一种同时测定治疗肝病中药的多种成分含量的方法与流程

1.本发明涉及中药制剂的质量控制方法领域，具体涉及一种同时测定中药多种成分含量的方法，并由此方法测定治疗肝病中药中所含各成分的含量。


背景技术：

2.治疗肝病的中药作为复方制剂，属于新药研发中的第六类中药，具有益气疏肝、活血软坚的功效，其主要成分包括，葛根、赤芍、三七、黄芪、丹参等。具体组成及制法如中国专利申请cn101214288b“一种治疗肝病的中药组合物及其制备方法”所记载。其《中国药典》2015年版一部中记载，葛根是以葛根素为以指标，丹参是以丹参酮iia为指标，赤芍是以芍药苷为指标，三七是以三七皂苷r1为指标，黄芪是以黄芪甲苷为指标，但采用高效液相色谱进行测定时，均是分开测定黄芪甲苷、葛根素、芍药苷的含量等，测定成分少，对于这三个成分的定量检测很难真正控制中药的产品质量，无法彻底杜绝中药掺假、伪劣等现象，也不能客观反映和评价中药质量的一致性，且样品前处理繁琐，分析时间长，可操作性不强。因此，迫切需要建立一种同时测定该中药多种成分含量的方法，以建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。


技术实现要素：

3.鉴于现有技术存在的问题，提出了本发明的一种同时测定治疗肝病中药的多种成分含量的方法，以便克服上述问题或者至少部分地解决上述问题。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
5.根据本发明的一个方面，提供一种同时测定治疗肝病中药的多种成分含量的方法，该方法采用高效液相色谱法测定治疗肝病中药的成分含量，该高效液相色谱条件为，
6.色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
7.流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.08％-0.12％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
8.0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
9.25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
10.50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
11.65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
12.95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
13.流速：0.8ml/min-1.0ml/min；
14.柱温：25℃-30℃；
15.检测波长：270nm；
16.漂移管温度：70℃；
17.载气流速：2.0l/min；
18.进样量：5μl。
19.可选地，该方法为，
20.s1，精密称取供试品，加入50％甲醇溶液，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，得供试品溶液；
21.s2，精密称取各对照品，加入50％甲醇溶液制成对照品储备液，精密吸取一定量各对照品储备液置同一量瓶中，加入50％甲醇溶液稀释至刻度，得对照品溶液；
22.s3，吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按所述高效液相色谱条件测定后，以对照品的进样量值或进样量的对数值为横坐标，峰面积的进样量值的或峰面积的对数值为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算供试品中所含各成分的含量。
23.可选地，所述高效液相色谱条件为，
24.色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
25.流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.1％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
26.0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
27.25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
28.50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
29.65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
30.95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
31.流速：1.0ml/min；
32.柱温：30℃；
33.检测波长：270nm；
34.漂移管温度：70℃；
35.载气流速：2.0l/min；
36.进样量：5μl。
37.可选地，所述治疗肝病中药的主要成分包括：葛根、赤芍、三七、黄芪、丹参。
38.可选地，所述对照品包括：没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷r1、黄芪甲苷和丹参酮iia。
39.可选地，该方法的具体步骤为，
40.s1，精密称取治疗肝病中药，研细，精密称定，置锥形瓶中，加入50％甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，得黄甲软肝溶液；
41.s2，精密称取没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷r1、黄芪甲苷和丹参酮iia，加入50％甲醇溶液制成对照品储备液，精密吸取一定量各对照品储备液置同一量瓶中，加入50％甲醇溶液稀释至刻度，得对照品溶液；
42.s3，吸取黄甲软肝溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按所述高效液相色谱条件测定，以对照品溶液的进样量值或进样量的对数值为横坐标，峰面积值进样量的或对数值为纵坐标绘制对照品溶液的标准曲线，根据对照品溶液的标准曲线计算黄甲软肝溶液中所含各成分的含量。
43.可选地，
44.所述没食子酸对照品溶液的进样量为1.444μg-28.88μg；
45.所述葛根素对照品溶液的进样量为2.118μg-42.36μg；
46.所述芍药苷对照品溶液的进样量为1.074μg-21.48μg；
47.所述三七皂苷r1对照品溶液的进样量为0.2180μg-4.360μg；
48.所述黄芪甲苷对照品溶液的进样量为0.1151μg-2.302μg；
49.所述丹参酮iia对照品溶液的进样量为0.0667μg-1.334μg。
50.可选地，
51.所属没食子酸对照品溶液的标准曲线：以没食子酸的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标；
52.所述葛根素对照品溶液的标准曲线：以葛根素的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标；
53.所述丹参酮iia对照品溶液的标准曲线：以丹参酮iia对照品溶液的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标；
54.所述芍药苷对照品溶液的标准曲线：以芍药苷对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标；
55.所述三七皂苷r1对照品溶液的标准曲线：以三七皂苷r1对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标；
56.所述黄芪甲苷对照品溶液的标准曲线：以黄芪甲苷对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标。
57.本发明的技术方案是，采用高效液相色谱仪建立一种全新的同时测定治疗肝病中药中各成分含量的高效液相色谱法，并基于该方法对其中葛根、赤芍、三七、黄芪、丹参同时进行定性和定量分析，
58.本发明的有益效果：
59.1、本发明节省测定时间，操作简便，测定结果更加准确，对控制其质量和保证临床疗效具有重要意义。
60.2、采用甲醇-0.1％冰醋酸为流动相时，基线较稳定，色谱峰对称，其分离度较好，各成分分离度均大于1.5。
61.3、本发明采用50％甲醇超声提取中药所含的各成分，平均回收率可达到94.81％～103.19％，rsd均小于5.0％。
62.4、本发明选用如下洗脱程序进行分离，0-25min，5％-30％a，95％-70％b；25-50min，30％-35％a，70％-65％b，50-65min，35％-45％a，65％-55％b；65-95min，45％-95％a，55％-5％b；95-105min，95％a，5％b，各成分均能得到较好的分离。
附图说明
63.图1为本发明的一个实施例中提供的没食子酸对照品溶液的标准曲线图；
64.图2为本发明的一个实施例中提供的葛根素对照品溶液的标准曲线图；
65.图3为本发明的一个实施例中提供的丹参酮iia对照品溶液的标准曲线图；
66.图4为本发明的一个实施例中提供的芍药苷对照品溶液的标准曲线图；
67.图5为本发明的一个实施例中提供的三七皂苷r1对照品溶液的标准曲线图；
68.图6为本发明的一个实施例中提供的黄芪甲苷对照品溶液的标准曲线图。
具体实施方式
69.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
70.治疗肝病中药以下实施例中所使用的治疗肝病中药的批号和对照品见下表：
[0071][0072][0073]
仪器
[0074]
agilent 1260infinity ii高效液相色谱仪(美国agilent公司)，agilent 1260infinity ii蒸发光检测器(美国agilent公司)，kq－500db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，电子天平(sqp赛多利斯有限公司)，jj100(常熟市双杰测试仪器厂)。
[0075]
试剂
[0076]
甲醇(色谱纯)merck公司，甲醇(分析纯)广州化学试剂厂，乙醇(分析纯)广州化学试剂厂，冰醋酸(色谱纯)山东西亚试剂有限公司，水为超纯水。
[0077]
实施例1
[0078]
s1，精密称取批号为1805311的治疗肝病中药4.0g，研细，精密称定，置锥形瓶中，加入50％甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得黄甲软肝溶液。
[0079]
s2，精密称取没食子酸、葛根素、芍药苷、三七皂苷r1、黄芪甲苷和丹参酮iia，加入50％甲醇溶液制成对照品储备液，精密吸取一定量各对照品储备液置同一量瓶中，加入50％甲醇溶液稀释至刻度，得对照品溶液。
[0080]
s3，分别吸取黄甲软肝溶液和混合对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，
[0081]
其中，高效液相色谱条件为，
[0082]
色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
[0083]
流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.1％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例
均为体积百分比：
[0084]
0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
[0085]
25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
[0086]
50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
[0087]
65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
[0088]
95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
[0089]
流速：1.0ml/min；
[0090]
柱温：30℃；
[0091]
检测波长：270nm；
[0092]
漂移管温度：70℃；
[0093]
载气流速：2.0l/min；
[0094]
进样量：5μl；
[0095]
经高效液相色谱仪测定后得没食子酸对照品溶液的峰面积为4124.623、12625.453、21395.002、30035.921、42983.075、62898.982、85451.945；进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得没食子酸对照品溶液的进样量为1.444μg、4.332μg、7.220μg、10.11μg、14.44μg、21.66μg、28.88μg，
[0096]
葛根素对照品溶液的峰面积为5303.719、15637.522、26085.427、36295.104、51376.166、74887.949、101071.152；进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得葛根素对照品溶液的进样量为2.118μg、6.354μg、10.59μg、14.83μg、21.18μg、31.77μg、42.36μg，
[0097]
丹参酮iia对照品溶液的峰面积为32.947、92.365、154.023、211.579、291.261、414.157、549.408，进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得丹参酮iia对照品溶液的进样量为0.0667μg、0.2001μg、0.3335μg、0.4669μg、0.6670μg、1.001μg、1.334μg，
[0098]
芍药苷对照品溶液的峰面积为170.690、604.205、1174.074、1864.661、2970.766、4730.297、6975.941，进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得芍药苷对照品溶液的进样量为1.074μg、3.222μg、5.370μg、7.518μg、10.74μg、16.11μg、21.48μg，
[0099]
三七皂苷r1对照品溶液的峰面积为80.163、262.682、504.260、773.216、1240.225、2065.983、3221.260，进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得三七皂苷r1对照品溶液的进样量为0.2180μg、0.6540μg、1.090μg、1.526μg、2.180μg、3.270μg、4.360μg，
[0100]
黄芪甲苷对照品溶液的峰面积为17.994、63.663、106.492、157.208、251.218、408.493、629.542，进样体积为1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl，计算得黄芪甲苷对照品溶液的进样量为0.1151μg、0.3453μg、0.5755μg、0.8057μg、1.151μg、1.727μg、2.302μg。
[0101]
结果以没食子酸对照品溶液的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制图1没食子酸对照品溶液的标准曲线，以葛根素对照品溶液的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制图2葛根素对照品溶液的标准曲线，以丹参酮iia对照品溶液的进样量值为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制图3丹参酮iia对照品溶液的标准曲线，以芍药苷对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积对数值为纵坐标绘制图4芍药苷对照品溶液的标准曲线，以三七皂苷r1对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐
标绘制图5三七皂苷r1对照品溶液的标准曲线，以黄芪甲苷对照品溶液的进样量的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标绘制图6黄芪甲苷对照品溶液的标准曲线。
[0102]
再根据图1没食子酸对照品溶液的标准曲线和黄甲软肝溶液的进样量，将黄甲软肝溶液的峰面积带入线性方程即可求出黄甲软肝溶液中没食子酸的含量。
[0103]
需要说明的是，黄甲软肝溶液中的葛根素和丹参酮iia的含量计算均与没食子酸的含量计算方法相同。
[0104]
经计算得黄甲软肝溶液中没食子酸的含量为2.612mg/g、葛根素的含量为10.06mg/g、丹参酮iia的含量为0.7192mg/g。
[0105]
根据图4芍药苷对照品溶液的标准曲线和黄甲软肝进样量，将黄甲软肝溶液的峰面积对数值带入线性方程即可求出黄甲软肝溶液中芍药苷的含量。
[0106]
需要说明的是，三七皂苷r1和黄芪甲苷的含量计算方法均与芍药苷的含量计算方法相同。
[0107]
经计算得黄甲软肝溶液中芍药苷的含量为7.044mg/g、三七皂苷r1的含量为0.6218mg/g、黄芪甲苷的含量为1.529mg/g。
[0108]
实施例2
[0109]
精密称取批号为1805312的治疗肝病中药4g，按实施例1中的步骤进行测定，与实施例1不同的是，高效液相色谱的条件为，
[0110]
色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
[0111]
流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.08％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
[0112]
0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
[0113]
25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
[0114]
50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
[0115]
65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
[0116]
95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
[0117]
流速：0.8ml/min；
[0118]
柱温：25℃；
[0119]
检测波长：270nm；
[0120]
漂移管温度：70℃；
[0121]
载气流速：2.0l/min；
[0122]
进样量：5μl；
[0123]
按实施例1的计算方法，得没食子酸的含量为2.731mg/g，葛根素的含量为10.34mg/g、丹参酮iia的含量为0.8180mg/g，芍药苷的含量为7.617mg/g、三七皂苷r1的含量为0.6602mg/g、黄芪甲苷的含量为1.697mg/g。
[0124]
实施例3
[0125]
精密称取批号为1805313的治疗肝病中药4g，按实施例1中的步骤进行测定，与实施例1不同的是，高效液相色谱的条件为，
[0126]
色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
[0127]
流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.12％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比
例均为体积百分比：
[0128]
0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
[0129]
25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
[0130]
50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
[0131]
65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
[0132]
95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
[0133]
流速：0.9ml/min；
[0134]
柱温：27℃；
[0135]
检测波长：270nm；
[0136]
漂移管温度：70℃；
[0137]
载气流速：2.0l/min；
[0138]
进样量：5μl；
[0139]
按实施例1的计算方法，得没食子酸的含量为2.675mg/g，葛根素的含量为10.21mg/g、丹参酮iia的含量为0.7800mg/g，芍药苷的含量为7.509mg/g、三七皂苷r1的含量为0.6996mg/g、黄芪甲苷的含量为1.6732mg/g。
[0140]
实施例4
[0141]
精密称取批号为180610的治疗肝病中药4.0g，按实施例1中的步骤进行测定，与实施例1不同的是，高效液相色谱的条件为，
[0142]
色谱柱：waters symmetry c
18
色谱柱，规格250mm*4.6mm,5μm；
[0143]
流动相：流动相a为甲醇，流动相b为0.11％冰醋酸，采用梯度洗脱，其中流动相比例均为体积百分比：
[0144]
0-25min，流动相a为5％-30％，流动相b为95％-70％；
[0145]
25-50min，流动相a为30％-35％，流动相b为70％-65％；
[0146]
50-65min，流动相a为35％-45％，流动相b为65％-55％；
[0147]
65-95min，流动相a为45％-95％，流动相b为55％-5％；
[0148]
95-105min，流动相a为95％，流动相b为5％；
[0149]
流速：0.9ml/min；
[0150]
柱温：27℃；
[0151]
检测波长：270nm；
[0152]
漂移管温度：70℃；
[0153]
载气流速：2.0l/min；
[0154]
进样量：5μl；
[0155]
按实施例1的计算方法，得没食子酸的含量为2.786mg/g，葛根素的含量为9.242mg/g、丹参酮iia的含量为0.9572mg/g，芍药苷的含量为9.863mg/g、三七皂苷r1的含量为0.6777mg/g、黄芪甲苷的含量为1.643mg/g。
[0156]
下面是同时测定治疗肝病中药的成分含量方法的方法学验证
[0157]
1、线性范围考察
[0158]
分别精密吸取1μl、3μl、5μl、7μl、10μl、15μl、20μl的对照品溶液储备液按实施例1中的高效液相色谱条件进样测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制没食子酸、葛
根素和丹参酮iia的标准曲线并进行线性回归，以进样量对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标，绘制芍药苷、三七皂苷r1和黄芪甲苷的标准曲线并进行线性回归，得回归方程。各成分的回归方程及线性范围见表1，
[0159]
表1回归方程和线性范围
[0160]
成分回归方程线性范围(μg)r没食子酸y＝2945.8x 4.56911.444～28.880.9999葛根素y＝2362.3x 779.492.118～42.360.9998丹参酮iiay＝403.14x 15.0430.0667～1.3340.9993芍药苷y＝1.2469x 5.00601.074～21.480.9996三七皂苷r1y＝1.2329x 6.17140.2180～4.3600.9986黄芪甲苷y＝1.1717x 5.37870.1151～2.3020.9989
[0161]
2、精密度考察
[0162]
取对照品溶液，按实施例1中的高效液相色谱条件，连续进样5次，每次进样5μl，记录峰面积值，结果见表2，
[0163]
表2精密度试验结果
[0164][0165][0166]
3、重复性考察
[0167]
分别精密称取治疗肝病中药样品6份，按实施例1的制备制得黄甲软肝溶液，按实施例1高效液相色谱条件测定，每次进样5μl。结果见表3，
[0168]
表3重复性试验结果
[0169][0170]
4、稳定性考察
[0171]
取同一黄甲软肝溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，结果见表4，
[0172]
表4稳定性试验结果
[0173][0174]
5、加样回收率实验
[0175]
取已知含量的治疗肝病中药，研细，称取2.0g，共6份，精密称定，置锥形瓶中，分别加入各对照品适量，按实施例1的制备方法制备黄甲软肝溶液，进样测定，结果见表5，
[0176]
表5加样回收率实验结果
[0177]
[0178][0179]
以上试验结果表明，本发明提供的同时测定治疗肝病中药中多种成分含量的方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价其的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。