新型荧光二氧化硅纳米球-炭疽抗体缀合物及其制备方法和应用与流程

新型荧光二氧化硅纳米球
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炭疽抗体缀合物及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及炭疽检测领域，尤其涉及一种新型荧光二氧化硅纳米球
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炭疽抗体缀合物及其制备方法，以及其在制备炭疽检测试剂盒上的应用。


背景技术：

2.炭疽(anthrax)是炭疽杆菌(bacillus anthracis)引起的人畜共患的急性传染病。病死率较高。炭疽杆菌是革兰阳性的粗大杆菌。炭疽杆菌的抗原组成有荚膜抗原、菌体抗原、保护性抗原及芽胞抗原四种。保护性抗原(pa)具有很强的免疫原性。已证实对pa的免疫反应对于预防炭疽芽孢杆菌至关重要。快速准确的检测炭疽杆菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。
3.免疫层析试纸条由于其即时检测，方法简单，检测时间段，成本低等优点而成为倍受青睐的检测手段。随着免疫层析技术的发展，越来越多的物质被用作试纸条的信号物，以提高足够的灵敏度。在信号物中，从比色信号物(例如au、碳材料和染料)发展为非比色信号物(例如荧光染料、量子点qd、上转换磷光体、磁性和表面增强拉曼散射sers粒子)，从较小的纳米信号物发展为其不同的形态(如纳米棒、纳米壳和纳米立方体)或二级结构(如多聚体金信号物、荧光纳米球、磁性纳米球)。荧光纳米球一般是指球体表面标有荧光材料(包括表面覆盖)或球体内部结构含有荧光材料(如嵌入或聚合)，可以通过外部能量激发荧光。荧光染料、上转换荧光材料和半导体是常用的荧光材料。这些纳米珠的制备通常效率低下、耗时、昂贵或需要使用危险化学品。


技术实现要素：

4.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种新型荧光二氧化硅纳米球
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炭疽抗体缀合物及其制备方法和应用，用于高灵敏度检测炭疽pa，能够检测pa的可视化灵敏度高达100pg/ml。
5.技术方案：本发明的新型荧光二氧化硅纳米球
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炭疽抗体缀合物，为以炭疽为抗原的荧光二氧化硅纳米球标记的荧光免疫层析试纸条结构，该试纸条为以荧光二氧化硅纳米球为信号物的三明治型夹心免疫传感器，该试纸条包括nc膜的t线固载的炭疽包被抗体、荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体、以及通过抗原
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抗体间相互作用与两者分别相连的炭疽保护性抗原pa。
6.其中，该缀合物的制备方法，包括下述步骤：
7.1)制备nc膜的t线上固载炭疽包被抗体的试纸条；
8.2)制备荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体；
9.3)将固载炭疽包被抗体的试纸条t线和新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体与炭疽pa抗原连接。
10.其中，所述的步骤1)中，采用黑色底板、样品垫、包被有检测t线和对照c线的nc膜、
吸水垫组合，底板上的nc膜的一端粘贴吸水垫，nc膜与吸水垫之间相互重叠1mm～2mm，在nc膜的另一端粘贴样品垫；所述nc膜t线上固载有炭疽包被抗体；所述nc膜c线上固载有羊抗鼠多克隆igg抗体；所述t线的炭疽包被抗体的浓度为0.04mg/cm2～0.07mg/cm2；所述c线的igg抗体的浓度为0.04mg/cm2～0.07mg/cm2。
11.其中，所述的步骤2)中，采用aptes将荧光二氧化硅纳米球氨基化，采用丁二酸苷将氨基封端的荧光二氧化硅纳米球羧基化，采用edc将荧光二氧化硅纳米球表面的羧基活化后与炭疽标记抗体反应，制得新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体。
12.其中，所述的步骤2)中，荧光二氧化硅纳米球的制备方法包括下述步骤：
13.1)树枝状二氧化硅球体制备；
14.2)树枝状二氧化硅球体的氨基化；
15.3)氨基化的树枝状二氧化硅球体表面原位生长荧光碳点。
16.其中，所述的步骤3)中，将步骤2)制得的新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体与含有炭疽pa抗原的pbs缓冲液于室温下孵育1min～30min，pa与标记抗体形成免疫复合物，将混合液滴加在步骤1)制得的免疫层析试纸条的样品垫上，在毛细管作用力下，免疫复合物迁移至t线，余下的新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体迁移至c线；在紫外灯下观察得到炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的t线和c线。
17.其中，新型荧光二氧化硅纳米球的制备方法，步骤1)中，将浓度为0.04mg/ml～8mg/ml的三乙醇胺添加到水中，在温度80℃
±
5℃下进行搅拌，然后添加浓度为4mg/ml～40mg/ml的十六烷基溴化胺和浓度为0.4mg/ml～20mg/ml的水杨酸钠并搅拌获得溶液；向溶液中注入正硅酸四乙酯，在温度80℃
±
5℃下搅拌0.5h～6h后用乙醇稀释并通过离心收集产物，将沉淀物用乙醇洗涤若干次，将沉淀物分散在hcl/乙醇混合物中，并在温度60℃
±
5℃下进行搅拌，提取残留的有机模板，重复萃取后获得树状二氧化硅纳米球。
18.其中，新型荧光二氧化硅纳米球的制备方法，步骤2)中，将树状二氧化硅纳米球分散于乙醇中，加入aeaptms，分散均匀后加入氨水，搅拌混合后分离洗涤沉淀获得表面氨基化的树枝状二氧化硅纳米球体。
19.其中，新型荧光二氧化硅纳米球的制备方法，步骤3)中，将浓度为0.1mg/ml～10mg/ml的接枝aeaptms的树枝状二氧化硅纳米球分散在dmf中，加入浓度为0.00018mg/ml～0.018mg/ml的柠檬酸或柠檬酸盐的水溶液，混合均匀后，放入高压反应釜中，在110℃～250℃的温度下完成反应，成品自然冷却，洗涤后获得新型荧光二氧化硅纳米球。
20.该新型荧光二氧化硅纳米球
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炭疽抗体缀合物在制备炭疽检测试剂盒上的应用，采用上述制备方法得到。
21.本发明的检测原理：检测过程中，微量的炭疽pa与新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体混合后，会结合形成免疫复合物。混合液滴加到样品垫后，以nc膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在样品垫的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，免疫复合物会先被nc膜上t线捕获，形成双抗体夹心结构，多余的新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体的继续向另一端渗移被nc膜上c线捕获，因此在t线和c线上有新型荧光二氧化硅纳米球的固定并积累，在紫外灯的照射下显现出荧光。结果：t线和c线显现出荧光为阳性，即存在炭疽pa；t线无荧光和c线显现出荧光为阴性，即不存在炭疽pa或者炭疽pa含量极少；当c线不显现荧光，t线不论有无荧光时，表明结果无效。通过新型荧光二氧
化硅纳米球荧光性质示踪判断炭疽pa的有无。
22.有益效果：相比于现有技术，本发明具备以下优点：本发明制备的基于新型荧光二氧化硅纳米球的免疫层析试纸条具有简单、快速、灵敏度高(能够检测pa的可视化灵敏度高达100pg/ml)、特异性强、价廉、样品所需量少等优点。其中的新型荧光二氧化硅纳米球具有高量子产率(相对量子产率可高达89.3％)、高稳定性、优良的分散性、优异生物相容性、无毒性、低成本、易制备、表面易修饰等。以其作为免疫层析试纸条的信号物，能最大程度的提高检测极限。
附图说明
23.图1为本发明的新型荧光二氧化硅纳米球的制备及以其为信号物的炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的构建示意图；
24.图2为本发明的树枝状二氧化硅球体的tem图；
25.图3为本发明的新型荧光二氧化硅球体的tem图；
26.图4为本发明的新型荧光二氧化硅球体水溶液的荧光3d谱图；
27.图5为本发明的新型荧光二氧化硅球体固态的荧光3d谱图；
28.图6为本发明的新型荧光二氧化硅球体水溶液的紫外紫外
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可见光吸收谱图；
29.图7为本发明的新型荧光二氧化硅球体固态的紫外
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可见光吸收谱图；
30.图8为本发明的新型荧光二氧化硅球体固态的紫外
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可见光吸收谱图；
31.图9为本发明的炭疽pa的荧光免疫层析试纸条对不同浓度pa检测结果图；
32.图10为本发明的炭疽pa的荧光免疫层析试纸条对不同浓度pa的线性响应检测图；
33.图11为本发明的前体的类型对新型荧光二氧化硅纳米球荧光性能的影响图；
34.图12为本发明的柠檬酸钠浓度对新型荧光二氧化硅纳米球荧光性能影响图；
35.图13为本发明的反应温度对新型荧光二氧化硅纳米球荧光性能的影响图；
36.图14为本发明的ph对新型荧光二氧化硅纳米球荧光性能的影响图；
37.图15为本发明的炭疽pa的荧光免疫层析试纸条的特异性分析检测结果图。
具体实施方式
38.下面结合附图对本发明的技术方案进行进一步说明。
39.本发明的基于新型荧光二氧化硅纳米球的荧光免疫层析技术用于制备炭疽pa检测试纸条的应用；炭疽pa检测试纸条包括炭疽pa的荧光免疫层析技术，上述应用具体为：以炭疽pa为抗原，制备新型荧光二氧化硅纳米球为荧光信号物的荧光免疫层析检测技术。
40.该炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器，是以nc膜为载体的三明治型夹心免疫传感器，如图1，包括新型荧光二氧化硅纳米球标记的炭疽标记抗体、试纸条的nc膜的检测线固载的炭疽包被抗体、以及通过抗原
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抗体间相互作用与两者分别相连的炭疽pa。
41.主要试剂和耗材如下：三乙醇胺、十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠、正硅酸四乙酯、乙醇、浓盐酸(hcl)、氨水、n
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β
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(氨基乙基)
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γ
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氨基丙基三甲氧基硅烷(aeaptms)(aminoethyl)
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γ
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aminopropyltrimethoxysilane，cas登记号：1760
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24
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3)、γ
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氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸锌、无水乙醇、h2o、n，n
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二甲基甲酰胺(dmf)、丁二酸酐，n
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(3
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二甲基氨基丙基)
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n'
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乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、牛血清白蛋
白(bsa)、高压反应釜、烘箱、磁力搅拌器均为市面上常规购买得到。炭疽杆菌保护性抗原(pa)及其匹配的标记抗体和包被抗体均由江苏省疾病预防控制中心提供。羊抗鼠多克隆抗体igg、样品垫、nc膜、吸水垫、聚氯乙烯(pvc)基板购买自上海杰一生物科技有限公司。离心管、移液枪及枪头、直尺、签字笔、棉纤粗笔头及紫外灯。
42.实施例1：
43.制备炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器，并使用该免疫层析试纸条对pa进行检测，验证本发明的技术方案的可实现性。
44.1、合成新型荧光二氧化硅纳米球
45.1.1、将68mg三乙醇胺添加到25ml水中，并在80℃下搅拌一段时间，然后添加380mg ctab和168mg水杨酸钠并搅拌一段时间得到溶液。向溶液中注入4.5ml teos，并在80℃下轻轻搅拌2h后用乙醇稀释并通过离心收集产物。将沉淀物用乙醇洗涤几次。将沉淀物分散在hcl/乙醇混合物中，并在60℃下搅拌6h，以提取残留的有机模板。重复萃取一次，即得树状二氧化硅球。其形貌如图2所示，由图可看出其大小均匀，直径为200nm、分散性好。且球体具有从内部延伸到表面的密集的超大孔道、孔道直径为5nm～60nm，孔道长度为40nm～100nm。为碳点在球体内部的原位生长掺杂制备新型荧光二氧化硅纳米球尊定了基础。
46.1.2、将100mg树状二氧化硅纳米球分散于100ml乙醇中，加入360μl的aeaptms，分散均匀后加入2ml的氨水，搅拌12h时间后，分离洗涤沉淀获得表面氨基化的树枝状二氧化硅纳米球体。
47.1.3、10mg的接枝aeaptms的树枝状二氧化硅纳米球分散在7ml的dmf中，随后加入含有0.0037g的柠檬酸钠的水溶液，混合均匀后，放入高压反应釜的内胆中，并在烘箱中220℃高温反应30min。待自然冷却后，洗涤以获得新型荧光二氧化硅纳米球。其形貌如图3所示，由图可看出其依然维持高分散性，其进一步可进一步看出新型荧光二氧化硅纳米球的内壁相对图2内壁增厚，表明碳点在二氧化硅纳米球的内部成功生长。图4和5分别为其在水溶液和固态下的荧光3d图谱，都为非激发依赖特性，最佳激发波长分别为364和352nm，最佳发射波长分别为455和458nm。其水溶液的相对量子产率高达89.3％。图6和7分别为其在水溶液和固态下的紫外吸收谱图，在水溶液时在248和360nm有明显的紫外吸收，在固态时在256和367nm有明显的紫外吸收。图8为其红外谱图，表明新型荧光二氧化硅纳米球的表面有丰富的官能团。
48.2、新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液的制备
49.将5mg新型荧光二氧化硅纳米球分散在5ml的乙醇中，随后加入20μl的aptes和100μl氨水，搅拌6h时间后，洗涤分离再分散在5ml的dmf中，随后加入50mg的丁二酸酐，并搅拌6h后分离洗涤以获得羧基封端的新型荧光二氧化硅纳米球。最后，取1mg的羧基化的新型荧光二氧化硅纳米球分散在0.5ml的h2o中，依次加入70μl的10mg/ml的edc水溶液和0.5ml的含有40μl的标记抗原的pbs(ph＝7.4，0.01m)缓冲液，室温震荡3h后，离心将产物分散在含有1％bsa的pbs(ph＝7.4，0.01m)缓冲液，制得新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液。
50.3、nc膜的t线上固载炭疽包被抗体的试纸条的制备
51.将样品垫裁剪成8mm的长条，侵在含有2％的nacl和1％吐温
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20的pbs(ph＝7.4，0.01m)缓冲液后，拿出烘干，备用；将稀释的炭疽pa的包被抗体(2mg/ml)均匀的划在nc膜上，得到t线，将稀释好的igg抗体(2mg/ml)均匀的划在nc膜上，得到c线，制备出包被有炭疽
包被抗体的t线和包被有igg抗体的c线的nc膜，t线和c线的抗体含量为0.05mg/cm2，37℃烘箱干燥2h，备用。最后将黑色底板、硝基纤维素膜、样品垫和吸水垫组合，将划线的硝基纤维素膜粘贴在黑色底板的中部，然后在其两端分别粘贴样品垫和吸水垫，硝基纤维素膜和样品垫之间及硝基纤维素膜和吸水垫之间相互重叠1～2mm。利用裁剪机器将组装好的黑色底板裁剪为宽3mm的长条，即得到nc膜的t线上固载炭疽包被抗体的试纸条。4℃冰箱储存，备用。
52.4、炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的构建对不同浓度pa的检测
53.将10μl步骤(2)制得的新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液分别与40μl不同浓度的pa标准溶液(1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、10pg/ml、0pg/ml)混合5min后，分别滴加在平放在台面上的步骤(3)制得的试纸条的样品垫上，静置20min后，在紫外灯下观察试纸条的实验结果，如图9所示。可知，所有结果均为有效的，t线的亮度随pa浓度的降低而变弱，视觉上的检测极限为100pg/ml。用imagej软件分析处理t线的亮度，得到t线亮度与pa浓度之间的关系为y＝0.3526x 0.4061，相关系数为0.977，如图10。
54.在此基础上，可通过本发明的方法构建未知浓度的pa荧光免疫层析试纸条传感器，采集待测pa荧光免疫层析试纸条的t线的荧光亮度，通过上述线性关系分析得出待测pa的浓度，从而实现未知pa浓度的检测。
55.实施例2：
56.本实施例对金属离子的掺杂对新型荧光二氧化硅纳米球的荧光特性进行评估，只有当试纸条的荧光信号具有足够高荧光强度时，才能使荧光免疫层析试纸条传感技术具有足够高的灵敏度。步骤如下：
57.将实施例1，步骤(1)(1.2)获得接枝aeaptms的树枝状二氧化硅纳米球，取10mg分散在7ml的dmf中，分别加入含有0.0024g的柠檬酸、0.0037g的柠檬酸钠、0.0038g的柠檬酸钾或者0.0038g的柠檬酸锌的2ml水溶液。混合均匀后，放入高压反应釜的内胆中，并在烘箱中220℃高温反应30min。待自然冷却后，洗涤以获得荧光二氧化硅纳米球。荧光强度对比如图11所示，由图可看出柠檬酸钠为前体时具有更高的荧光强度。
58.实施例3：
59.本实施例对柠檬酸钠掺杂的浓度对新型荧光二氧化硅纳米球的荧光特性进行评估，只有当试纸条的荧光信号具有足够高荧光强度时，才能使荧光免疫层析试纸条传感技术具有足够高的灵敏度。步骤如下：
60.将实施例1，步骤(1)(1.2)获得接枝aeaptms的树枝状二氧化硅纳米球，取10mg分散在7ml的dmf中，分别加入含有0.0012g、0.0023g、0.0037g、0.0046。0.0092g的柠檬酸钠2ml水溶液。混合均匀后，放入高压反应釜的内胆中，并在烘箱中220℃高温反应30min。待自然冷却后，洗涤以获得荧光二氧化硅纳米球。荧光强度对比如图12所示，由图可看出当2ml柠檬酸钠水溶液含0.0037g柠檬酸钠时具有更高的荧光强度。
61.实施例4：
62.本实施例对新型荧光二氧化硅纳米球生成时的高温反应温度对新型荧光二氧化硅纳米球的荧光特性进行评估，只有当试纸条的荧光信号具有足够高荧光强度时，才能使荧光免疫层析试纸条传感技术具有足够高的灵敏度。步骤如下：
63.将实施例1，步骤(1)(1.2)获得接枝aeaptms的树枝状二氧化硅纳米球，取10mg分
散在7ml的dmf中，加入含有0.0037g的柠檬酸钠2ml的水溶液。混合均匀后，放入高压反应釜的内胆中，分别在烘箱中160℃、180℃、200℃、220℃高温反应30min。待自然冷却后，洗涤以获得荧光二氧化硅纳米球。荧光强度对比如图13所示，由图可看出当反应温度为220℃时具有更高的荧光强度。出于安全考虑，并未对反应温度进行进一步的升高。
64.更高的反应温度均在本专利的保护范围。
65.实施例5：
66.本实施例对新型荧光二氧化硅纳米球荧光稳定性进行评估，研究其不同ph的环境中对其荧光特性的影响，只有当其抗酸抗碱时，新型荧光二氧化硅纳米球才能在其他恶性环境中有进一步的应用。步骤如下：
67.将实施例1，步骤(1)获得新型荧光二氧化硅纳米球，分散在不同ph的溶剂中(ph分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14)，测其荧光强度，荧光强度对比如图14所示，由图可看出，在不考虑强碱对硅氧键的破坏可能造成对球体形貌的影响的情况下，ph为3
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14时，荧光保持在75％以上。表明该新型荧光二氧化硅纳米球的荧光性质具有强稳定性。
68.实施例6：
69.本实施例对炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的稳定性进行评估，良好的稳定性是免疫传感器性能的评判指标之一。步骤如下：
70.将实施例1，步骤(2)制备的新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液在4℃的冰箱密封放置1天、7天、15天、30天；将实施例1，步骤(3)制备的试纸条在4℃的冰箱密封放置1天、7天、15天、30天；对应相同的天数进行实施例1，步骤(4)的炭疽pa的荧光免疫层析试纸条对不同浓度pa的检测，结果均与图9保持一致，表明该炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器良好的稳定性。
71.实施例7：
72.本实施例对炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的重现性进行评估，结果能够重现才能说明实验结果的可靠性。步骤如下：
73.将实施例1，步骤(3)制备的试纸条平放在台面上，取实施例1，步骤(2)制备的新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液10ul与40ul标准pa溶液(1μg/ml、10ng/ml、100pg/ml)在室温下孵育5min，然后将混合液分别滴加到试纸条的样品垫上，在毛细管作用下，流体向前层析，20min后在紫外灯下观察实验结果。对同一批次及不同批次制备的实施例1，步骤(3)的试纸条的实验均重复3次。同一批次及不同批次制备的实施例1，步骤(3)的试纸条对不同浓度pa溶液(1μg/ml、10ng/ml、100pg/ml)的检测结果的变异系数如表1所示，表明该炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器良好的重现性。
74.表1.炭疽pa的荧光免疫层析试纸条的再现性分析。
[0075][0076]
实施例8
[0077]
本实施例对炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器的特异性进行评估，只能当该免疫层析试纸条仅对pa有特异性反应时，才能运用在实际应用中。步骤如下：
[0078]
1、溶液的配制：用pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)配制0ug/mlpa溶液、1ug/mlpa溶液、
1ug/mlafp溶液、1ug/mlca125溶液、1ug/mlhcg溶液、1ug/ml的sftsv溶液。
[0079]
2、将实施例1，步骤(3)制备的试纸条平放在台面上，取实施例1，步骤(2)制备的新型荧光二氧化硅纳米球
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标记抗体溶液10ul与40ul待测溶液在室温下孵育50min，然后将混合液分别滴加到试纸条的样品垫上，在毛细管作用下，流体向前层析，20min后在紫外灯下观察实验结果。参见图15的检测结果，只有当溶液中含有pa溶液，结果成阳性；当溶液中为其他的检测抗原或者是pbs缓冲液，结果为阴性。表明该炭疽pa的荧光免疫层析试纸条传感器优异的特异性。