方案中，saplip的衍生物或截短形式选自
[0106]
i.与seq id no.1、2、3、4、5或6的全长序列具有至少20％序列同一性的蛋白质；特别是与seq id no.1、2、3、4、5或6的全长序列具有至少20％序列同一性的蛋白质，其中当用于权利要求1所述的方法时，所述蛋白质能够与脂质一起自组装成脂蛋白颗粒；以及
[0107]
ii.包括seq id no.1、2、3、4、5或6的序列的蛋白质，该序列中有1至40个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。
[0108]
当用于权利要求1的方法时，例如，在鞘脂激活蛋白样蛋白的衍生物与seq id no.1、2、3、4、5或6的全长序列具有至少20％序列同一性的实施方案中，本文所述的序列同一性可与所述蛋白质是两亲性的、形成至少一个α螺旋、并且能够与脂质一起自组装成脂蛋白颗粒的特征进行组合。
[0109]
根据其他实例方案，鞘脂激活蛋白样蛋白是包括一个或多个seq id no.1的片段的鞘脂激活蛋白a衍生物。优选的片段对应于鞘脂激活蛋白a的螺旋α1、α2、α3和α4，其中螺旋α1由以下氨基酸“slpcdickdvvtaagdmlk”的连续序列形成；其中螺旋α2由以下氨基酸“ateeeilvylektcdwl”的连续序列形成；其中螺旋α3由以下氨基酸“pnmsasckeivdsylpvildiikgems”的连续序列形成；其中α4螺旋由以下氨基酸“pgevcsal”的连续序列形成。根据特定实施方案，鞘脂激活蛋白a的衍生物为包含选自鞘脂激活蛋白a的螺旋α1、α2、α3、α4及其组合中的序列的多肽，特别地，其中所述多肽包含鞘脂激活蛋白a的螺旋α1、α2和α3的序列。鞘脂激活蛋白a的片段(例如其螺旋α1、α2、α3、α4)可以在氨基酸序列中具有一或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。
[0110]
根据其他实施方案，鞘脂激活蛋白样蛋白为包括一个或多个涉及上述段落中鞘脂激活蛋白a所定义的片段的鞘脂激活蛋白样蛋白的衍生物，其中由各个鞘脂激活蛋白样蛋白的相应序列取代该片段。
[0111]
根据一个实施方案，当saplip的衍生物或截短形式被用作根据本发明的鞘脂激活蛋白样蛋白时，所述衍生物或截短形式应当是两亲性的，形成至少一个α螺旋。此外，或可选地，当用于根据本发明的方法时，所述衍生物或截短形式应当能够与脂质一起自组装成脂蛋白颗粒。本文所用术语“两亲性”是指多肽或分子既具有亲水区域又具有疏水区域。
[0112]
优选地，如果使用saplip的衍生物，应当存在与saplip的基础成员鞘脂激活蛋白a中的六个半胱氨酸残基相对应的至少三个、至少四个、至少五个或全部六个半胱氨酸。这方
面可参见文献“bruhn(2005)，biochem j 389(15):249
‑
257”的图4a和4b的序列比较中的半胱氨酸的位点。bruhn等人的图4a和4b的序列和序列比对在附图13a和13b中再现，并特别通过引用并入本文。
[0113]
根据本发明的saplip也可以包含一个或多个非天然氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物(peptidomimetic)结构，其中肽键被更加耐受代谢降解的结构取代。
[0114]
本发明方法的步骤a)
[0115]
在本发明方法的步骤a)中，提供了待纳入salipro颗粒的脂质和任选的疏水剂。重要地，在该方法的其他步骤中还可以提供其他脂质和/或疏水剂。
[0116]
本文使用的“一个(a)”和“该(the)”通常的意义是“至少一个”或“至少一种类型”。例如，在本发明的salipro颗粒中包含至少一种疏水剂，并相应地在步骤a)中提供至少一种疏水剂。
[0117]
疏水剂和/或脂质可以与其他成分一起以组合物的形式提供。优选地，疏水剂和/或脂质以液体组合物的形式提供。在一个实施方案中，液体组合物包含有机溶剂。在另一实施方案中，液体组合物是含水组合物。在另一实施方案中，液体组合物为包含去垢剂的含水组合物。在其他实施方案中，液体组合物为疏水剂和/或脂质分散在水相中的分散体。
[0118]
疏水剂和脂质可以一起提供或以分开的形式提供。如果将疏水剂和脂质一起提供，则可以以生物膜或衍生自生物膜的组合物的形式提供疏水剂和脂质。例如，脂质和任选的疏水剂可以以细胞膜、核内体、外来体、病毒样颗粒或脂质体的形式提供。如果提供不同的脂质和/或不同的疏水剂，则同样可以一起提供或以单独的形式提供。当用于本发明的方法时，生物膜可以以完整的、用两亲性试剂处理的或裂解的细胞、病毒或细胞器的形式提供。
[0119]
疏水剂不同于另外包含在颗粒中的脂质。这就是说，如果疏水剂本身是脂质或经修饰的脂质，那么颗粒中包含的大多数脂质(即，大于颗粒中所存在的脂质的总量的50mol％)应当与形成疏水剂的脂质不同。在一个实施方案中，疏水剂不是脂质；在另一实施方案中，疏水剂既不是脂质也不是去垢剂。
[0120]
如本文所用的“疏水剂”是指基本上疏水的任何分子。“疏水性”是本领域的术语，并且是指与水不混溶或在水中强烈缺乏亲和力/溶解度的性质。疏水剂可以是疏水性有机化合物和/或疏水性生物分子。疏水剂可以为有治疗活性或生物活性的疏水剂，或者为简单地使salipro颗粒的盘状形状保持稳定的疏水剂。疏水剂是这样的试剂(即，化合物和/或生物分子)，其不完全渗入水中和/或在水中不完全保持可溶，和/或当其存在于水相中时，其倾向于聚集和/或分层进入疏水环境。通过被包含在salipro颗粒中，疏水剂被有效地溶解于颗粒的疏水内部。因此，疏水剂能够保持其天然的功能性，诸如(例如)催化活性或配体结合活性。
[0121]
包含于salipro颗粒中的疏水剂通常包含至少一个能够缔合或整合到脂双层的疏水部分中的疏水(如亲脂的)区域。因此，该疏水剂还可以是嵌合分子，其中能够缔合或整合到脂双层的疏水部分的疏水(如亲脂的)部分、模块或化合物已与另一个分子相连。例如，脂质
‑
或脂肪酸
‑
偶联的复合物、特别是脂质
‑
或脂肪酸
‑
偶联的药物可以被用作本发明所述的疏水剂。在这些情况中，复合物或药物本身不一定必须是疏水的。在一些实施方案中，疏水剂的至少一部分插入颗粒内部的脂质分子的疏水部分(如脂肪酰链)之间，或深入颗粒内部
的脂质分子的疏水部分(如脂肪酰链)中。
[0122]
在一个实施方案中，疏水性有机化合物和/或疏水性生物分子可以例如为生物活性剂、药物、药物的活性成分、美容产品的活性成分、植物保护产品的活性成分、膳食和/或营养补剂、诊断探针、造影剂、标签和/或指示剂。
[0123]
可以包含于salipro颗粒中并且可以给有需求的患者施用的疏水性药物可以是在含水环境中具有低溶解度的任何药物。在含水环境中的低溶解度可以只在某些条件下变得明显，如某些ph或温度范围，或者当疏水剂的浓度超过特定阈值时。
[0124]
举例来说，可以包含于salipro颗粒中并且可以给有需求的患者施用的药物是那些用于治疗癌症、炎症或感染病症、心血管疾病、神经失调和风湿病的药物。疏水剂可以为抗氧化剂、维生素、抗增殖剂、激素、类固醇、或酶。疏水剂可以为除草化合物或杀真菌化合物。
[0125]
可以纳入salipro颗粒中的疏水性药物的一些具体的例子包括：姜黄素；磺胺类药物，如磺胺、磺胺甲基异噁唑和磺胺醋酰；三甲氧苄二氨嘧啶，特别是与磺胺甲基异噁唑联用；喹啉，如诺氟沙星和环丙沙星；β
‑
内酰胺化合物，包括青霉素(如青霉素g、青霉素v、氨苄西林、阿莫西林和哌拉西林)、头孢菌素(如头孢菌素c、先锋霉素、头孢西丁和头孢他啶)、其他β
‑
内酰胺类抗生素(如亚胺培南和氨曲南)；β
‑
内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸；氨基糖苷类药物，如庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素和奈替米星；四环素，如金霉素和强力霉素；氯霉素；大环内酯类药物，如红霉素；或混合型抗生素(miscellaneous antibiotics)，如氯林可霉素、多粘菌素和杆菌肽(用于抗菌，在某些情况下用于抗真菌感染)；多烯类抗生素，如两性霉素b、制霉菌素和哈霉素；氟胞嘧啶；咪唑或三唑类，如酮康唑、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑；用于抗真菌疾病(如曲霉病、念珠菌病(candidaisis)或组织胞浆菌病)的灰黄霉素；用于抗病毒疾病的齐多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷、三氟胸苷、干扰素(例如干扰素α
‑
2a或干扰素α
‑
2b)和三氮唑核苷；阿司匹林、保泰松、非那西丁、醋胺酚、布洛芬、吲哚美辛、舒林酸、吡罗昔康、双氯芬酸；用于炎症性疾病(例如关节炎)的金和甾体类抗炎药；ace抑制剂，如卡托普利、依那普利和赖诺普利；有机硝酸盐、如亚硝酸戊酯、硝化甘油和二硝酸异山梨醇酯；钙通道阻滞剂，如地尔硫卓、硝苯地平和异搏定；β肾上腺素拮抗剂，如用于心血管疾病的普萘洛尔；利尿剂，如噻嗪化物，例如，苯并噻二嗪，或髓袢利尿剂，如利尿磺胺；交感神经阻断剂，如甲基多巴、可乐定、胍那苄(gunabenz)、胍乙啶和利血平；血管扩张剂，如肼酞嗪和米诺地尔；钙通道阻断剂如维拉帕米；ace抑制剂，如用于治疗高血压的卡托普利；用于治疗心律失常的奎尼丁、普鲁卡因胺、利多卡因、恩卡胺、普萘洛尔、艾司洛尔、溴苄胺和地尔硫卓；用于治疗低脂蛋白血症的洛弗斯塔特因、立普妥、安妥明、考来烯胺(cholestryamine)、普罗布考和烟酸；蒽环类药物如阿霉素、柔红霉素和去甲氧基柔红霉素；共价结合dna的化合物、共价结合dna的化合物和铂化合物，如顺铂和卡铂；叶酸拮抗剂，如氨甲喋呤和三甲曲沙；抗代谢药物和嘧啶拮抗剂，如氟尿嘧啶、5
‑
氟尿嘧啶与氟脱氧尿苷；抗代谢药物和嘌呤拮抗剂，如巯嘌呤、6
‑
巯嘌呤和硫鸟嘌呤；抗代谢药物和糖修饰类似物，如阿糖胞苷和氟达拉滨；抗代谢药物和核糖核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲；共价结合dna的化合物和氮芥化合物，如环磷酰胺和异环磷酰胺；共价结合dna的化合物和烷基磺酸盐，如白消安；亚硝基脲，如卡莫司汀；共价结合dna的化合物和甲基化剂，如甲基苄肼；共价结合dna的化合物和氮丙啶，如丝裂霉素；非共价结合dna的化合物；非共价
结合dna的化合物，如米托蒽醌和博莱霉素；染色质功能抑制剂和拓扑异构酶抑制剂，如依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱和托泊替康；染色质功能抑制剂和微管抑制剂，如长春花生物碱(包括长春新碱、长春碱、长春地辛(vindisine))、和紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝或其他紫杉烷；影响内分泌功能的化合物，如强的松、强的松龙、他莫西芬、亮丙瑞林、乙炔基雌二醇；抗体，如赫赛汀；基因，如p
‑
53基因、p16基因、mit基因、和e
‑
钙粘蛋白基因；细胞因子如白细胞介素，特别是il
‑
1、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
8和il
‑
12；肿瘤坏死因子，如肿瘤坏死因子
‑
α和肿瘤坏死因子
‑
β；集落刺激因子，如粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m
‑
csf)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)；干扰素，如干扰素
‑
α、干扰素
‑
β1、干扰素
‑
β2和干扰素
‑
γ；用于治疗癌症的全反式维甲酸或其他维甲酸；免疫抑制剂，如：环孢霉素、免疫球蛋白和柳氮磺胺吡啶、甲氧沙林和沙利度胺；用于治疗糖尿病的胰岛素和胰高血糖素；用于治疗骨质疏松症、高血钙症和佩吉特氏病的降钙素和阿伦磷酸钠；吗啡和鸦片类药物；哌替啶或同类物质；美沙酮或同类物质；鸦片去疼药，如烯丙吗啡；中枢活性镇咳药，如右美沙芬(dexthromethrophan)；用于疼痛管理的四氢大麻酚或屈大麻酚、利多卡因和布比卡因(bupivicaine)；氯丙嗪、丙氯拉嗪；大麻素，如四氢大麻酚；苯丁酮，如氟哌利多；用于治疗恶心和呕吐的苯甲酰胺，如甲氧普胺；作为抗凝剂、抗血栓形成药物或抗血小板药物的肝素、香豆素、链激酶、组织型纤溶酶原激活因子(t
‑
pa)；用于治疗炎症性肠病的肝素、柳氮磺胺砒啶、尼古丁和类固醇以及肿瘤坏死因子
‑
α；用于治疗烟瘾的尼古丁；用于激素治疗的生长荷尔蒙(growth hormone)、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素和生长激素(somatotropin)；以及用于过敏反应的肾上腺素。
[0126]
通过本文以及wo 2014/095576 a1的实施例(如实施例9)中描述的方法和实施例，本领域技术人员可以通过实验容易地确定某化合物是否被良好地纳入了salipro颗粒中。对于光谱法不能检测到的复合物，本领域技术人员可以借助如lc
‑
ms或薄层色谱来确定某化合物是否能够被良好地纳入salipro颗粒中。
[0127]
将疏水剂包入salipro颗粒的优点是，它们在颗粒的稳定结构中有效地成为溶液化的，由此，颗粒在(例如)存在于大多数体液和组织的水性环境中能够成为疏水剂的储存体和/或递送载体。与通过去垢剂或有机溶剂实现溶液化的经典方式相比，salipro颗粒提供了这样的优点：从外部来说其是亲水的，同时疏水剂被有效地溶解于颗粒的疏水内部，这意味着疏水剂能够保持其天然的功能性，诸如(例如)催化活性或配体结合活性。此外，与大多数去垢剂和有机溶剂不同，salipro颗粒看来是生物相容的。
[0128]
除了疏水有机化合物，已经证明了salipro颗粒能够稳定地纳入疏水性生物分子，例如包含疏水部分的蛋白。根据优选的实施方案，疏水剂是疏水蛋白，特别是膜蛋白。膜蛋白可以选自整合跨膜蛋白、单向整合膜蛋白(integral monotopic membrane protein)、外周膜蛋白、处于脂质结合状态的双向性蛋白(amphitropic protein)、脂质锚定蛋白和具有融合的疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白。如本文所用，术语“膜蛋白”不包括鞘脂激活蛋白样蛋白。
[0129]
整合膜蛋白是持久地结合到脂双层的膜蛋白，其通常需要去垢剂或非极性溶剂才能从膜上移除。跨膜蛋白是跨膜至少一次的整合膜蛋白。能被纳入salipro颗粒的跨膜蛋白的例子是g蛋白偶联受体(gpcr)、搬运蛋白(porter)(如单向搬运蛋白、同向搬运蛋白或逆向搬运蛋白)、通道(如离子通道)或酶。
[0130]
单向整合膜蛋白仅在一侧持久地结合到膜上并且不横跨膜。这类蛋白包括通过α螺旋跨膜锚而被束缚到膜上的膜蛋白。例子包括细胞色素p450氧化酶和血型糖蛋白a。
[0131]
外周膜蛋白只暂时或间接地结合脂双层或纳入脂双层中的整合膜蛋白。外周膜蛋白通常在伴随提高的ph或高盐浓度的条件下用极性试剂处理后会从膜上分离。外周膜蛋白的例子包括磷脂酶a2或c、脂肪氧合酶和细胞色素c。
[0132]
脂锚定蛋白通过脂化、特别是异戊二烯化、或gpi锚定氨基酸残基而结合到脂双层。例子包括细菌脂蛋白、g蛋白和某些激酶。
[0133]
双向性蛋白是这样的蛋白，其以至少两种构象状态存在，即：不含脂的可溶于水的状态以及脂质结合状态。通过与脂质结合，双向性蛋白发生构象改变，这使得它们变为可逆或不可逆的膜结合状态。双向性蛋白的例子为成孔毒素和抗菌肽。
[0134]
可以通过不同的方式获得用于本发明方法的疏水剂。疏水剂可以是合成的或天然来源的。可以在步骤a)中以纯化形式或仍以粗制形式(例如，以粗制膜或粗制反应混合物的形式)提供疏水剂。如果使用本发明方法的可选方案(ii)，其中步骤b.2)可用作疏水剂的伴随纯化步骤，那么尤其如此。这可以(例如)通过在步骤b.2)和c.2)之间进行洗涤步骤实现。本文所用的洗涤步骤可限于除去一部分未结合的组分，其中在步骤a)中提供了疏水剂和/或在步骤b.2)中使疏水剂与支持物接触。
[0135]
当疏水剂为疏水性生物分子时，其可以通过从天然来源纯化获得。纯化策略是技术人员已知的，并且技术人员能够根据待实现的纯化目标选择合适的纯化方法。疏水性生物分子的性质决定纯化方法，可以包括尺寸排阻色谱法、如在疏水相互作用色谱法或离子交换色谱法中基于电荷或疏水性的分离、和/或亲和色谱法。
[0136]
本文所用的术语“纯化”是本领域熟知的，并且不表示任何特定的纯度。“纯化”是指对生物分子进行纯化处理。将除去任何量的不需要的分子视为纯化。
[0137]
除了鞘脂激活蛋白样蛋白和至少一种疏水剂之外，本发明方法中获得的salipro颗粒还包含脂质作为第三强制性组分。在本发明方法的步骤a)中提供待纳入salipro颗粒中的至少部分脂质。
[0138]
本文所用的术语“脂质”是本领域熟知的，并且是指生物来源的天然物质或合成脂质，其中脂质可溶于或部分溶于有机溶剂，或者当存在于水相中时分配进入疏水环境中。如本文所用的术语“脂质”并非意味着通过本发明的方法获得的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的单一类型的脂质分子。
[0139]
salipro颗粒通常包含脂质的混合物。在一个实施方案中，salipro颗粒的脂质是天然存在于古细菌、病毒、原核生物、真核生物的细胞或真核生物细胞器膜中并可从其中获得的混合物。例如，脂质可为脑脂质、来自心脏提取物的脂质、来自肝脏提取物的脂质、来自酵母提取物的脂质或来自大肠杆菌(e.coli)提取物的脂质。在另一实施方案中，脂质可以是合成来源的。在其他实施方案中，脂质可以是半合成来源的，这意味着使用合成和天然脂质的混合物和/或天然脂质已经经过化学修饰，例如，以获得经荧光标记的脂质或具有头部基团修饰的脂质，如糖基化脂质、功能化脂质、ph敏感脂质或粘性脂质。在一个实施方案中，salipro颗粒包含至少3种、至少5种、至少10种或至少20种不同的脂质。
[0140]
在优选的实施方案中，脂质包含两亲性脂质或由两亲性脂质组成。这些脂质可以选自由磷脂、糖脂、固醇以及它们的混合物组成的组。
[0141]
磷脂具有在水中溶解的极性部分(磷酸盐“头部”)以及在水中不溶的疏水性非极性部分(“脂质尾部”)。这些部分通过甘油部分连接。在水中，磷脂可以以头部面向水而尾部背向水的方式构成簇。磷脂和糖脂中的脂肪链通常含有偶数个碳原子，通常为16至20个。16碳和18碳的脂肪酸是最常见的。脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。双键的构型通常是所谓的顺式构型。根据cahn
‑
ingold
‑
prelog规则(cip；cahn，r.s.& ingold，c.k.；prelog，v.，"specification of molecular chirality"。angewandte chemie international edition，5(4)，第385
‑
415页，1966)，顺式和反式异构是有机化学中用于指分子内官能团的相对取向所产生的立体异构现象的术语。文献“alberts等人，“the cell”，第4版，macmillian magazines ltd，2002，第61页和62页”中也描述了细胞膜中存在的典型脂肪酸。膜脂质的其他实例为磷脂，如磷脂酰胆碱(如popc(1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱))、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸(如pops(1
‑
棕榈酰基
‑2‑
油酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸
‑
l
‑
丝氨酸))、磷脂酰肌醇和鞘磷脂。
[0142]
糖脂是其上通过糖苷键连接有碳水化合物的脂质。碳水化合物通常存在于真核生物细胞膜的外表面上。它们从磷脂双层延伸到细胞外的水性环境中。糖脂的实例为甘油糖脂、半乳糖脂、硫脂、糖鞘脂、葡糖脑苷脂、硫脑苷脂、神经节苷脂、红细胞糖苷脂、糖磷脂神经鞘脂和糖磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositols)。
[0143]
固醇是类固醇的亚群。作为膜的一部分的固醇通常存在于真核生物细胞膜中，如植物、动物和真菌。固醇的实例为胆固醇、菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇和麦角固醇。
[0144]
根据优选的实施方案，膜脂质是形成脂双层的脂质和/或生物相容的脂质。如本文所用，术语“生物相容的”表示生物学上相容的，其在活的组织中不产生毒性、损伤、或者免疫反应。如本文所用，“形成双层的脂质”是指能够形成具有疏水内部和亲水外部的脂双层的脂质。根据本发明，可以使用任何能够与salip或其衍生物或截短形式结合以组装成颗粒结构的形成双层的脂质。形成双层的脂质包括，但不限于，磷脂、鞘脂、糖脂、烷基磷脂、醚脂和缩醛磷脂。可以使用一种类型的形成双层的脂质，或者可以使用两种或多种的混合物。
[0145]
脂质还可以包含不是形成双层的脂质的脂质。这样的脂质包括，但不限于，胆固醇、心磷脂、磷脂酰乙醇胺(在某些条件下该脂质可能形成双层)、氧固醇(oxysterol)、植物甾醇、麦角甾醇、谷甾醇、阳离子脂质、脑苷脂、鞘氨醇、神经酰胺、二酰基甘油、单酰基甘油、三酰甘油、神经节苷脂、醚脂、烷基磷脂、缩醛磷脂、前列腺素和溶血磷脂。
[0146]
脂质可以是上文列出的脂质的混合物，但不限于此。通常，本发明方法中使用的脂质至少包含磷脂、糖脂、胆固醇以及它们的混合物。根据优选的实施方案，脂质为真核生物的脂质和/或原核生物的脂质，特别是通常存在于真核生物或原核生物的细胞中的任意一种膜中存在的脂质。优选的脂质(例如)为磷脂、鞘糖脂、固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸(ps)、2
‑
油酰基
‑1‑
棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸胆碱(popc)、2
‑
油酰基
‑1‑
棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
甘油(popg)、2
‑
油酰基
‑1‑
棕榈酰基
‑
sn
‑
甘油基
‑3‑
磷酸乙醇胺(pope)、二酰基甘油、胆固醇、鞘磷脂、半乳糖神经酰胺、神经节苷脂、磷脂酰肌醇和和硫代半乳糖神经酰胺或者它们的组合。
[0147]
在另一实施方案中，脂质包含磷脂。合适的磷脂的实例包括，但不限于，dmpc、dmpg、popc、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(dpps)、心磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二硬酯酰磷脂酰甘油(dspg)、卵黄磷脂酰胆碱(卵pc)、大豆磷脂酰胆
碱、磷脂酰肌醇、磷脂酸、鞘磷脂和阳离子磷脂。
[0148]
本发明方法中使用的脂质通常是存在于细胞膜或细胞器膜中的脂质的异质混合物。但是本发明方法中使用的脂质还可以进一步包含合成脂质或非典型脂质，其可以为含有一个或多个键合的功能部分(如靶向部分或生物活性部分)的经修饰的脂质。
[0149]
本发明方法中使用的脂质还可以包含天然存在的脂质、合成的脂质、经修饰的脂质、脂肪、蜡、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二甘油酯、甘油三酯、磷脂、脂肪酸、甘油脂(glycerolipids)、甘油磷脂(glycerophospholipid)、鞘脂、糖脂(saccharolipid)、聚酮、固醇脂和戊烯醇脂(prenol lipid)或者它们的组合，或者由以上组成。
[0150]
在其他实施方案中，一种或多种疏水剂、脂质和/或鞘脂激活蛋白样蛋白处于去垢剂溶解状态。在一个实施方案中，疏水剂处于去垢剂溶解状态。在另一实施方案中，疏水剂和脂质处于去垢剂溶解状态。去垢剂溶解状态是指去垢剂使得和/或保持各个组分可溶于含水溶液。
[0151]
本文所用的术语“去垢剂”是本领域熟知的，并且不包括在本文所用的“脂质”的定义中：虽然许多去垢剂具有与脂质相似的两亲性的总体结构，即，极性亲水头部基团和非极性疏水尾部，但是去垢剂在单体的形状、在溶液中所形成的聚集体的类型、以及聚集所需的浓度范围这些方面与脂质并不相同。脂质在结构上通常基本上为柱状；疏水尾部所占体积与极性头部基团所占体积相似。去垢剂单体通常更像圆锥状；疏水尾部所占体积比极性头部基团所占体积小。去垢剂倾向于聚集成球体或椭圆体的水溶性胶束，并且在缺乏脂质时不形成双层结构(参见anatrace的手册“detergents and their uses in membrane protein science”，www.anatrace.com)。
[0152]
可采用的去垢剂可以是阴离子去垢剂、阳离子去垢剂、非离子去垢剂、两性离子去垢剂以及它们的混合物。
[0153]
典型的阴离子去垢剂为烷基苯磺酸盐。这些阴离子的烷基苯部分是亲脂性的，而磺酸盐是亲水性的。阴离子去垢剂可以(例如)包含支链烷基或直链烷基。合适的阴离子去垢剂的实例为胆汁酸(如脱氧胆酸(doc))、烷基苯磺酸盐(如支化的十二烷基苯磺酸钠、直链十二烷基苯磺酸钠)以及它们的混合物。
[0154]
阳离子去垢剂与阴离子去垢剂相似，其具有疏水性成分，但是，阳离子表面活性剂以季铵代替阴离子磺酸盐基团而作为极性末端。铵中心带正电荷。
[0155]
非离子去垢剂的特征在于其不带电荷的亲水头部基团。典型的非离子去垢剂(例如)基于聚氧乙烯或糖苷。前者的常见例子包括tween、triton和brij系列。这些物质也被称为乙氧基化物或peg化物，而其代谢物被称为壬基酚。糖苷具有糖作为其不带电荷的亲水头部基团。实例包括辛基硫代葡糖苷和麦芽糖苷。糖苷头部基团也可以是高分子量的，例如皂苷。皂苷由与三萜或类固醇糖苷配基连接的糖部分组成。根据皂苷分子的非糖化物部分，可以将皂苷分为三萜糖苷、类固醇糖苷和类固醇生物碱糖苷。hega和mega系列去垢剂具有糖醇作为头部基团。可用于根据本发明的方法的合适的非离子去垢剂的实例为皂苷，例如七叶皂苷、假马齿苋苷、白花猪母菜苷(bacoside)、卡茄碱、苦瓜甙、毛地黄皂苷、甘草皂苷、人参皂苷、海参苷、原薯蓣皂苷和茄碱以及它们的混合物。诸如二醇
‑
薯蓣皂苷配基之类的结构上与皂苷类似的合成去垢剂也适用于根据本发明的方法。可用于根据本发明方法的合适的非离子去垢剂的其他实例为烷基糖苷，如短链、中链或长链烷基麦芽糖苷，如正十二烷
基
‑
β
‑
麦芽糖苷(ddm)、癸酰基
‑
n
‑
羟乙基葡糖酰胺(hega)、正癸酰基
‑
n
‑
甲基
‑
d
‑
葡糖酰胺(mega)以及它们的混合物。
[0156]
根据本发明，特别优选的去垢剂选自一类皂苷，特别是毛地黄皂苷。使用毛地黄皂苷的实际实验已经示出，在将毛地黄皂苷用作去垢剂的情况下，与不存在去垢剂或使用其他类型的去垢剂相比，本发明的方法在salipro颗粒的生产方面更有效。
[0157]
两性离子去垢剂由于存在相同数量的相反带电化学基团而具有净零电荷，即总体上负电荷和正电荷的数量相等，从而使得总电荷为净零。实例包括fos
‑
胆碱、chaps/chapso、十二烷基
‑
二甲胺
‑
氧化物(ldao)以及它们的混合物。
[0158]
在本发明的一个实施方案中，去垢剂可以选自由以下组成的组：烷基苯磺酸盐或胆汁酸、阳离子去垢剂和非离子或两性离子去垢剂(如十二烷基
‑
二甲胺
‑
氧化物(ldao))、fos
‑
胆碱、chaps/chapso、皂苷(如毛地黄皂苷和结构相关的合成去垢剂，例如二醇
‑
薯蓣皂苷配基)、烷基糖苷如短链、中链或长链烷基麦芽糖苷，特别是正十二烷基β
‑
d
‑
麦芽糖苷、葡糖苷、麦芽糖
‑
新戊二醇(mng)两亲性化合物、两亲性聚合物(两亲性高分子(amphipols))、苯乙烯马来酸共聚物(sma)、基于苯酚和醛的羟烷基化产物的大环化合物或环状低聚物(杯芳烃)以及它们的混合物。
[0159]
如果本发明的方法中所用的疏水剂处于去垢剂溶解状态，如果去垢剂是具有短链至中链疏水尾部的去垢剂，那么是有利的。如果将膜蛋白作为疏水剂而纳入，则尤其如此。如本文所用的“短链疏水尾部”是指c2至c9，诸如(例如)正壬基
‑
β
‑
麦芽糖苷(nm)中的疏水尾部；如本文所用的“中链疏水尾部”是指c10至c15，诸如(例如)正癸基
‑
β
‑
麦芽糖苷(dm)或正十二烷基
‑
β
‑
麦芽糖苷(ddm)中的疏水尾部。在一个实施方案中，去垢剂在其疏水的尾部具有2至12个碳原子，优选在其疏水的尾部具有2至10个碳原子，并且最优选具有2至9个碳原子。
[0160]
实际实验表明，鞘脂激活蛋白样蛋白在纯化、储存或处理过程中一般不需要去垢剂或其他溶剂。然而，任选地，鞘脂激活蛋白样蛋白也处于去垢剂溶解状态。
[0161]
如果疏水剂是处于去垢剂溶解状态的疏水性生物分子形式，那么其可以另外与脂质、特别是环状脂质复合。环状脂质，在本文中也称为“壳脂质”或“边界脂质”，代表选定的脂质组，该脂质组在从膜纯化期间优先结合或粘着至疏水性生物分子的表面。它们构成脂质的层、或环或壳，由于存在强脂质
‑
蛋白质结合相互作用而将它们高度固定。
[0162]
在一个实施方案中，用于使疏水剂、脂质和/或鞘脂激活蛋白样蛋白溶解的去垢剂不以显著的量被载入本发明方法中形成的salipro颗粒中。特别地，在能够通过根据本发明的方法获得的颗粒中，去垢剂的量可以低至检测不到。在一个实施方案中，所获得的salipro颗粒不包含任何显著量的去垢剂，基于颗粒的重量，去垢剂的量特别为小于0.1重量％，优选小于0.01重量％，特别优选小于0.001重量％。颗粒中存在的去垢剂(或其他组分)的量可以通过(例如)质谱法确定。
[0163]
在另一实施方案中，在步骤a)中以生物膜的形式提供疏水剂和脂质，生物膜包含待纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的疏水剂和脂质。生物膜可以是病毒、古细菌、真核生物或原核生物的膜，即来源于病毒、古细菌、真核生物或原核生物的细胞或细胞器的膜。生物膜可以以完整的、用两亲性试剂处理的或裂解的细胞、病毒或细胞器的形式用于本发明的方法中。特别地，生物膜可以以已经与去垢剂接触的细胞、病毒或细胞器的形式提供。膜可
以包含天然待纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的疏水剂和脂质。然而，膜也可以来源于被工程化以在其膜中表达或包含疏水剂和/或脂质的病毒、古细菌、真核生物或原核生物的细胞或细胞器。例如，如果疏水剂是疏水蛋白，那么可以从作为转基因的表达所述疏水蛋白的细胞获得膜。特别地，疏水蛋白可以以遗传修饰(例如，标记的)的形式表达。如果疏水剂是疏水性药物，那么膜可以来源于暴露于疏水性药物的细胞。如果药物具有足够的亲脂性，这将使得药物纳入到膜中，这可以通过提取膜级分并测试药物的存在而容易地测试。
[0164]
可用于本发明方法的膜优选选自病毒、古细菌、真核生物或原核生物细胞或细胞器膜。术语“膜”是指包含脂质层的任何膜。优选地，膜是脂质双层。有时，本文所用的术语“膜”与“细胞膜”和/或“细胞器膜”可互换使用。
[0165]
如果以细胞的形式提供膜，那么这些细胞可以选自原核生物、真核生物和古细菌细胞。优选地，细胞是真核生物细胞，特别是非人动物细胞或人细胞。所述细胞可以从细胞培养物获得，但是也可以从天然来源获得，例如组织样品、活检样品和其他生物材料。
[0166]
术语“细胞膜”是指将细胞内部与外部环境分开的生物膜。文献“alberts等人，“the cell”，第4版，macmillian magazines ltd，2002，第583至614页”和“campbell等人，“biologie”，第6版，spektrum verlag，2003，第163至177页”中也详细描述了复杂的结构和细胞膜所含的多种组分，如膜脂质和膜蛋白。
[0167]
在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的salipro颗粒基本上由鞘脂激活蛋白样蛋白和得自病毒、细胞或细胞器膜的膜组分组成。
[0168]
可以在步骤a)中以粗制膜的形式提供疏水剂和脂质，粗制膜包含待纳入鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中的疏水剂和脂质。如本文所用的“粗制膜”是指不再完全完整但仍基本上包含天然膜组分(特别是关于膜脂质和膜蛋白)的膜。粗制膜可以是各自来自古细菌、原核生物或真核生物细胞的粗制细胞膜、粗制细胞器膜或其部分。粗制膜也可以是来自包膜病毒的粗制病毒包膜。例如，在(古细菌、真核生物或原核生物来源的)细胞或细胞器的细胞破碎或裂解后获得的粗制膜级分是“粗制细胞或细胞器膜”。在病毒包膜破碎后可获得粗制病毒膜部分。“粗制病毒、细胞或细胞器膜”必须包含存在于病毒包膜、细胞和细胞器中的天然膜组分。特别地，“粗制病毒、细胞或细胞器的膜”包含膜脂质以及膜蛋白这两者。可以通过机械手段进行细胞的破碎或裂解，但也可以通过使细胞与两亲性试剂、特别是去垢剂接触以进行细胞的破碎或裂解。
[0169]
粗制细胞膜、粗制细胞器膜或粗制病毒膜不再是完全完整的细胞膜、细胞器膜或病毒包膜。由于两个给定的膜破裂位点之间的疏水相互作用，它们自发地形成粗制膜囊泡。
[0170]
可以在步骤a)中以膜的形式提供疏水剂和脂质，膜仍然包含在完整的、用两亲性试剂处理的或裂解的细胞、病毒或细胞器中。因此，细胞、病毒或细胞器可以直接用于步骤a)。细胞、病毒或细胞器可以是完整的、用两亲性试剂预处理的或裂解的。特别地，可以在步骤a)中以已经与两亲性试剂、特别是与去垢剂接触的细胞、病毒或细胞器的形式提供疏水剂和脂质。
[0171]
仅通过用两亲性试剂、特别是去垢剂处理细胞、病毒或细胞器，可以直接由任何天然细胞、病毒或细胞器获得特别适用于本发明的方法的膜。优选地，与两亲性试剂接触的细胞是真核生物细胞，特别是非人动物细胞或人细胞。用两亲性试剂处理的真核生物细胞可以(例如)是赘生性细胞或癌/肿瘤细胞。在本发明的方法中，与两亲性试剂接触的细胞也可
以为(例如)组织或实体瘤。
[0172]
用两亲性试剂处理细胞、病毒或细胞器通常在液体环境中进行。用两亲性试剂处理、特别是当两亲性试剂为去垢剂时，看起来具有使细胞、病毒或细胞器的膜结构变得更流态化并且松散的效果。尽管不希望受限于这一科学理论，但看起来两亲性试剂、特别是去垢剂可能通过诱导开放构象而活化鞘脂激活蛋白蛋白质。在优选的实施方案中，除了用两亲性试剂处理之外，不进行细胞、病毒或细胞器的进一步处理、特别是不进行(例如)通过化学和/或机械处理实现细胞、病毒或细胞器破碎的进一步处理。实现细胞、病毒或细胞器破碎的合适的化学和/或机械处理是技术人员已知的。
[0173]
在一个优选实施方案中，在液体环境中用去垢剂处理涉及使细胞、病毒或细胞器与去垢剂接触，去垢剂的浓度为去垢剂的cmc的0.01倍至2000000倍，优选浓度为去垢剂的cmc的0.1倍至20000倍，最优选浓度为去垢剂的cmc的1倍至2000倍。在许多实施方案中，当液体环境中去垢剂的浓度高于去垢剂的cmc时，获得最佳结果。低于cmc的去垢剂浓度看起来也具有积极效果，原因可能是活化了鞘脂激活蛋白而去垢剂实际上没有使膜溶解。将临界胶束浓度(cmc)定义为形成胶束并且添加到系统中的全部额外的去垢剂分子纳入到胶束中时的去垢剂浓度。通常，将细胞、病毒或细胞器与两亲性试剂(特别是当两亲性试剂是去垢剂时)一起孵育0.5分钟至180分钟，并且优选30分钟至90分钟。此外，与去垢剂一起孵育通常在1℃至37℃的温度进行，优选在2℃至6℃的温度进行。
[0174]
本发明方法的步骤b.1)/b.2)
[0175]
在本发明方法的步骤b.1)/b.2)中，使鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2)与能够选择性结合疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白的支持物接触。在本发明方法的步骤b.2)中，使疏水剂与支持物接触，该支持物能够使疏水剂选择性结合至支持物。或者，在本发明方法的步骤b.1)中，使鞘脂激活蛋白样蛋白与能够选择性结合鞘脂激活蛋白样蛋白的支持物接触。
[0176]
步骤b.2)中的疏水剂或步骤b.1)中的鞘脂激活蛋白样蛋白优选在液体环境中与支持物接触，即碰触。优选地，液体环境是含水液体环境。在某些实施方案中，含水液体环境是ph为2.0至10.0、5.0至10.0或5.0至8.5的缓冲溶液；特别是6.0至8.0，并且最优选为7.0至8.0。
[0177]
本文所用的术语“支持物”是指能够选择性结合目的靶分子的任何支持物质。对于本发明方法(可选方案i)的步骤b.1)中采用的支持物，靶分子是鞘脂激活蛋白样蛋白。对于本发明方法(可选方案ii)的步骤b.2)中采用的支持物，靶分子是疏水剂。在本文中将支持物中结合靶分子的分子结构称为“捕获部分”。在本文中将靶分子中被支持物结合的分子结构称为“结合部分”。因此，支持物包括或已经官能化以包括捕获部分，该捕获部分结合存在于目的靶分子(即鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2))中的相应的结合部分。
[0178]
特别地，如本文所用的支持物可为包括此类捕获部分的“载体”、“载体材料”或“固定相”。在优选实施方案中，支持物是固体支持物。
[0179]
支持物可以是珠粒、柱床、膜或具有平坦、弯曲、歪曲、扭曲表面和/或斜面的固体支持物的形式。
[0180]
在一个实施方案中，支持物是珠粒的形式。使用现有技术中用作色谱支持物(例
如，在生物亲和色谱中)的珠粒，获得了特别好的结果。最常见的是，这些珠粒基于由可以交联的诸如琼脂糖、纤维素、木质纤维素和葡聚糖之类的多糖或诸如聚环氧乙烷之类的其他聚合物制成的材料。为了用于本发明的方法，珠粒材料包括或已经被官能化以包括捕获部分，该捕获部分结合至存在于目的靶分子(即鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2))中的相应的结合部分。本发明方法中使用的珠粒(例如亲和性珠粒)的平均直径的范围可为1μm至900μm或10μm至500μm。在一个实施方案中，直径小于500μm、小于250μm或小于100μm。优选地，本发明方法中使用的珠粒具有易得到的孔结构。支持物也可以由于固体的水合作用而形成凝胶。这些多孔材料或凝胶是优选的，因为每体积材料可得到大量的结合位点。高数量的结合位点提供了更高的结合、反应和/或分离能力。在另一实施方案中，珠粒是磁性的，这使得支持物能够方便地结合至其他表面。磁性珠粒通常小于标准亲和性珠粒。因此，根据本发明的珠粒的平均直径的范围可为600nm至10μm、400nm至7μm或200nm至5μm。在另一实施方案中，磁性珠粒的直径小于7μm、小于4μm或小于1μm。
[0181]
在一个实施方案中，支持物是柱床的形式。可以由珠粒或纤维形成柱床。然而，柱床也可以是连续的结构，使得柱床包括贯穿有孔的单片材料。连续柱床的实例是共价交联的珠粒或纤维。柱床可以是蛋白质和脂质色谱领域技术人员公知的色谱床。柱床可以基于由可以交联的诸如琼脂糖、纤维素、木质纤维素和葡聚糖之类的多糖或诸如聚环氧乙烷之类的其他聚合物制成的材料。为了用于本发明的方法，柱床材料包括或已经被官能化以包括捕获部分，该捕获部分结合至存在于目的靶分子(即鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2))中的相应的结合部分。
[0182]
在一个实施方案中，支持物是膜的形式。膜是非生物膜，其不由典型的生物膜组分(如脂质和/或膜蛋白)组成。优选使用蛋白质和脂质膜色谱领域技术人员公知的色谱膜。膜可以基于由可以交联的诸如琼脂糖、纤维素、木质纤维素和葡聚糖之类的多糖或诸如聚环氧乙烷之类的其他聚合物制成的材料。为了用于本发明的方法，膜包括或已经被官能化以包括捕获部分，该捕获部分结合至存在于目的靶分子(即鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2))中的相应的结合部分。
[0183]
在一个实施方案中，支持物是具有平坦表面的固体支持物。如本文所用的“平坦的”是指“基本上平坦的”，意思是表面在宏观上基本上是平坦的。这意味着微结构可以包括不平坦结构，并且宏观结构还可以包括不完全平坦的区域。在一个实施方案中，如果弯曲或倾斜结构包括广泛的表面区域，那么在本发明的意义上，也将弯曲或倾斜结构视为基本上平坦的。术语“具有平坦表面的固体支持物”用于将固体的基本上平坦的支持物(如芯片)或表面平面与上述珠粒实施方案区分开。本文所用的术语“固体”是指不包括凝胶。在一个实施方案中，固体是指基本上刚性且不可弯曲。在另一实施方案中，具有平坦表面的固体支持物包括无孔表面。
[0184]
可用于本发明方法的具有平坦表面的固体支持物的实例是芯片或生物传感器表面。在一个实施方案中，固体支持物的平坦表面由金属制成。特别地，金属可以选自由金、银、铜、铝以及它们的混合物组成的组。在另一实施方案中，表面由玻璃和/或合成树脂(即聚合物材料)制成。为了用于本发明的方法，固体支持物的平坦表面包括或已经被官能化以包括捕获部分，该捕获部分结合至存在于目的靶分子(即鞘脂激活蛋白样蛋白(步骤b.1)或疏水剂(步骤b.2))中的相应的结合部分。在一个实施方案中，具有平坦表面的固体支持物
的尺寸在1mm2至50mm2的范围内，特别是5mm2至25mm2。
[0185]
支持物包括捕获部分，捕获部分能够使支持物经由靶分子中的结合部分选择性结合目的靶分子。对于本发明方法(可选方案i)的步骤b.1)中所用的支持物，靶分子为鞘脂激活蛋白样蛋白。对于本发明方法(可选方案ii)的步骤b.2)中所用的支持物，靶分子为疏水剂。
[0186]
本文所用的术语“捕获部分”或“结合部分”与“至少一个捕获部分”和“至少一个结合部分”同义。本发明方法所用的支持物将通常包括多个靶部分，它们可以相同或不同。通常，支持物将包括多个相同类型的捕获部分。靶分子可以包括一个或多个结合部分。例如，当结合基于亲和相互作用时，靶分子可包括亲和标签的一个或多个拷贝。当结合基于疏水相互作用时，靶分子可以包括一个或多个疏水结合位点等。
[0187]
靶分子包括通过支持物的捕获部分选择性结合的结合部分。术语“结合部分”是指靶分子中的任何分子结构，即能够选择性结合至支持物的相应的捕获部分的根据本发明的方法的疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白。靶分子的结合部分和支持物的捕获部分形成互补的相互作用对。在本文中将术语“捕获部分”和“结合部分”统称为“识别部分”。
[0188]
因此，在本发明方法的可选方案(i)中，支持物包括捕获部分，并且鞘脂激活蛋白样蛋白包括结合部分，其中捕获部分能够选择性结合鞘脂激活蛋白样蛋白中的结合部分。在本发明方法的可选方案(ii)中，支持物包括捕获部分，并且疏水剂包括结合部分，其中捕获部分能够选择性结合疏水剂中的结合部分。在它们与支持物的结合方面，在本文中将“疏水剂”和“鞘脂激活蛋白样蛋白”统称为“靶分子”。
[0189]
如本文所用的术语“结合”可指将靶分子“固定”、“捕获”、“固着”、“偶联”或“保留”在支持物上。术语“选择性”表示支持物优先地、主要地和/或几乎排他地结合靶分子，即疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白。可以通过支持物的捕获部分和靶分子的结合部分之间的静电相互作用、疏水相互作用、亲和结合和/或共价键形成实现选择性结合。通常，结合将是可逆的。然而，在一个实施方案中，与支持物的结合基本上是不可逆的。在另一实施方案中，与支持物的结合是通过共价键。
[0190]
作为一般性注释，无论何时本文提及合适的捕获部分/结合部分对，也意味着描述相反的对。换句话说，在许多情况下，支持物上的捕获部分和靶分子中的结合部分可以互换使用。
[0191]
结合可涉及连接结合部分和捕获部分的连接子或间隔子。连接子或间隔子可以是至少双官能分子，其与结合部分和捕获部分这两者反应或结合，或者其可以包含在结合部分或捕获部分中。
[0192]
支持物的捕获部分可以通过多种方式选择性结合靶分子，这将在下文进一步详细解释。例如：(i)通过化学键将其结合部分化学偶联至支持物的捕获部分从而捕获靶分子，(ii)经由支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的基于亲和力的相互作用捕获靶分子，(iii)通过使支持物中的捕获部分工程化以结合桥联剂(例如，肽表位、底物类似物或配体)从而间接结合靶分子，通过靶分子中的结合部分选择性结合桥联剂，(iv)经由支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的疏水相互作用从而捕获靶分子，和/或(v)经由支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的基于电荷的相互作用从而捕获靶分子。
[0193]
在一个实施方案中，通过化学键将靶分子的结合部分化学偶联至支持物的捕获部分以实现步骤b.1)/b.2)中的靶分子选择性结合至支持物。这可以通过利用靶分子中的官能团，例如巯基、氨基、羟基、醛基或羧基实现。与此类靶分子的结合部分反应的支持物的合适捕获部分是技术人员已知的。技术人员能够根据待实现的偶联类型选择合适的捕获部分/结合部分对。靶分子中的巯基可以(例如)与用作支持物上的捕获部分的马来酰亚胺、二硫化物或碘乙酰胺反应，反之亦然。靶分子中伯氨基可以(例如)与用作支持物上的捕获部分的琥珀酰亚胺酯(例如n
‑
羟基琥珀酰亚胺、磺基琥珀酰亚胺或其他琥珀酰亚胺酯)、亚氨酸酯或异硫氰酸酯(例如异硫氰酸苯酯)反应，反之亦然。靶分子的羧基可以(例如)与用作支持物上的捕获部分的碳二亚胺(例如1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺)反应，反之亦然。
[0194]
根据所选择的化学反应，经由形成化学键将靶分子偶联至支持物可以是基本不可逆的，这对于需要形成的salipro颗粒与支持物特别紧密结合的某些应用是有益的。另一方面，经由基于亲和力的识别部分、疏水相互作用或静电相互作用的捕获通常是可逆的，并且具有在步骤d)中容易洗脱的优点以及再生和再使用支持物的可能性。
[0195]
在另一实施方案中，通过支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的基于亲和力的相互作用实现步骤b.1)/b.2)中的靶分子选择性结合至支持物。以这种方式，通过使用基于亲和力的相互作用由支持物的捕获部分选择性结合具有天然或工程化结合部分的靶分子。
[0196]
基于亲和力的天然捕获部分/结合部分对的实例是与靶分子中的某些糖部分(例如，如果靶分子为糖基化的膜蛋白)结合的凝集素或识别靶分子的天然表位的抗体(或反之亦然)。诸如糖基化、硫酸化、棕榈酰化、豆蔻酰化、泛素化或类泛素化之类的翻译后修饰也可以用作根据本发明的结合部分。捕获部分和结合部分之间的各种其他基于天然亲和力的相互作用是技术人员已知的。
[0197]
可用于本发明方法的工程化的基于亲和力的捕获部分/结合部分对的特别重要的实例来自亲和标签的公知领域。因此，在一个实施方案中，捕获部分或结合部分是亲和标签，并且相应的其他识别部分是对亲和标签具有高亲和力的部分。例如，蛋白a
‑
琼脂糖凝胶树脂可以作为支持物(此时，蛋白a是支持物上的亲和标签)与疏水剂
‑
抗体融合物(此时，抗体的fc部分是靶分子中的结合部分)一起使用。如果使用疏水剂
‑
抗体复合物，那么抗体作为如上所述的连接子。优选地，靶分子中的结合部分是亲和标签。例如，ni
2
‑
nta树脂可作为支持物(此时，ni
2
‑
nta是捕获部分)与his
‑
标记的靶分子(此时，his
‑
标签是亲和标签和靶分子中的结合部分)一起使用。
[0198]
亲和标签具有的优点是它们容易(例如)经由标准克隆或基因工程而纳入，并且结合至公知的、通常市售可得的携带捕获部分的支持物。步骤b.1)中使用的鞘脂激活蛋白样蛋白或步骤b.2)中使用的疏水剂(如果后者为疏水蛋白)可为亲和标签的形式。这可以通过克隆或基因工程将肽或多肽形式的亲和标签纳入靶分子中而容易地获得。因此，在该实施方案中，疏水剂(如果后者为疏水蛋白)和/或鞘脂激活蛋白样蛋白分别在步骤b.2)和步骤b.1)中用作亲和标记的融合蛋白。术语“融合蛋白”是本领域熟知的，并且是指通过重组dna技术与其他肽或多肽融合的蛋白。有时，在本文中所用的术语“融合蛋白”与“嵌合蛋白”可互换。
[0199]
最初研发亲和标签和相应的捕获部分之间的相互作用以帮助蛋白质纯化和固定。可以在遗传水平上用某些肽序列(被称为亲和标签，其结合至已知捕获部分)修饰蛋白质靶分子。如本文所用的亲和标签通常分为三类：a)结合至小分子的肽序列；b)结合至小分子的蛋白质；以及c)结合至抗体的肽或蛋白质。亲和标签也可为具有合适的结合配偶体的小分子化合物(例如，配体)。亲和标签可以共价连接至本发明方法所用的靶分子。例如，当次氮基三乙酸与ni
2
(ni
2
‑
nta)复合时，次氮基三乙酸是常用的捕获部分，该捕获部分结合用被称为组氨酸标签的一段组氨酸修饰的蛋白质，从而限定了可用作靶分子中的结合部分的亲和标签。
[0200]“亲和标签”具有其在本领域中的普通含义。亲和标签是能够容易地连接至靶标生物分子或化学分子的任意生物材料或化学材料。亲和标签可以通过任意合适的方法连接至靶标生物分子或化学分子上。例如，在一些实施方案中，可以使用遗传方法将亲和标签连接至靶分子。例如，编码亲和标签的核酸序列可位于核酸内的任意位置，以使得亲和标签能够与生物分子一起表达，例如，在其内、相邻或附近。在其他实施方案中，还可以在分子已经生成(例如，表达或合成)之后，将亲和标签连接至靶标生物分子或化学分子。作为一个实例，可以将生物素等亲和标签化学偶联(例如共价偶联)至靶蛋白或靶肽，以促进靶标与链霉亲和素的结合。
[0201]
亲和标签包括(例如)金属结合标签，如组氨酸标签、gst(在谷胱甘肽/gst结合中)、链霉亲和素(在生物素/链霉亲和素结合中)或麦芽糖(其结合至mbp或麦芽糖结合蛋白)。其他亲和标签包括myc/max对中的myc或max、或多组氨酸等聚氨基酸。在本文的各处，描述了与结合相互作用有关的特定亲和标签。与亲和标签相互作用(例如选择性结合)的支持物中的分子结构(其通常为已知的生物或化学结合配偶体)是本文所用的“捕获部分”。
[0202]
用于本发明方法的步骤b.1)/b.2)的亲和标签或抗原(用作结合部分)/捕获部分对为(例如)多组氨酸/nta/ni
2
、谷胱甘肽s转移酶/谷胱甘肽、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、链霉亲和素/生物素、生物素/链霉亲和素、抗原(或抗原片段)/抗体(或抗体片段)等。
[0203]
用于本发明方法的步骤b.1)/b.2)的其他亲和标签或抗原(用作结合部分)/捕获部分对为(例如)抗体/肽相互作用、抗体/抗原相互作用、抗体/抗原的片段的相互作用、核酸/核酸相互作用、蛋白质/核酸相互作用、肽/肽相互作用、蛋白质/蛋白质相互作用、小分子/蛋白质相互作用、谷胱甘肽/gst相互作用、麦芽糖/麦芽糖结合蛋白相互作用、碳水化合物/蛋白质相互作用、碳水化合物衍生物蛋白质相互作用、肽标签/金属离子
‑
金属螯合物相互作用、肽/nta
‑
ni相互作用、表位标签(例如，v5标签、myc标签、flag标签或ha标签)/抗体相互作用、蛋白a/抗体相互作用、蛋白g/抗体相互作用、蛋白l/抗体相互作用、荧光蛋白(例如，gfp)/抗体相互作用、fc受体/抗体相互作用、生物素/亲和素相互作用、生物素/链霉亲和素相互作用、锌指/核酸相互作用、小分子/肽相互作用、小分子/靶标相互作用以及金属离子/螯合剂/聚氨基酸相互作用。
[0204]
任何上述亲和标签都可以存在于在本发明方法的步骤b.1)/b.2)中选择性结合至支持物的疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白上。反之亦然，也可能是这种情况，即亲和标签可以存在于支持物上，而各个捕获部分存在于靶分子上，或任选地存在于中间连接子上。任何上述基于亲和力的相互作用对都可以用于本发明的方法。
[0205]
在另一实施方案中，靶分子的亲和标签为荧光标签。在本发明的方法中，此类荧光
标签可用于在特定疏水剂或特定类型(种类)的salipro颗粒生成期间对它们进行检测和跟踪。gfp及其变体是常用荧光标签的实例。
[0206]
本发明人的研究揭示了在本发明的方法中，也能够使用存在于粗制膜中的经特定标记的膜蛋白作为疏水剂。这能够通过标记衍生出粗制膜的基础细胞(underlying cell)或病毒中的目的膜蛋白实现。然后，包含经标记的疏水蛋白的粗制膜可用于本发明方法的步骤a)中以提供疏水蛋白和脂质。例如，通过遗传工程或通过将载有标记的转基因的载体插入获得粗制膜囊泡的病毒、细胞或细胞器中，可以使该标记优先在遗传水平上发生。
[0207]
在另一实施方案中，通过靶分子经由其结合部分与支持物的捕获部分的间接结合实现步骤b.1)/b.2)中的靶分子选择性结合至支持物。可以通过使支持物的捕获部分工程化以结合至桥联剂(例如，肽表位、底物类似物或配体)实现靶分子的这种间接结合，其中桥联剂通过靶分子中的结合部分选择性结合。这样，捕获的桥联剂之间的次级相互作用可用于将鞘脂激活蛋白样蛋白或疏水剂选择性结合至支持物。桥联剂的实例为酶的辅因子、底物类似物或抑制剂，配体或肽表位。这些桥联剂可偶联至支持物的捕获部分，在支持物的捕获部分中，桥联剂可选择性结合靶分子。例如，当酶的辅因子、底物类似物或抑制剂用作桥联剂时，相应的酶为靶分子，并且酶中的相应结合口袋构成结合部分。
[0208]
在其他实施方案中，通过经由支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的疏水相互作用捕获靶分子，和/或通过经由支持物的捕获部分和靶分子中的天然或工程化结合部分之间的基于电荷的相互作用捕获靶分子，从而实现步骤b.1)/b.2)中的靶分子选择性结合至支持物。技术人员知晓介导此类相互作用的合适的捕获部分。在将疏水相互作用用于将靶分子选择性结合至支持物的情况下，支持物(例如)包括疏水基团如芳族基团、c8‑
c
24
烷基、c8‑
c
24
烯基或c8‑
c
24
脂肪酸作为捕获部分。在将静电相互作用用于将靶分子选择性结合至支持物的情况下，合适的阴离子和阳离子交换部分可用作支持物上的捕获部分。特别地，可以将市售可得的阴离子或阳离子交换树脂用作支持物。阴离子交换剂中常用的官能团包括(例如)季铵、二乙基氨基丙基或二乙基氨基乙基。阳离子交换剂中常用的官能团包括(例如)磺酸、甲基磺酸盐或羧甲基。
[0209]
本发明方法的步骤c.1)/c.2)
[0210]
在本发明方法的步骤c.1)/c.2)中，通过使支持物结合的靶分子(疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白)与鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的其余组分接触，从而发生鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装。
[0211]
在本发明方法的可选方案(i)的情况下，步骤c.1)要求使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与疏水剂接触，以使得能够进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装。不希望受这一理论的束缚，相邻的捕获的鞘脂激活蛋白样蛋白可能有助于形成单个salipro颗粒。支持物也可以以非常动态和致密的3d结构的形式存在，使得促进相邻的捕获的鞘脂激活蛋白样蛋白的相互作用。在优选的实施方案中，在步骤c.1)之前、期间或之后添加额外的鞘脂激活蛋白样蛋白以进一步帮助自组装到鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒中。
[0212]
在本发明方法的可选方案(ii)的情况下，步骤c.2)要求使支持物结合的疏水剂与鞘脂激活蛋白样蛋白接触，以使得能够进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装。
[0213]
优选地，步骤c.1)和/或c.2)中的颗粒自组装在ph为2.0至10.0、特别是6.0至10.0、优选6.0至9.0、特别优选7.0至9.0、并且最优选7.0至8.0的条件下进行。优选地，在液
体环境中进行步骤c.1)/c.2中的接触。优选地，液体环境为含水液体环境。在某些实施方案中，含水液体环境是ph为2.0至10.0、5.0至10.0或5.0至8.5、特别是6.0至8.0、并且最优选为7.0至8.0的缓冲溶液。
[0214]
可以将在步骤c.1)/c.2)中接触支持物结合的颗粒组分后保持未结合的任何物质从液体环境中回收、储存并在另一应用中再利用。
[0215]
鞘脂激活蛋白样蛋白的显著且令人惊讶的性质是，鞘脂激活蛋白样蛋白可以通过简单地与脂质和疏水剂一起孵育而使疏水剂自组装到salipro颗粒中。本发明的研究基础表明，令人惊讶地，当主要成分中的一者(即，鞘脂激活蛋白样蛋白(方法的可选方案i)或疏水剂本身(方法的可选方案ii)这两者中的一者)结合并固定在支持物上时，这种自组装甚至非常有效地起作用。然后，在更具挑战性的条件下，在支持物和包含其余组分的液体环境之间的界面处发生自组装。
[0216]
本发明人的研究示出，通过本发明的方法获得的颗粒呈盘状，类似于现有技术的salipro颗粒，现有技术的salipro颗粒基于所有涉及的颗粒组分在液体环境中的自由随机运动而在纯液体环境中形成。在一个优选实施方案中，组装的salipro颗粒呈盘状。在另一优选实施方案中，salipro颗粒不包括含水核心或亲水核心。在另一实施方案中，salipro颗粒呈盘状，并且不包括含水核心或亲水核心。
[0217]
在优选实施方案中，通常认为salipro颗粒呈盘状。特别地，salipro颗粒的斯托克斯半径(流体动力学半径)rs可在2nm至500nm、特别是2nm至200nm或3nm至150nm、优选为3nm至100nm的范围内。技术人员知晓如何确定斯托克斯半径。优选地，这通过从支持物洗脱颗粒并对颗粒进行分析凝胶过滤(尺寸排阻色谱法)来进行，与已知斯托克斯半径的标准品进行比较。特别地，颗粒可以在(例如)superdex 200 hr10 30凝胶过滤柱上进行凝胶过滤步骤，并用ph 7.5的合适缓冲液在室温以0.5ml/min洗脱。监测蛋白质在280nm处的吸光度。使用已知斯托克斯半径的蛋白标准品混合物来校准该柱，所述蛋白标准品混合物例如为(例如)甲状腺球蛋白669kda(rs＝8.5nm)、铁蛋白440kda(rs＝6.1nm)、过氧化氢酶232kda(rs＝4.6nm)、乳酸脱氢酶140kda(rs＝4.1nm)、牛血清白蛋白66kda(rs＝3.55nm)和马心细胞色素c 12.4kda(rs＝1.8nm)。标准蛋白应当涵盖高于和低于目的颗粒的rs值。通过绘制洗脱位置相对于标准蛋白的rs，从而生成校准曲线。这通常产生近似线性的图，而且此外，令人满意的是在点之间画线并从该标准曲线上的目的蛋白质的洗脱位置读取其rs。
[0218]
在一些实施方案中，例如当颗粒中存在体积大的疏水剂(如膜蛋白)或更多量的脂质时，斯托克斯半径将大于3.2nm、特别是至少3.5nm、至少5.0nm或至少10.0nm。
[0219]
salipro颗粒也可在支持物结合或“游离”状态下经由透射电子显微镜进行检查。如果颗粒足够大，那么可以经由负染色电子显微镜和单颗粒分析对颗粒进行分析。
[0220]
结构分析表明，在许多情况下，在salipro颗粒中，膜脂质在颗粒内部组装成离散尺寸的盘状双层样结构。鞘脂激活蛋白样蛋白组分通常限定了盘状双层的边界，并为颗粒提供结构和稳定性。在大多数实施方案中，颗粒的内部包括疏水区域(例如，由脂质脂肪酰基链构成)。与脂质体相反，salipro颗粒通常不包含亲水核心或含水核心。该颗粒优选呈盘状，具有平坦、盘状、近似圆形的脂双层，该脂双层被由两个或更多个鞘脂激活蛋白样蛋白提供的两亲性α
‑
螺旋包围，鞘脂激活蛋白样蛋白与盘外周周围的双层的疏水表面缔合。
[0221]
在一些实施方案中，根据纳入salipro颗粒中的疏水剂的尺寸，(空的)salipro颗
粒的基本盘状形状可近似为正方形、三角形或圆柱体。例如，近似为圆柱体的salipro颗粒的最大高度与最大直径(长轴长度)之比可为至少1.0:1.1、特别是1.0:1.5、1.0:2.0、1.0:4.00、1.0:8.00或1.0:9.00。如通过洗脱的游离颗粒的透射电子显微镜或者如果颗粒足够大，则经由负染色电子显微镜和单颗粒分析所确定的，盘状颗粒的最大高度通常为至少3.5nm、特别是至少5nm。优选地，salipro颗粒具有顶部表面、底部表面和周向侧表面，其中顶部表面和底部表面的最大直径(长轴长度)大于周向侧表面的高度。在salipro颗粒的一些实施方案中，鞘脂激活蛋白样蛋白至少部分位于围绕颗粒的周向侧表面。
[0222]
在一些实施方案中，如通过透射电子显微镜或者如果颗粒足够大，则经由负染色电子显微镜和单颗粒分析所确定的，盘状salipro颗粒的平均最大直径(长轴长度)为2nm至200nm、特别是3nm至150nm、优选3nm至100nm。在另一实施方案中，盘状颗粒的平均最大直径(长轴长度)为3nm至80nm、特别是3nm至60nm。实际实验已经示出，用本发明的方法特别容易获得平均最大直径(长轴长度)为3nm至20nm的颗粒。
[0223]
在另一实施方案中，如通过洗脱的游离颗粒在(例如)hiload superdextm 200 16/60 gl柱上的凝胶过滤洗脱曲线所评价的，颗粒由基本上单分散的盘状结构群限定。
[0224]
通常，在salipro颗粒中，鞘脂激活蛋白样蛋白和脂双层之间的主要相互作用是通过鞘脂激活蛋白样蛋白分子的两亲性α
‑
螺旋的疏水面上的残基和位于生物活性剂递送颗粒外周的双层边缘处的脂质的疏水表面(例如磷脂脂肪酰基链)之间的疏水相互作用。鞘脂激活蛋白样蛋白的两亲性α
‑
螺旋包括与位于颗粒外周的脂双层的疏水表面接触的疏水表面，以及当颗粒悬浮于水性介质中时面向颗粒的外部并与水性环境接触的亲水表面这两者。
[0225]
在另一实施方案中，鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒在含水溶液中是稳定的，并且可以被冻干以长期储存，而后在含水溶液中重构。如本文所用的“稳定性”或“稳定的”是指在颗粒的制备、运输和储存过程中，颗粒破裂的程度为低水平至检测不到，聚集或品质劣化的程度为低水平至检测不到。
[0226]
在优选实施方案中，根据本发明方法的颗粒和颗粒文库在ph为2.0至10.0、特别是6.0至10.0、优选6.0至9.0、特别优选7.0至9.0并且最优选7.0至8.0的含水溶液中是稳定的。在另一个实施方案中，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析凝胶过滤(少于50％、特别是1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，根据本发明方法的文库和颗粒在含水溶液中在
‑
210℃至80℃、特别是
‑
210℃至40℃、
‑
210℃至30℃或
‑
210℃至4℃的温度保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。实际实验表明，如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析凝胶过滤(少于50％、特别是1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，salipro颗粒在含水溶液中，在4℃至40℃的温度、5.0至8.0的ph也保持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月或至少3个月。如(例如)通过目测(澄清无沉淀的溶液)或分析凝胶过滤(少于50％、特别是1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，salipro颗粒还被证明可在含水溶液中，在5.0至8.0的ph以及40℃至75℃的温度，保持稳定达至少10分钟。在一些实施方案中，颗粒可以被冻干以长期储存，而后在含水溶液中重构。在一些实施方案中，如在ph7.5的合适的缓冲液中重构后通过(例如)分析凝胶过滤(少于50％、特别是少于40％或1％至40％的颗粒破裂)所确定的那样，salipro颗粒在冻干形式下在
‑
210℃至80℃，特别是
‑
210℃至40℃、
‑
210℃至30℃或
‑
210℃至4℃保
持稳定达至少1天，至少2天，至少7天，至少2周，至少1个月，至少6个月或至少12个月。如本文所用，“破裂”是指在凝胶过滤洗脱图谱中，与新制备的salipro颗粒的峰尺寸相比，对应于salipro颗粒的峰尺寸(即峰高)降低，代价为游离的非脂质结合的saplip和/或游离脂质和/或聚集体的峰尺寸。因此，例如40％的破裂是指，与储存前的峰尺寸(100％)相比，峰尺寸(即凝胶过滤洗脱图谱中峰的高度)降低了40％。
[0227]
实际实验表明，salipro颗粒在基本上无去垢剂的含水溶液中也是特别稳定的。优选地，含水溶液所含的去垢剂浓度低于所采用的去垢剂的临界胶束浓度(cmc)。将cmc定义为高于去垢剂的该浓度时形成胶束，并且添加到系统中的全部额外的去垢剂分子纳入到胶束中。
[0228]
在本发明方法的步骤a)中提供待纳入salipro颗粒中的至少部分脂质。可以在该方法的任何其他阶段中，特别是在本发明方法的步骤b.1)/b.2)和/或c.1)/c.2)期间提供额外的脂质。在一个实施方案中，脂质选自由古细菌、原核生物、真核生物或病毒的脂质以及它们的混合物组成的组。
[0229]
在本发明方法的针对可选方案(i)的实施方案中，在步骤c.1)中使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与步骤a)中提供的古细菌膜、原核生物膜、真核生物膜或病毒膜接触。该膜包含待纳入salipro颗粒中的疏水剂和至少部分的脂质。这使得能够形成salipro颗粒的文库，其中该文库包括具有不同膜脂质和任选的膜蛋白组分的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的异质混合物。
[0230]
支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白似乎不能区分与之接触的膜成分。因此，如果在本发明方法的步骤c.1)中使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与复杂生物膜接触，则会生成这样一种salipro颗粒的支持物结合文库，该文库反映了所采用的生物膜的膜脂质和蛋白组分的复杂性并呈现其快照。以这种方式制备生物膜的脂质组/蛋白质组的支持物结合的文库具有的优点是原始膜结构的离散单元看起来保存在salipro颗粒中。此类支持物结合的文库有利于特定应用，例如高通量筛选和生物传感器应用。
[0231]
根据本发明的术语“文库”是指一组(复杂的多个)不同的salipro颗粒。特别地，差异可以在于颗粒的尺寸和组成，特别是在于其中所含的膜组分的组成，即膜脂质和任选的膜蛋白。通常，文库是“仅脂质颗粒”和包含不同种类的膜蛋白的salipro颗粒的混合物。这是指本文所用的术语“不同的膜脂质和任选的膜蛋白组分”。文库中的颗粒也可以在其不同的膜脂质的含量和组成方面有所不同。优选地，文库中的一些颗粒的不同之处在于它们是否含有膜蛋白以及含有哪种膜蛋白。
[0232]
通过使步骤c.1)中的支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与步骤a)中提供的古细菌膜、原核生物膜、真核生物膜或病毒膜接触，获得具有不同膜脂质和任选的膜蛋白组分的鞘脂激活蛋白样颗粒的文库。
[0233]
可以通过本发明方法获得的salipro颗粒的文库可包括缺乏膜蛋白的salipro颗粒，即基本上仅包含鞘脂激活蛋白样蛋白和来自粗制膜的膜脂质(“空的”salipro颗粒)。然而，该文库也包括含有一种或多种膜蛋白的salipro颗粒(“满的”salipro颗粒)。
[0234]
真核生物是这样的任意细胞或生物体，该细胞或生物体的细胞包含细胞核，并且可任选地进一步包含由膜包围的细胞器。在一个实施方案中，根据本发明的方法所用的膜是来自真核生物的膜，例如细胞膜和/或源自细胞器的膜。细胞器的实例为高尔基体、线粒
体、过氧化物酶体、内质网、叶绿体、细胞核等。
[0235]
真核生物的实例为植物、动物和真菌(如酵母菌和霉菌)。可用于本发明方法的优选真核生物的细胞选自由下列组成的组：哺乳动物细胞(特别是动物和人的细胞)、昆虫细胞、禽类细胞、真菌细胞(如酵母菌细胞)、植物细胞以及它们的混合物。特别地，术语哺乳动物细胞还包括保存于培养基中的动物和人的细胞。
[0236]
原核生物是缺乏细胞核的单细胞生物体。原核生物的细胞比真核生物的细胞更简单且更小，并且缺乏膜细胞器。原核生物的实例为细菌。示例性细菌门为酸杆菌门、放线菌门、产水菌门、装甲菌门、拟杆菌门、嗜热丝菌门、衣原体门、绿菌门、绿弯菌门、产金菌门、蓝细菌门、脱铁杆菌门、异常球菌
‑
栖热菌门、网团菌门、迷踪菌门、纤维杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、黏胶球形菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门、螺旋菌门、互养菌门、无壁菌门、热脱硫杆菌门、热袍菌门和疣微菌门。可用于根据本发明方法的优选原核生物的细胞为细菌，特别是致病细菌以及它们的混合物。
[0237]
古细菌与原核生物和真核生物只有很远的关系。例如在文献“de rosa等人，“structure,biosynthesis,and physicochemical properties of archaebacterial lipids”，microbiological reviews，第70
‑
80页第50卷，第1期，1986”或“albers等人，“the archaeal cell envelope”，nature reviews microbiology，9，第414
‑
426页，2011”中给出了详细的概述。de rosa等人报道了古细菌的膜包含的分子与原核生物和真核生物的分子显著不同。原核生物和真核生物包含的膜主要含有甘油酯脂，而古细菌包含的膜含有甘油醚脂。醚键比酯键的化学耐受性更强。这种稳定性可能有助于古细菌在极端温度和强酸性或强碱性环境中存活。原核生物和真核生物可以包含醚脂，但与古细菌相反，这些脂质仅在膜成分中占少量或没有。
[0238]
此外，古细菌的脂质基于类异戊二烯侧链。类异戊二烯侧链是含有20个、25个或最多40个碳原子的长链，其任选地具有多个支链。类异戊二烯侧链还可包含环丙烷或环己烷的环。这与如上所述在其他生物体的膜中发现的脂肪酸形成对比。虽然类异戊二烯在许多生物体的生物化学中起着重要作用，但只有古细菌才会用它们来制造磷脂。在一些古细菌中，脂双层可以被单层取代。
[0239]
古细菌的实例为产甲烷古细菌、嗜盐细菌和热嗜酸古细菌。可用于本发明方法的优选古细菌是嗜极微生物古细菌和不同的嗜极微生物古细菌的混合物。
[0240]
病毒结构和病毒的膜成分(如果适用的话)不同于真核生物、原核生物和古细菌的膜。这在例如文献“lorizate等人，“comparative lipidomics analysis of hiv
‑
1 particles and their producer cell membrane in different cell lines”，cellular microbiology，15(2)，第292
‑
304页，2013”和“br
ü
gger等人，“the hiv lipidome:a raft with an unusual composition”，pnas，第103卷，第8期，第2641
‑
2646页，2006”中被更详细地报道。
[0241]
lorizate等人报道了各种研究表明hiv
‑
1膜与生产细胞的质膜不同，从而表明病毒从已存在的亚结构域出芽或病毒介导的特化出芽膜的诱导作用。从两种不同细胞系纯化的质膜和hiv
‑
1的脂质分析显示，与宿主细胞质膜相比，病毒膜的脂质组成显著不同，其与所研究的细胞类型无关。与生产细胞的宿主细胞质膜相比，病毒颗粒明显富集有磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、己糖神经酰胺和饱和磷脂酰胆碱类物质。病毒颗粒表现出不饱和磷脂酰胆碱
类物质、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇水平的降低。观察到缩醛磷脂
‑
磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油的hiv
‑
1和供体质膜的脂质组成的细胞类型特异性差异，其仅在源自mt
‑
4细胞的hiv
‑
1中显著富集。源自mt
‑
4细胞的hiv
‑
1还包含二氢鞘磷脂。总之，由lorizate等人报道的这些数据支持了hiv
‑
1选择特定的脂质环境用于其形态形成，并且不与其宿主的细胞膜相同或相似。通常，通过本发明方法获得的颗粒和文库不包含病毒蛋白和/或病毒膜。
[0242]
包膜病毒包括正粘病毒(orthomoxyviruses)、黄热病病毒和逆转录病毒。包膜病毒的实例为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、巴特肯病毒、波本病毒、多里病毒、丙型肝炎病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、恩德培蝙蝠病毒、黄热病毒、寨卡病毒、htlv1和hiv。
[0243]
本发明方法的步骤d)
[0244]
在本发明方法的步骤d)中，可从支持物上洗脱出支持物结合的salipro颗粒。该步骤是任选的，因为对于某些应用(例如，生物传感器或芯片实验室)，支持物结合的salipro颗粒为目的产物。因此在这些情况下，不需要从支持物上洗脱颗粒。
[0245]
在许多情况下，经由形成化学键(i)将疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白共价偶联至支持物基本上是不可逆的。对于洗脱而言，化学键必须(例如)通过进行反向偶联反应而溶解或进行不同的裂解反应。例如，可以采用具有易裂键的连接子。这可以(例如)为包含蛋白酶切割位点的连接子，该连接子使得能够用与蛋白酶(例如，tev蛋白酶)的孵育而洗脱。相比之下，salipro颗粒经由亲和相互作用(ii)、经由桥联剂的间接相互作用(iii)、疏水相互作用(iv)或静电相互作用(v)的结合通常是可逆的，从而使得颗粒相对容易洗脱，并且通常使得能够进行支持物的再生以及支持物的再利用。
[0246]
可通过多种技术实现从支持物上洗脱组装的salipro颗粒，所述技术取决于如上所述的支持物和靶分子之间、特别是捕获部分和结合部分之间的相互作用的类型。合适的洗脱方法是本领域技术人员已知的。本领域技术人员能够根据靶分子选择性结合至支持物所用的相互作用的类型选择合适的洗脱策略。
[0247]
本文所用的术语“洗脱”是指移除或置换支持物结合的salipro颗粒。
[0248]
例如，通过向液体环境提供破坏和/或取代亲和相互作用的特定分子，将通过salipro颗粒组分中的一种和支持物之间的亲和相互作用(ii)结合的salipro颗粒洗脱。例如，如果用his
‑
标签来标记靶分子，并且支持物承载ni
2
‑
nta捕获部分时，则通过使支持物结合的salipro颗粒与咪唑接触进行洗脱。以相同的方式，如果用gst
‑
标签来标记靶分子，并且支持物包含谷胱甘肽作为捕获部分，则可通过使支持物结合的salipro颗粒与谷胱甘肽接触进行洗脱。通过切割桥联剂或连接子或通过破坏桥联剂和捕获部分和/或结合部分之间的相互作用，可以对通过介导靶分子和支持物之间的间接相互作用(iii)的桥联剂结合的salipro颗粒进行洗脱。在捕获部分和结合部分之间的受体/配体样相互作用的情况下，在凝集素连接于与靶分子上的糖部分结合的支持物的情况下，可以通过使用竞争性结合物质(如糖)进行洗脱。可以通过降低液体环境中的盐浓度以促进溶剂化从而洗脱结合的物质来实现通过疏水相互作用(iv)结合至支持物的salipro颗粒的洗脱。在salipro颗粒通过静电相互作用(v)结合至支持物的情况下，可通过改变支持物结合的salipro颗粒周围液体环境中的ph或盐浓度进行洗脱。
[0249]
根据特定实施方案，在1℃至85℃、特别是1℃至40℃、特别优选1℃至30℃的温度
进行上述步骤、特别是步骤a)、b.1)/b.2)、c.1)/c.2)和d)。对于大多数应用而言，1℃至25℃、特别是1℃至20℃、最特别是3℃至15℃的温度是足够的。然而，通过本文教导的方法，本领域技术人员可以确定对于所使用的膜、化合物、脂质和蛋白质的温度稳定性的最佳孵育温度。
[0250]
本文所用的术语“基本上”是指在根据本发明方法中使用的痕量的其他组分也可存在于salipro颗粒中，例如用于提供疏水剂和/或脂质的粗制膜的其他组分或在该方法中使用的试剂，如去垢剂。然而，salipro颗粒基本上由至少一种鞘脂激活蛋白样蛋白和从细胞或细胞器的膜获得的膜的组分构成特别是意味着不添加其他脂质和/或蛋白质。
[0251]
根据本发明方法可获得的salipro颗粒或salipro颗粒的文库可用于医学，特别是用于预防疾病、治疗疾病或减轻疾病的严重程度，或用于诊断方法，美容治疗或用作疫苗接种制剂。
[0252]
例如，salipro颗粒可以包含于药物组合物中，以用于将一种或多种膜蛋白和/或脂质递送至有此需要的个体，其中组合物包含如上所述的salipro颗粒。
[0253]
除了salipro颗粒，药物组合物可以任选包含(其他)药学可接受的赋形剂、载体或佐剂。
[0254]
当salipro颗粒用于药物组合物时，颗粒和药物组合物的各个成分应当是药学上可接受的。本文使用的术语“药学上可接受的”是指在健全的医疗判断范围内，成分、化合物或试剂适合用于接触人体和低等动物的组织，而不会引起异常毒性、刺激、过敏反应等，并且相应地具有合理的受益/风险比率。
[0255]
包含salipro颗粒的药物组合物可根据待治疗的疾病或病症的严重程度，通过以下方式作为气溶胶、口或鼻喷雾等施用给人和其他动物：经口、经直肠、不经肠、脑池内(intracisternally)、阴道内、腹膜内、经局部(例如以粉末、软膏或滴剂)，经面颊(bucally)。特别地，所述药物组合物可被配制为经肠内、不经肠和/或经局部施用。其可以以胶囊、输注或注射、可涂刷或可饮用的组合物来施用，或者以气溶胶来施用。本文还描述了这样的药物组合物，其中salipro颗粒以固体形式、作为分散液或以溶液形式而存在。
[0256]
salipro颗粒对诊断和/或美容应用也是有用的。例如，包含(例如)如上所述的可检测抗原或标签的salipro颗粒可用作诊断试剂并用于诊断目的。对于后者，如果省略洗脱步骤d)，那么采用本发明可获得的支持物结合形式的salipro颗粒也是非常有用的。根据本发明的诊断和生命科学研究工具的实例包括具有标记的纳入的膜蛋白、标记的鞘脂激活蛋白样蛋白、标记的脂质、纳入的荧光团或造影剂(例如用于mr成像)的颗粒。标签可为(例如)荧光标签。
[0257]
在另一方面，salipro颗粒作为疫苗接种制剂、疫苗接种制剂的载体或药物递送载体是有用的。许多在接种疫苗中特别有效的致病抗原暴露在真核生物或原核生物的病原体或患者的疾病细胞(例如癌细胞)的细胞外膜表面和/或包含于其中。这些抗原可以(例如)来源于致病性脂质、其他疏含水生物分子或膜蛋白。利用salipro颗粒，此类抗原能够有效地被纳入到颗粒中，然后可以将其用作疫苗接种制剂中的抗原呈递递送载体。按照这样的方法，salipro颗粒也可以用于作为抗原呈递递送载体以在合适的宿主动物中、优选在哺乳动物(诸如兔子、山羊、羊驼、小鼠和灵长类动物)中生产抗脂质或膜蛋白的抗体。
[0258]
本文还描述了salipro颗粒作为药物研发、药物筛选和药物探索的工具的用途。
[0259]
例如，特定的膜蛋白药物靶标(如细胞表面受体或离子通道)可以被纳入到salipro颗粒中并溶解，从而使其处于天然状态。然后，该颗粒可以用于检验以研究药物靶标膜蛋白在其天然的脂双层环境中的活性，或用于药物筛选来鉴定新药。根据本发明的方法，salipro颗粒在与一种颗粒组分选择性结合的同时组装到支持物上。如此获得的支持物结合的salipro颗粒可直接用于基于芯片的应用(例如芯片实验室)以及表面等离子体共振(spr)、光栅耦合干涉测定法(gci)或其他生物传感器应用。
[0260]
无标记的光学spr生物传感器是用于测定分子相互作用的结合亲和力和动力学的黄金标准。主要存在四个spr生物传感器平台：ge healthcare的biacore t100、bio
‑
rad的proteon xpr36、fortebio的octet red384和wasatch microfluidic的ibis mx96。
[0261]
作为spr生物传感器的替代，基于gci的波导干涉仪可以用于表征分子相互作用和/或确定相互作用分子的动力学速率、亲和常数和浓度。
[0262]
虽然基于spr和gci的光学测定检测了由于相互作用分子的复合物形成引起的质量变化而导致的传感器表面附近的渐逝场内的折射率变化，但是其他生物传感器系统应用了不同的检测策略：量热生物传感器记录了通过反应吸收或释放的热量。电位生物传感器检测了引起电位的电荷分布。可选地，电流生物传感器可以展示在氧化还原反应中产生的电子的运动。此外，生物传感器也可以检测反应过程中的光输出或反应物和产物之间的吸光度差异(光学生物传感器)。此外，压电生物传感器利用了由于结合至生物传感器表面的反应物或产物的质量而引起的效应(压电生物传感器)。所有这些生物传感器应用的共同点在于，它们受益于将待研究的分子中的一者结合至支持物。本发明方法提供了将目的疏水剂直接纳入支持物结合的salipro颗粒的容易且直接的“一步”法。这样就不需要其他偶联步骤，因此在工艺效率和成本方面是有利的。
[0263]
本发明方法还可以用作以下方面的工具：膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组文库或数据库。
[0264]
salipro颗粒通常可用于在其天然的膜双层微环境中使不可溶的膜蛋白和膜结构域或组分可溶于含水溶液。用本发明的方法获得的salipro颗粒可用于膜蛋白研究中的多种新应用。例如，salipro颗粒使得可以通过以下方法来研究被纳入salipro颗粒中的膜蛋白：例如，核磁共振(nmr)、x射线晶体学、电子显微镜(em)、质谱、等温滴定量热法(itc)、差示光散射、小角x射线散射(saxs)、酶联免疫吸附分析(elisa)、荧光激活细胞分选(facs)、生化试验、高通量筛选(hts)等。
[0265]
用本发明方法的某些实施方案可获得的颗粒的文库特别适用于系统生物学领域的研究，尤其是脂质组学和膜蛋白质组学。本发明的文库可适用于对病毒、细胞或细胞器的脂质组和/或蛋白质组进行捕获和溶液化。脂质组学和蛋白质组学中的典型分析技术为质谱(ms)、核磁共振(nmr)波谱、荧光光谱和计算方法等技术。将这些方法或技术应用于salipro颗粒将使得能够进一步阐明天然脂质和膜蛋白在许多代谢疾病(例如，癌症、自身免疫疾病、肥胖症、动脉粥样硬化、中风、高血压和糖尿病)中的作用。如果文库处于支持物结合状态、特别是结合至具有基本上平坦的表面的固体支持物，则实现了salipro颗粒的空间二维分离和固定化，这有助于分析此类复杂混合物。
[0266]
从可能是疾病靶标的特定细胞或细胞器获得的整个salipro颗粒文库可用于药物
筛选目的，以鉴定新的分子药物靶标，例如存在于靶细胞或细胞器的膜中的膜蛋白或脂质。
附图说明
[0267]
下文将参照附图对本发明进行描述，附图描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明为如权利要求以及本文中的一般性描述所定义的。不应限于在以下附图中出于说明目的而示出的实施方案。
[0268]
图1示出了现有技术的脂蛋白颗粒。图1为现有技术(如上述的ep 1 596 828 b1)的包含脂质(3)和载脂蛋白支架蛋白(11)的含有载脂蛋白a
‑
1的纳米盘颗粒(10)的形状和分子构造的示意图。
[0269]
图2a至图2c为通过特定实施方案获得的salipro颗粒的侧视图(左)和俯视图(右)的示意图。在图2a、图2b和图2c中，示出了包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)、膜蛋白(4a)/寡聚膜蛋白(4b)和任选的疏水性化合物(4c)的salipro颗粒，其中膜蛋白(4a、4b)包括结合部分(5)。
[0270]
图3a至图3c为通过某些实施方案获得的salipro颗粒的侧视图(左)和俯视图(右)的示意图。在图3a、图3b和图3c中，示出了包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)和任选的膜蛋白(4a)/寡聚膜蛋白(4b)的salipro颗粒，其中鞘脂激活蛋白样蛋白(2)包括结合部分(5)。
[0271]
图4a至图4b为通过特定实施方案获得的salipro颗粒的侧视图(左)和俯视图(右)的示意图。在图4a和图4b中，示出了包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)、疏水性化合物(4c)和任选的膜蛋白(4a)的salipro颗粒，其中疏水性化合物(4c)包括结合部分(5)。
[0272]
图5a至图5b为通过某些实施方案获得的salipro颗粒的侧视图(左)和俯视图(右)的示意图。在图5a和图5b中，示出了包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)、疏水性化合物(4c)和任选的膜蛋白(4a)的salipro颗粒，其中鞘脂激活蛋白样蛋白(2)包括结合部分(5)。
[0273]
图6a至图6f是为某些实施方案提供疏水剂的模式的示意图。在图6a和图6d中，示出了包含脂质(3)和任选的膜蛋白(4a、4b)的粗制膜囊泡(7、7')，其中在图6a中，膜蛋白(4a)包括结合部分(5)。在图6b和图6e中，示出了与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的膜蛋白(4a)，其中在图6b中，膜蛋白(4a)包括结合部分(5)。在图6c和图6f中，示出了与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的疏水性化合物(4c)，其中在图6c中，疏水性化合物(4c)包括结合部分(5)。
[0274]
图7a至图7b是为特定实施方案提供鞘脂激活蛋白样蛋白的模式的示意图。在图7a和图7b中，示出了鞘脂激活蛋白样蛋白(2)，其中在图7a中，鞘脂激活蛋白样蛋白(2)包括结合部分(5)。
[0275]
图8a至图8d分别为在步骤b.2)和b.1)中结合至支持物的疏水剂或鞘脂激活蛋白样蛋白的特定实施方案的示意图。在图8a中，示出了鞘脂激活蛋白样蛋白(2)，鞘脂激活蛋白样蛋白(2)经由其结合部分(5)结合至支持物(12)的捕获部分(13)。在图8b中，示出了与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的疏水性化合物(4c)，疏水性化合物(4c)经由其结合部分(5)结合至支持物(12)的捕获部分(13)。在图8c中，示出了与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的膜蛋白(4a)，膜蛋白(4a)经由其结合部分(5)结合至支持物(12)的捕获部分(13)。在图8d中，示出了包含脂质(3)和膜蛋白(4a，4b)的粗制膜囊泡(7)，粗制膜囊泡(7)经由膜蛋白
(4a)的结合部分(5)结合至支持物(12)的捕获部分(13)。
[0276]
图9a至图9c为特定实施方案的步骤b.2)和c.2)的示意图，其中在步骤b.2)中将疏水剂结合至支持物，并在步骤c.2)中使疏水剂与鞘脂激活蛋白样蛋白接触。在图9a中，与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的支持物(12)结合的膜蛋白(4a)与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触，以使得能够在步骤c.2)中进行salipro颗粒的自组装(与图2a进行比较)。在图9b中，与脂质(3)和去垢剂分子(6)缔合的支持物(12)结合的疏水性化合物(4c)与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触，以使得能够在步骤c.2)中进行salipro颗粒的自组装(与图4a进行比较)。在图9c中，使包含脂质(3)和膜蛋白(4a、4b)的支持物(12)结合的粗制膜囊泡(7)与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触，以使得能够在步骤c.2)中进行salipro颗粒的自组装(与图2a进行比较)。
[0277]
图10a至10d为特定实施方案的步骤b.1)和c.1)的示意图，其中在步骤b.1)中将鞘脂激活蛋白样蛋白结合至支持物，并在步骤c.1)中使其与疏水剂接触。在图10a中，支持物结合的(12)鞘脂激活蛋白样蛋白(2)与缔合至脂质(3)和去垢剂分子(6)的膜蛋白(4a)接触，以使得能够在步骤c.1)中进行salipro颗粒的自组装(与图3b进行比较)。在图10b中，使支持物结合的(12)鞘脂激活蛋白样蛋白(2)与包含脂质(3)和膜蛋白(4a、4b)的粗制膜囊泡(7、7')接触，以使得能够在步骤c.1)中进行salipro颗粒的自组装和颗粒的文库的形成(与图3a、图3b、图3c进行比较)。在图10c中，使支持物结合的(12)鞘脂激活蛋白样蛋白(2)与缔合至脂质(3)和去垢剂分子(6)的疏水性化合物(4c)接触，以使得能够在步骤c.1)中进行salipro颗粒的自组装(与图5a进行比较)。在图10d中，支持物结合的(12)鞘脂激活蛋白样蛋白(2)与都缔合至脂质(3)和去垢剂分子(6)的疏水性化合物(4c)和膜蛋白(4a)这两者接触，以使得能够在步骤c.1)中进行salipro颗粒的自组装(与图5b进行比较)。
[0278]
图11示出了实验1c的结果。图11表示在标记的slc转运体(膜蛋白)结合至亲和支持物并使支持物结合的slc转运体与不同浓度的鞘脂激活蛋白a接触时，salipro颗粒组装的尺寸排阻色谱分析。
[0279]
图12a至图12b示出了实验1d的结果。图12a表示从实验1c的样品5中获得的salipro颗粒的尺寸排阻色谱分析。通过sds
‑
page分析在尺寸排阻色谱中获得的级分，结果表明级分13、14和15主要包含组装的salipro颗粒。图12b示出了如图12a所示的级分14的尺寸排阻色谱分析。
[0280]
图13示出了实验3c的结果。图13表示在鞘脂激活蛋白a结合至亲和支持物并使支持物结合的鞘脂激活蛋白a与其他未标记的鞘脂激活蛋白a、脑脂质和任选的细菌离子通道膜蛋白t2形式的疏水剂接触时，salipro颗粒组装的尺寸排阻色谱分析。
[0281]
图14a至14b再现了bruhn(2005)，biochem j 389(15):249
–
257的图4a和图4b。上表1所示的seq id no.7
‑
46提供了这些序列。
[0282]
图1示出了现有技术的包含载脂蛋白a
‑
1的纳米盘颗粒(10)(参见上述的ep 1 596 828 b1)，其含有脂质(3)和作为脂质结合多肽(11)的载脂蛋白a
‑
1。与现有技术的载脂蛋白衍生纳米盘相反，本发明的脂质结合多肽(即鞘脂激活蛋白样蛋白)不以双带样形式包封脂质(参见图2、图3和图4)，而是通过包含膜脂质的核心将本发明的颗粒保持在一起，所述膜脂质被两个或更多个近似v形或飞旋镖形的以头
‑
尾方向排列的脂质结合多肽围绕，并且在由本发明方法获得的给定salipro颗粒中，各个鞘脂激活蛋白样蛋白之间实质上没有直接
的蛋白质
‑
蛋白质接触(参见图2、图3和图4)。
[0283]
图2a至2c是根据某些实施方案获得的salipro颗粒的示意图。图2a、图2b和图2c的颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、多种不同的脂质(3)、膜蛋白(4a)/寡聚膜蛋白(4b)和任选的疏水性化合物(4c)。图2a至图2c中的膜蛋白(4a、4b)包括结合部分。膜蛋白中的结合部分可以是天然的或工程化的结合部分。膜蛋白的结合部分可以位于膜蛋白的n端、c端或在氨基酸序列内。在膜蛋白包含工程化结合部分的情况下，工程化结合部分可以在蛋白质合成期间或之后连接至膜蛋白。在另一未示出的实施方案中，膜蛋白(4a、4b)可以具有相同或不同类型的多个结合部分。图2a至图2c所示的salipro颗粒的脂质(3)彼此不同，这意味着salipro颗粒的脂质组成不是一致或均质的。根据如何提供步骤a)中的膜蛋白(4a、4b)，脂质的组成将变化。在另一未示出的实施方案中，salipro颗粒还可包含通常存在于病毒、古细菌、真核生物和/或原核生物的膜中的其他成分。脂质(3)和膜蛋白(4a、4b)可以源自相同的病毒、古细菌、真核生物或原核生物的膜来源，或源自不同的来源。
[0284]
图2a至图2c的颗粒未按比例绘制。根据纳入颗粒中的膜蛋白(4a、4b)的尺寸，颗粒可以具有与其他颗粒相比显著不同的尺寸。通过本发明的方法获得的salipro颗粒的尺寸是灵活的。例如，与图2a中的包含单体膜蛋白的颗粒相比，图2b中的含有寡聚膜蛋白的颗粒更大，并且包含更多的鞘脂激活蛋白亚基(2)。根据salipro颗粒的尺寸，该颗粒的每个颗粒包含两个或更多个以头尾方式排列的鞘脂激活蛋白样分子。图2a和图2c所示的颗粒包含两个鞘脂激活蛋白样分子，而图2b所示的颗粒包含3个鞘脂激活蛋白样分子。
[0285]
图2a、图2b和图2c以如侧视图和俯视图的简化形式示出了salipro颗粒，该颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、来自病毒、古细菌、真核生物和/或原核生物的膜来源的脂质(3)、膜蛋白(4a、4b)和任选的疏水性化合物。膜蛋白(4a)可为单体形式的整合跨膜蛋白。然而，膜蛋白也可为如图2b所示的寡聚体形式的整合跨膜蛋白或外周膜蛋白、脂质结合状态的双向性蛋白、脂质锚定蛋白或具有融合疏水和/或跨膜结构域的嵌合蛋白，它们均可以为单体或寡聚状态。
[0286]
图2c所示的颗粒与图2a和图2b的不同之处在于，图2c所示的颗粒另外包含天然或合成来源的疏水性化合物(4c)。一个salipro颗粒内的疏水性化合物的数量可以变化。疏水性化合物可以与脂质(3)和/或任何种类的膜蛋白形成紧密的相互作用。膜蛋白可(例如)为图2c所示的单体跨膜蛋白(4a)。
[0287]
图3a至图3c再次以简化的示意形式(侧视图(左)和俯视图(右))并且未按比例绘制示出了根据特定实施方案获得的salipro颗粒。图3a、图3b和图3c所示的颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)和任选的单体或寡聚体形式的跨膜蛋白(4a、4b)，其中鞘脂激活蛋白样蛋白(2)具有结合部分(5)。在另一未示出的实施方案中，鞘脂激活蛋白样蛋白(2)可具有相同或不同类型的多个结合部分。如图2的颗粒所述，通过简单地纳入多于两个的鞘脂激活蛋白样蛋白(2)以形成颗粒，图3所示的颗粒可以在其脂质(3)组成和其尺寸方面变化以纳入任何种类的疏水蛋白。
[0288]
图4a和图4b示出了本发明某些实施方案的salipro颗粒的侧视图(左)和俯视图(右)的示意图，该示意图未按比例绘制。图4a和图4b所示的颗粒包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)、疏水性化合物(4c)和任选的膜蛋白(4a)。疏水性化合物示出了结合部分，该结合部分可以是天然或工程化来源的。虽然天然结合部分可以形成疏水性化合物(4c)的内
部部分，但是工程化结合部分通常在疏水性化合物合成之后或在天然疏水性化合物纯化之后连接至合适的末端反应性基团。在另一未示出的实施方案中，salipro颗粒可包含具有相同的天然或工程化结合部分的不同种类的疏水性化合物。图4a和图4b的颗粒可以在纳入颗粒中的脂质(3)、疏水性化合物(4c)、膜蛋白(4a)和鞘脂激活蛋白样蛋白(2)的数量和种类方面变化。
[0289]
图5a和图5b再次以未按比例绘制和示意图形式(侧视图(左)和俯视图(右))示出了具体实施方案的salipro颗粒。图5a和图5b所示的颗粒与图4a和图4b所示的颗粒的不同之处在于鞘脂激活蛋白样蛋白(2)具有结合部分，而不是疏水性化合物(4c)具有结合部分。关于未示出的图5a和图5b所示的颗粒的不同组成，应用与图4a和图4b所述的相同考虑因素。
[0290]
图6a至图6f示出了这样的特定实施方案，其在本发明方法的步骤a)中以疏水性生物分子(即，例如单体形式(4a)或寡聚体形式(4b)的跨膜蛋白)或疏水性化合物的形式提供疏水剂。在图6a中，以粗制膜囊泡(7、7')的形式提供膜蛋白(4a、4b)。膜囊泡(7、7')可为病毒、古细菌、真核生物或原核生物来源的。它们包含多种脂质(3)，并且在囊泡(7)的情况下包含多种膜蛋白，在此仅以两种膜蛋白(4a、4b)的简化形式为例，其中膜蛋白(4a)具有结合部分(5)。囊泡(7')为“空的”仅含脂质的颗粒。粗制膜囊泡，例如囊泡(7、7')可以通过裂解(例如)古细菌、原核生物或真核生物来源的细胞或细胞器而直接获得。也可以通过使病毒包膜破裂获得粗制膜囊泡。通常在裂解或膜破裂时自发形成诸如(7)和(7')之类的囊泡。粗制膜囊泡可包含去垢剂分子或与去垢剂分子缔合(本文未示出)。在图6b中，示出了具有结合部分(5)的膜蛋白(4a)，该膜蛋白不存在于天然膜或粗制膜囊泡中，而是存在于人工的、去垢剂溶解的状态(参见图6b所示的膜蛋白(4a)与脂质(3)和去垢剂分子(6)的缔合)。在图6c中，示出了处于去垢剂溶解状态的具有结合部分(5)的疏水性化合物，这意味着疏水性化合物包埋在包含脂质(3)和去垢剂分子(6)的胶束内。任选地，仅由去垢剂分子溶解图6b所示的膜蛋白(4a)或图6c所示的疏水性化合物。图6d至图6f所示的递送疏水剂的模式与图6a至图6c的不同之处在于，以跨膜蛋白(4a、4b)或疏水性化合物(4c)为例的疏水性生物分子不包括结合部分。
[0291]
图7a和图7b示出了在本发明方法中提供鞘脂激活蛋白样蛋白的具体实施方案。图7a与图7b的不同之处在于鞘脂激活蛋白样蛋白具有天然或工程化来源的结合部分。虽然天然结合部分形成鞘脂激活蛋白样蛋白的天然氨基酸序列的一部分，但工程化来源的结合部分可在鞘脂激活蛋白样蛋白合成期间或之后进行连接。优化工程化结合部分从而以高亲和力结合至其相应的结合配偶体，该结合配偶体为本发明方法中的捕获部分。在另一实施方案中，鞘脂激活蛋白样蛋白可与去垢剂分子(本文未示出)缔合。
[0292]
图8a至图8d示出了支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白(图8a)和疏水剂(图8a至图8d)的未按比例绘制的示意图。鞘脂激活蛋白样蛋白(参见图8a)或疏水剂(参见图8a至图8d)中的结合部分与支持物(12)的捕获部分(13)的选择性结合是支持物上的单个捕获部分的实例。实际上，支持物通常配备有多个相同或甚至不同类型的捕获部分。结合部分/捕获部分识别对的相互作用可以基于化学键形成、基于亲和力的相互作用(包括通过桥联剂介导)、疏水相互作用和/或静电相互作用。支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白(2)可以是去垢剂溶解状态(本文未示出)。此外，粗制膜囊泡(7)可包含去垢剂分子或与去垢剂分子缔合
(本文未示出)。虽然图8d的膜蛋白(4a、4b)以粗制膜囊泡(7)的形式包埋在其天然脂质环境中，但是疏水性化合物(4c)和膜蛋白(4a)处于人工去垢剂溶解的状态，由此所述疏水剂周围的胶束可以由脂质和去垢剂形成。在其他实施方案中，用于溶解鞘脂激活蛋白样蛋白(2)和/或疏水剂的去垢剂可以具有相同或不同的化学性质。
[0293]
图9a至图9c以简化和示意形式示出了方法步骤b.2)和c.2)的特定实施方案。在步骤c.2)中，使去垢剂溶解的膜蛋白(4a)形式的支持物结合的疏水剂(图9a)、去垢剂溶解的疏水性化合物(4c)形式的支持物结合的疏水剂(图9b)和包埋在粗制膜囊泡(7)中的膜蛋白(4c)形式的支持物结合的疏水剂(图9c)与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触，该鞘脂激活蛋白样蛋白任选地处于去垢剂溶解的状态。通常，当支持物结合的疏水剂与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触时，直接在支持物上发生颗粒的自组装。任选地，将病毒、古细菌、真核生物和/或原核生物来源的额外的的溶解的脂质添加到颗粒组装反应中，这未在图9a至图9c示出。以纯化形式提供图9a的溶解的膜蛋白(4a)和溶解的疏水性化合物(4c)，以用于在步骤b.2)中选择性结合至支持物。图9a和图9b的组装颗粒基本上由已经与溶解的膜蛋白(4a)或疏水性化合物(4c)缔合的脂质(3)组成。任选地，将额外的脂质添加到支持物的液体环境。在图9c中，粗制膜囊泡(7)结合至支持物(12)。如图9c所示，仅通过其结合部分(5)结合至支持物(12)的捕获部分(13)的膜蛋白(4a)在与鞘脂激活蛋白样蛋白(2)接触时保持结合至固体支持物，以使得能够在支持物上进行salipro颗粒的自组装。最初形成步骤b.2)中支持物结合的粗制膜囊泡的一部分并且不呈现支持物捕获部分的互补结合部分的其他膜蛋白(例如粗制膜囊泡(7)中的多聚体膜蛋白(4b))不纳入到支持物结合的salipro颗粒中。因此，图9c所述的实施方案使得能够在步骤b.2)中由多个支持物结合的粗制膜囊泡产生包含单一类型膜蛋白(4c)的salipro颗粒。组装的颗粒基本上不含去垢剂。可以洗脱图9a至图9c的支持物结合的颗粒。洗脱策略取决于支持物(12)的捕获部分(13)和疏水剂中的结合部分(5)之间的相互作用类型。
[0294]
图10a至图10d以简化和示意图形式示出了方法步骤b.1)和c.1)的特定实施方案。使支持物结合的鞘脂激活蛋白样蛋白与去垢剂溶解的膜蛋白(实例为单体跨膜蛋白(4a)，参见图10a)、与粗制膜囊泡(实例为囊泡(7、7')，参见图10b)、去垢剂溶解的疏水性化合物(4c)(参见图10c)或者与去垢剂溶解的疏水性化合物(4c)和膜蛋白(4a)(参见图10d)这两者接触，以使得能够进行步骤c.1)中各个salipro颗粒在支持物上的自组装。邻近捕获的鞘脂激活蛋白样蛋白或另外添加的游离鞘脂激活蛋白样蛋白有助于形成单个salipro颗粒(未示出)。例如，在步骤c.1)期间或之后添加额外的鞘脂激活蛋白样蛋白以使得能够进行鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的自组装(未示出)。图10a的组装颗粒基本上由已经与溶解的膜蛋白(4a)缔合的脂质(3)组成。通常通过蛋白质纯化过程获得溶解的蛋白质，并且在这些情况下，溶解的蛋白质通常包埋在包含去垢剂分子和脂质(3)的胶束中。与溶解的膜蛋白缔合的脂质通常是膜的“壳脂质”，从该“壳脂质”纯化膜蛋白(4a)。膜蛋白可以从其“天然”膜中纯化，但这不是必须的。例如，真核生物膜蛋白可以从诸如细菌之类的原核细胞或病毒中的转基因过表达，然后从中纯化膜蛋白。因此，与去垢剂溶解的真核生物膜蛋白保持缔合的脂质(3)可能无法形成此类纯化蛋白的“天然”脂质环境的一部分。壳脂质紧密地粘合至膜蛋白(4a)的疏水性表面。仅任选地，将其他脂质添加液体环境中以纳入salipro颗粒中。
[0295]
在步骤c.1)中使粗制膜囊泡(实例为图10b的囊泡(7、7'))与支持物结合的鞘脂激
活蛋白样蛋白接触(参见图10b)使得产生salipro颗粒的支持物结合文库，即支持物结合的salipro颗粒在它们的尺寸和包含鞘脂激活蛋白样蛋白(2)、脂质(3)和/或膜蛋白(4a、4b)的组成方面不同。甚至可以产生不包含任何疏水剂的“空的”颗粒。在文库的颗粒中，各个膜蛋白(4a、4b)包埋在获得膜蛋白的膜环境中，即膜蛋白保持包埋在其“天然”脂质环境中。因此，在组装的salipro颗粒中与膜蛋白(4a、4b)缔合的脂质(3)优选来自存在于粗制膜囊泡(7)中的膜蛋白天然脂质环境的遗留物。病毒、古细菌、真核生物或原核生物的膜可以用作源膜。图10c的组装颗粒，每个颗粒包含三种疏水性化合物。当然，通过调节步骤c.1)的自组装反应中所用的疏水性化合物与脂质的摩尔比，可以调整纳入到单个颗粒中的疏水性化合物的数量。图10c的疏水性化合物以溶解状态添加到自组装反应中。通常通过去垢剂分子实现疏水性化合物的溶解，类似于疏水性膜蛋白的溶解。如图10c所示，脂质可形成疏水性化合物溶解状态的一部分。任选地，可以添加额外的脂质。如图11d所示，溶解的疏水性化合物(4c)和膜蛋白(4a)形式的疏水剂可在步骤c.1)中一起应用。可以选择任何所需的溶解的疏水性化合物与膜蛋白的分子比，这会影响所获得的颗粒的组成。图10a至图10d所述的组装颗粒通常基本上不含去垢剂。可以洗脱图10a至图10d的支持物结合的颗粒。洗脱策略取决于捕获部分(13)/结合部分(5)对之间的相互作用类型。
实施例
[0296]
以下例子旨在具体参照一些实施方案和附图以更详细的方式进一步说明本发明，而并不旨在限制本发明。
[0297]
i
[0298]
缩写
[0299]
将使用以下缩写：
[0300]
asp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
天冬氨酸
[0301]
cv
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
柱体积
[0302]
dagfp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
这种绿色荧光蛋白能够以与常规gfp相同的方式使用，使用基于氩激光或基于uv的激发装置，从而能够进行荧光检测。该蛋白的激发峰为510nm，并且发射峰为521nm。
[0303][0304][0305][0306]
eb1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
洗脱缓冲液(20mm hepes ph 7.5，150mmnacl，400mm咪唑)
[0307][0308]
eb2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
洗脱缓冲液(50mm hepes ph 7.5，2％ddm，0.4％chs，200mm nacl，1mm l
‑
asp，1mmedta，1mm tcep和5％甘油，2.5mm脱硫生物素)
[0309][0310][0311][0312]
eb3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50mm hepes ph 7.5，200mm nacl，10％甘油，250μg/ml flag
‑
肽
[0313][0314]
eb4
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50mm hepes ph 7.5，200mm nacl，补充有2mm生物素的10％甘油
[0315][0316]
edta
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙二胺四乙酸
[0317]
ddm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
正十二烷基
‑
β
‑
d
‑
麦芽糖苷
[0318]
gf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
凝胶过滤缓冲液(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl)
[0319][0320]
hepes
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ4‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙烷磺酸
[0321]
his
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
组氨酸
[0322]
hng缓冲液
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50mm hepes ph 7.5，200mm nacl和5％甘油
[0323]
hng缓冲液ii
ꢀꢀꢀꢀ
50mm hepes ph 7.5，200mm nacl和10％甘油
[0324]
imac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
固定化金属亲和色谱
[0325]
iptg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
异丙基β
‑
d
‑1‑
硫代半乳糖苷
[0326]
lb1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，20mm咪唑
[0327][0328]
lb2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50mm hepes/tris
‑
碱，ph 7.4，50mm nacl缓冲液，该缓冲液补充有1mm l
‑
asp，1mmedta，1mm pmsf，1mm tcep以及1:200(v/v)稀释的哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(sigma)
[0329][0330][0331][0332][0333]
pei
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚乙烯亚胺
[0334]
pmsf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
苯甲基磺酰氟
[0335]
sb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
溶解缓冲液
[0336]
sec
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
尺寸排阻色谱
[0337]
slc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
溶质载体
[0338]
tcep
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三(2
‑
羧乙基)膦
[0339]
tev
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
烟草蚀纹病毒
[0340]
tris
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三(羟甲基)氨基甲烷
[0341]
tb培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
特级肉汤培养基
[0342]
wb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
工作缓冲液(50mm hepes ph 7.5，2％ddm，0.4％chs，200mm nacl，1mm l
‑
asp，1mmedta，1mm tcep和5％甘油)
[0343][0344][0345]ⅱ[0346]
鞘脂激活蛋白a的纯化
[0347]
由以下方法制备以下实验中所用的纯化的鞘脂激活蛋白a。通过以下方法进行鞘脂激活蛋白a蛋白的表达：使用将人鞘脂激活蛋白a(seq id no:1)的编码区插入pnic
‑
bsa4质粒的载体，并将其转染入大肠杆菌e.coli rosetta gami
‑
2(de3)(novagen公司)菌株中进行表达。在补充有四环素、氯霉素和卡那霉素的tb培养基中，在37℃培养细胞，并利用0.7mm iptg诱导。诱导后3小时，通过12,000
×
g离心15分钟收集细胞。弃上清，利用裂解缓
冲液lb1(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，20mm咪唑)将细胞团重悬，并且通过超声使其破裂。裂解物经过26,000
×
g离心30分钟，上清于85℃加热10分钟，而后以26000
×
g再次进行离心步骤30分钟。利用ni sepharose
tm 6 fast flow介质，颠倒旋转60分钟，从而对上清进行分批吸附，由此进行初步imac纯化。在鞘脂激活蛋白a结合到imac树脂后，将色谱介质装入10mm(内径(i.d.))的开口重力流柱中，并利用15柱床体积的裂解缓冲液lb1进行清洗以去除未结合的蛋白。用15柱床体积的洗涤缓冲液(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，40mm咪唑)清洗树脂。添加5柱床体积的洗脱缓冲液eb1(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl，400mm咪唑)来洗脱鞘脂激活蛋白a。洗脱液利用ph 7.5的补充有重组tev蛋白酶的凝胶过滤缓冲液gf(20mm hepes ph 7.5，150mm nacl)透析过夜。通过使洗脱液经过2ml的imac树脂来从其中除去含有不可切割的his
‑
标签的tev蛋白酶。利用离心过滤单元将切割后的靶标蛋白浓缩至5ml体积，并且利用10色谱系统上柱至hiload superdex
tm 200 16/60gl柱(均得自ge healthcare公司)。合并(pool)峰级分并浓缩至1.2mg/ml蛋白。蛋白样品在液氮中快速冷冻，并于
‑
80℃储藏。
[0348]
iii
[0349]
在支持物上生产salipro颗粒
[0350]
实施例1：
[0351]
在该实施例中，在根据本发明方法的可选方案(ii)中，使用大跨膜转运体(slc)作为疏水剂。以从slc过表达的hek293f细胞获得的粗制膜级分的形式提供脂质和疏水剂。slc转运体包含链球菌ii
‑
标签作为结合部分。根据本发明，将抗链球菌
‑
ii亲和纯化珠粒用作支持物。它们包括能够结合slc转运蛋白所含的链球菌ii结合部分的抗链球菌
‑
ii捕获部分。将鞘脂激活蛋白a添加到支持物结合的含slc转运体的溶解的膜中，使得能够形成含slc转运体的鞘脂激活蛋白脂质颗粒，该颗粒仍然经由slc转运蛋白所含的链球菌
‑
ii标签连接至支持物。因此，鞘脂激活蛋白脂质颗粒的组装完全在支持物上进行，并且与来源于细胞膜并仍与支持物结合的slc转运蛋白复合的内源脂质一起组装。
[0352]
1.a.膜蛋白的过表达
[0353]
将人slc转运体的编码序列引入到编码n端链球菌
‑
标签ii、随后是dagfp和prescission蛋白酶切割位点的表达载体。转染前，使hek293f细胞(atcc细胞系，支原体试验阴性)在补充有4mm l
‑
谷氨酰胺(sigma)和5μg/ml酚红(sigma
‑
aldrich)的excell293培养基(sigma)中生长至密度为2.5
×
106个细胞/ml。用freestype293培养基(invitrogen)的表达载体，使用聚乙烯亚胺(pei)(polysciences)以2.5
×
106个细胞/ml的密度瞬时转染细胞，转染后用等体积的excell293稀释6h，并在稀释培养物后用2.2mm丙戊酸(sigma)处理12h。然后，经转染的细胞过表达融合蛋白链球菌ii
‑
dagfp
‑
slc。在转染后约48h时收集全部细胞。
[0354]
1.b.粗制细胞膜的制备
[0355]
基本上如以上a.所述在5l培养物中进行融合蛋白链球菌ii
‑
dagfp
‑
slc的大规模表达。将细胞收集在包含50mm hepes/tris
‑
碱、ph 7.4、50mm nacl的裂解缓冲液(lb2)中，该缓冲液补充有1mm l
‑
asp、1mm edta、1mm pmsf、1mm tcep以及1:200(v/v)稀释的哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物(sigma)，并在细胞均质器(emulsiflex
‑
c5，avestin)中经由在约103,000kpa的3次运行来破碎。所得的匀浆通过离心(4,500g，0.5h)得到澄清，并通过超速
l
‑
asp的无去垢剂hng缓冲液中，通过使用superose 6 increase 5/150 gl柱的sec进一步分析40μl的浓缩样品。
[0374]
通过sds
‑
page分析sec级分表明(图12a)，主要级分13、14和15包括纯化的包含slc转运体和鞘脂激活蛋白的salipro颗粒。
[0375]
为了进一步证实重构salipro颗粒的均质性，在补充有1mm l
‑
asp的无去垢剂hng缓冲液中，通过使用superose 6 increase 5/150 gl柱的sec进一步分析20μl的级分14。相应的sec图谱(图12b)进一步证明了当在亲和珠粒上重构时salipro颗粒的稳定性和均质性。
[0376]
本文呈现的数据清楚地表明，当颗粒组分中的一者结合至亲和支持物时，有可能将疏水剂重构到鞘脂激活蛋白颗粒中。数据还示出了粗制膜可用于本发明的方法中。
[0377]
iv
[0378]
由全细胞生产salipro颗粒
[0379]
实施例2：
[0380]
在该实施例中，在根据本发明方法的可选方案(ii)中，将膜蛋白用作疏水剂。以完整细胞的形式(即过表达膜蛋白的人胚肾(hek)细胞)提供脂质和疏水试剂。所述hek细胞仅与去垢剂接触而不进行机械细胞裂解步骤。真核生物膜蛋白包括flag
‑
标签作为结合部分。根据本发明，将抗flag亲和纯化珠粒用作支持物。它们包括能够结合真核生物膜蛋白所含的flag结合部分的抗flag捕获部分。将鞘脂激活蛋白a添加到支持物结合的经去垢剂处理的膜所含的真核生物膜蛋白中，使得能够形成包含真核生物膜蛋白的鞘脂激活蛋白脂质颗粒。因此，在该实施例中，鞘脂激活蛋白脂质颗粒的组装完全在支持物上进行，并且与以经去垢剂处理的表达待包含的目的真核细胞膜蛋白的全细胞形式提供的内源脂质一起组装。
[0381]
2.a.膜蛋白的过表达
[0382]
将真核生物膜蛋白的编码序列引入到编码n端flag
‑
标签的表达载体。转染前，使hek293f细胞在293 freestyle培养基中生长，并使用制造商(thermofisher)提供的方案使用pei
‑
max试剂转染。然后经转染的细胞过表达膜蛋白。在转染后约48h时收集全部细胞。
[0383]
2.b.溶解膜的制备
[0384]
将过表达flag
‑
标签的真核生物膜蛋白的细胞收获成细胞团块。然后将该细胞团块溶解在hng缓冲液ii中，该缓冲液另外包含终浓度为2x的25x蛋白抑制剂混合物。随后，将在包含10％gdn的水溶液(w/v)添加到重悬的细胞中，至终浓度为1％gdn(w/v)。然后将样品在冷室中的旋转轮上孵育5min。然后，将样品在4℃以5000g离心5min。回收包含溶解物质(包含经去垢剂处理的膜)的上清，并在冷室中的旋转轮上再孵育50min。在该孵育步骤之后，将上清以30000g和4℃离心30min以除去膜碎片，然后用于下一步骤2.c中，从而结合至亲和支持物。
[0385]
2.c.结合至亲和支持物并洗脱
[0386]
使用以下缓冲液：
[0387]
‑
hng缓冲液ii：50mm hepes ph 7.5，200mm nacl和10％甘油
[0388]
‑
eb3：50mm hepes ph 7.5，200mm nacl，10％甘油，250μg/ml flag
‑
肽
[0389]
通过将100μl平衡m2抗flag亲和纯化珠粒(sigmaaldrich)上柱至各个柱来制备能够通过重力流穿过而除去未结合的物质的4个柱。然后将500μl的步骤2.b中获得的溶解膜
添加到各柱中。然后使流出液(flow
‑
through)再穿过柱三次，以使flag
‑
标记的真核生物膜蛋白能够有效地结合至亲和珠粒。在该阶段没有洗涤负载有flag标记的真核生物膜蛋白的亲和珠粒，并且在部分包含天然细胞膜脂质和去垢剂胶束以及hng缓冲液ii组分的环境(珠粒的“死体积”)中包含亲和结合的真核生物膜蛋白。
[0390]
将不同量(0ml至6ml)的1mg/ml鞘脂激活蛋白a添加到相应的柱中。
[0391]
‑
样品1：1ml hng缓冲液ii
[0392]
‑
样品2：1ml鞘脂激活蛋白a
[0393]
‑
样品3：3ml鞘脂激活蛋白a
[0394]
‑
样品4：6ml鞘脂激活蛋白a
[0395]
然后将混合物转移至四个新的管中，并在转移回柱中之前，在4℃使用旋转轮孵育25min。使用重力流穿过柱而除去未结合的物质，随后在hng缓冲液ii中洗涤10 cv，并用500μl洗脱缓冲液eb3进行洗脱步骤。
[0396]
2.d.salipro颗粒的分析
[0397]
使用amicon ultra
‑
2离心过滤器(10kda nmwl)以13000g和4℃浓缩亲和珠粒与不同量的鞘脂激活蛋白a孵育后获得的洗脱物(参见之前的章节2.c，样品1至4)。在无去垢剂的hng缓冲液ii中，通过使用superose 6 increase 5/150 gl柱的sec进一步分析浓缩的样品以检测形成的salipro颗粒。
[0398]
预期利用上述实验工作流程，可以由作为起始材料的完整细胞获得鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒，其中完整细胞未经机械细胞裂解，并且同时，目的真核生物膜蛋白结合至亲和支持物。作为这些条件下的阴性对照，当将鞘脂激活蛋白a排除在液体环境之外时，不应当获得salipro颗粒。
[0399]
v
[0400]
在支持物上生产salipro颗粒
[0401]
实施例3：
[0402]
在该实施例中，根据本发明方法的可选方案(i)进行salipro颗粒的重构，即将鞘脂激活蛋白固定在亲和支持物上。为此，将鞘脂激活蛋白生物素化，并结合至抗生物素蛋白亲和珠粒基质。使支持物结合的鞘脂激活蛋白与额外的未标记的鞘脂激活蛋白、脂质和任选的疏水剂接触，使得能够形成根据本发明的salipro颗粒。因此，在支持物上发生鞘脂激活蛋白脂质颗粒的组装。
[0403]
3.a.生物素化鞘脂激活蛋白a的制备
[0404]
根据制造商的方案，使用nhs
‑
生物素试剂(thermo fisher，编号21343)使鞘脂激活蛋白a生物素化。然后用quant*标签生物素试剂盒(vector laboratory，bdk
‑
2000)对每个鞘脂激活蛋白a的生物素数量进行定量，并且示出了每个鞘脂激活蛋白a分子存在1.1个生物素。
[0405]
3.b.结合至亲和支持物并洗脱
[0406]
根据制造商的方案制备并洗涤单体抗生物素蛋白基质(thermo fisher 20228)。生物素化的鞘脂激活蛋白a结合至制备的抗生物素蛋白亲和基质上。对于各样品，通过使生物素化的鞘脂激活蛋白a穿过柱(biorad，polyprop色谱柱，art.nr 7311550)所含的基质三次，从而将100μl的生物素化的鞘脂激活蛋白a(1.2mg/ml)结合至25μl的抗生物素蛋白亲和
基质。然后用hng缓冲液ii充分洗涤亲和基质以确保除去未结合的鞘脂激活蛋白a。
[0407]
用装载有鞘脂激活蛋白a的抗生物素蛋白亲和基质，评价了两种不同的颗粒组装条件：在样品1中，将脑脂质和未标记的鞘脂激活蛋白a添加到具有预固定化的鞘脂激活蛋白a的亲和树脂中。在样品2中，将脑脂质、膜蛋白(细菌离子通道膜蛋白t2)和未标记的鞘脂激活蛋白a添加到具有预固定化的鞘脂激活蛋白a的亲和树脂中。
[0408]
通过将5mg/ml的脑脂质(sigma
‑
aldrich)溶解在0.5％ddm中并在37℃预孵育5分钟从而制备脑脂质溶液。
[0409]
如在先的“f guettou等人，nature structural & molecular biology，21；728
‑
731，2014”所述纯化细菌离子通道膜蛋白t2。
[0410]
样品1至2的颗粒组装条件如下：
[0411]
‑
样品1：将16μl脑脂质溶液添加到具有预固定化的鞘脂激活蛋白a的亲和树脂中，并室温孵育5min，然后添加100μl未标记的鞘脂激活蛋白a(1.2mg/ml)。
[0412]
‑
样品2：将16μl脑脂质溶液与8μl t2(10mg/ml)混合，并在37℃孵育5分钟，然后将混合物添加到具有预固定化的鞘脂激活蛋白a的亲和树脂中。然后，样品在室温孵育5min，此后添加100μl未标记的鞘脂激活蛋白a(1.2mg/ml)。
[0413]
然后将两个样品于室温在旋转轮上同时孵育25分钟。随后，将以下缓冲液用于处理样品柱：
[0414]
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hng缓冲液ii：50mm hepes ph 7.5，150mm nacl和10％甘油
[0415]
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eb4：补充有2mm生物素(thermo fisher 29129)的hng缓冲液
[0416]
用不含去垢剂的hng缓冲液ii充分洗涤亲和珠粒(使用10 cv进行3次)，并使用洗脱缓冲液eb4洗脱固定化的样品。
[0417]
3.c.所得的salipro颗粒的分析
[0418]
使用在hng缓冲液ii中运行的superdex
tm 200 5/150 gl分析凝胶过滤柱，对洗脱的样品进行分析sec。
[0419]
结果示于图13。对于样品1和2，在洗脱曲线中检测到salipro颗粒(参见图13的样品1在6.4min处的sec峰以及样品2在4.5min处的sec峰)。因此，固定化的鞘脂激活蛋白a能够在亲和支持物上进行salipro颗粒的组装。
[0420]
总之，本文呈现的数据清楚地证明，当颗粒组分中的一者结合至亲和支持物时，能够使用不同的起始材料重构salipro颗粒。