一种测定小儿止咳平喘贴剂中非法添加35种化学成分的方法与流程

1.本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种测定小儿止咳平喘贴剂中非法添加35种化学成分的方法。


背景技术：

2.目前，我国市场上小儿止咳平喘类贴剂产品主要有药品、医疗器械和健字号非药品三类。由于贴剂使用方便、副作用小、小儿顺应性好等优点，已成为很多消费者止咳平喘的首选。
3.目前，国家标准和一些文献中对止咳平喘类中成药和保健食品中非法添加化学成分进行了规定或探讨，但所涉及化合物类别单一或一次检测种类较少，不能满足快速全面检测的需求；且由于贴剂中粘性橡胶基质前处理复杂，药物不易被提取，检测添加药物有一定难度，国内外文献中对于贴膏类医疗器械中非法添加化学药品的检测方法较为鲜见。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中，本发明提供了一种测定小儿止咳平喘贴剂中非法添加35种化学成分的方法，采用冷冻研磨法处理样品，利用高效液相色谱
‑
串联质谱(hplc
‑
ms/ms)，建立了35种止咳平喘类药物的测定方法，为打击医疗器械类小儿止咳平喘贴剂中非法添加提供了可靠的技术保障。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：一种测定小儿止咳平喘贴剂中非法添加35种化学成分的方法，包括以下步骤：（1）供试品溶液制备：取止咳平喘贴剂样品5贴，除去不粘层，置于冷冻研磨管中，在研磨管中加入钢制撞子，通入液氮，
‑
196℃下电池驱动钢制撞子振荡撞击样品，钢制撞子振荡撞击样品的速度10cps，每次2min，循环2次，得到样品粉末，将样品粉末迅速转移至50ml甲醇中，超声处理20分钟，4000r/min离心10分钟，取上清液用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；（2）对照样品溶液的制备：取35种对照品各10mg，分别置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，各配制成1mg
▪
ml
‑1的对照品储备液；分别精密量取各对照品储备液1ml，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含对照品各10μg
▪
ml
‑1的混合溶液，并用甲醇逐步稀释至浓度分别为20、50、100、200、500、1000ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液；所述的对照样品为磷酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸二氧丙嗪、磷酸苯丙哌林、那可丁、盐酸氨溴索、盐酸溴己新、沙丁胺醇、盐酸麻黄碱、硫酸特布他林、盐酸丙卡特罗、盐酸妥洛特罗、盐酸克伦特罗、盐酸班步特罗、盐酸氯丙那林、二羟丙茶碱、多索茶碱、地塞米松、曲安奈德、醋酸可的松、丙酸氯倍他索、丙酸倍氯米松、磺胺甲恶唑、吡哌酸、甲氧苄啶、磺胺嘧啶、氧氟沙星、克拉霉素、罗红霉素、地西泮、硝西泮、马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、富马酸酮替芬、双氯芬酸钠；（3）利用高效液相色谱串联质谱法检测样品中化学成分的非法添加。
6.其中高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱c18，柱长150mm、柱内径3.0mm，填料粒径2.7μm；流动相为0.01mol
▪
l
‑1含0.1%甲酸的乙酸铵水溶液
‑
乙腈；梯度洗脱条件为：0~5min，10%乙腈；5~12min，10%
→
70%乙腈；12~17min，70%
→
100%乙腈；17~20min，100%乙腈；20~22min，100%
→
10%乙腈；22~27min，10%乙腈；柱温35℃，流速0.5ml
▪
min
‑1，进样量1μl。上述高效液相色谱条件可保证对照品及供试品溶液中各成分色谱峰达到良好的分离效果。
7.质谱法的条件为：电喷雾离子源为esi；检测方式为多反应检测；扫描模式为：双氯芬酸钠采用负离子模式，其他化合物采用正离子模式，雾化气压65psi，辅助气压65psi；正离子模式采用喷雾电压5500v，温度550℃；负离子模式采用喷雾电压
‑
4500v，温度450℃。
8.有益效果：本发明提出的一种测定小儿止咳平喘贴剂中非法添加35种化学成分的方法，通过前处理条件中冷冻研磨法，将贴剂中的化学成分可以有效的进行提取，操作简单、提取耗时短、提取率高、化学试剂使用较少；同时采用高效液相色谱串联质谱的方法，以c
18
色谱柱为分析柱，含0.1%甲酸的乙酸铵水溶液
‑
乙腈为流动相，进行梯度洗脱，电喷雾离子源（esi）、多反应监测（mrm）扫描方式，能够将贴剂中的35种非法添加成分进行分离和检测。35种化学成分在相应的测定范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99；方法回收率范围均在80.0%~120.0%（n=9），检测限为0.19~1.60n g
▪
ml
‑1，定量限为0.62~5.35 ng
▪
ml
‑1。检测的8批样品中，1批次检出盐酸苯海拉明，每贴含量为0.8mg。
9.在方法开发中，前处理的选择和流动相体系选择及梯度洗脱的设定对方法的准确性和专属性起着至关重要的作用。建立的35种化合物的测定方法，可快速、准确的测定医疗器械类小儿止咳平喘贴剂中非法添加的化学成分，为打击此类贴剂的制假行为提供了有力的支持。
附图说明
10.图1为磷酸可待因的谱图；图2为氢溴酸右美沙芬的谱图；图3为盐酸二氧丙嗪的谱图；图4为磷酸苯丙哌林的谱图；图5为那可丁的谱图；图6为盐酸氨溴索的谱图；图7为盐酸溴己新的谱图；图8为沙丁胺醇的谱图；图9为麻黄碱的谱图；图10为硫酸特布他林的谱图；图11为盐酸丙卡特罗的谱图；图12为盐酸妥洛特罗的谱图；图13为盐酸克伦特罗的谱图；图14为盐酸班步特罗的谱图；图15为盐酸氯丙那林的谱图；图16为二羟丙茶碱的谱图；
图17为多索茶碱的谱图；图18为地塞米松的谱图；图19为曲安奈德的谱图；图20为醋酸可的松的谱图；图21为丙酸氯倍他索的谱图；图22为丙酸倍氯米松的谱图；图23为磺胺甲恶唑的谱图；图24为吡哌酸的谱图；图25为甲氧苄啶的谱图；图26为磺胺嘧啶的谱图；图27为氧氟沙星的谱图；图28为克拉霉素的谱图；图29为罗红霉素的谱图；图30为地西泮的谱图；图31为硝西泮的谱图；图32为马来酸氯苯那敏的谱图；图33为盐酸苯海拉明的谱图；图34为富马酸酮替芬的谱图；图35为双氯芬酸钠的谱图。
具体实施方式
11.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
12.实施例11.仪器与材料lc
‑
ms液质联用仪：岛津lc
‑
20ad液相，美国ab公司api4000 质谱仪；xse
‑
205du型电子天平：感重0.0001g，瑞士梅特勒
‑
托利多公司；6875a型冷冻研磨仪，美国spex sample prep公司；st16r型离心机，美国赛默飞世尔公司。对照品磷酸可待因（批号：171203
‑
201005，含量：99.6%）、氢溴酸右美沙芬（批号：100201
‑
201204，含量：94.8%）、盐酸二氧丙嗪（批号：100299
‑
201803，批号：99.8%）、磷酸苯丙哌林（批号：100237
‑
201804，含量：99.8%）、那可丁（批号：171224
‑
201605，含量：100.0%）、盐酸氨溴索（批号：100599
‑
201905，含量：99.9%）、盐酸溴己新（批号：100427
‑
201903，含量：99.8%）、沙丁胺醇（批号：100204
‑
201103，含量：99.7%）、麻黄碱（批号：171241
‑
201809，含量：100.0%）、硫酸特布他林（批号：100273
‑
201803，含量：99.8%）、盐酸丙卡特罗（批号：100275
‑
200702，含量：96.7%）、盐酸妥洛特罗（批号：100472
‑
200401，含量：100.0%）、盐酸克伦特罗（批号：100072
‑
201503，含量：90.5%）、盐酸班步特罗（批号：101009
‑
200701，含量：99.7%）、盐酸氯丙那林（批号：100220
‑
201603，含量：99.9%）、二羟丙茶碱（批号：100417
‑
201603，含量：99.9%）、多索茶碱（批号：100625
‑
201202，含量：99.9%）、地塞米松（批号：100129
‑
201907，含量：99.8%）、曲安奈德（批号：
100055
‑
201804，含量：98.8%）、醋酸可的松（批号：100123
‑
201204，含量：99.1%）、丙酸氯倍他索（批号：100302
‑
201804，含量：99.2%）、丙酸倍氯米松（批号：100119
‑
201805，含量：98.8%）、磺胺甲恶唑（批号：100025
‑
201505，含量：99.6%）、吡哌酸（批号：100151
‑
201904，含量：84.3%）、甲氧苄啶（批号：100031
‑
201606，含量：99.8%）、磺胺嘧啶（批号：100026
‑
201404，含量：99.7%）、氧氟沙星（批号：130454
‑
202007，含量：99.7%）、克拉霉素（批号：130558
‑
201904，含量：98.6%）、罗红霉素（批号：130557
‑
201604，含量：96.0%）、地西泮（批号：171225
‑
201304，含量：99.9%）、硝西泮（批号：171217
‑
201403，含量：99.9%）、马来酸氯苯那敏（批号：100047
‑
201507，含量：99.7%）、盐酸苯海拉明（批号：100066
‑
200807，含量：99.9%）、富马酸酮替芬（批号：100230
‑
201904，含量：99.8%）、双氯芬酸钠（批号：100334
‑
201803，含量：100.0%）），均购自中国食品药品检定研究院，8批样品均为市售品，甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，乙酸铵为分析纯。
13.2.方法与结果2.1 液相色谱条件色谱柱c18（150mm
×
3.0mm，sb
‑
aq2.7μm）(美国安捷伦公司)；流动相为0.01mol
▪
l
‑1乙酸铵（含0.1%甲酸）水溶液
‑
乙腈，梯度洗脱0～5min，10%乙腈；5～12min，10%
→
70%乙腈；12～17min，70%
→
100%乙腈；17～20min，100%乙腈；20～22min，100%
→
10%乙腈；22～27min，10%乙腈；柱温35℃，流速0.5ml
▪
min
‑1，进样量1μl。
14.2.2 质谱条件电喷雾离子源(esi)；检测方式为多反应检测(mrm)；扫描模式为正离子模式和负离子模式（双氯芬酸钠采用负离子模式，其他化合物采用正离子模式），雾化气压65psi，辅助气压65psi。正离子模式采用喷雾电压5500v，温度550℃；负离子模式采用喷雾电压
‑
4500v，温度450℃。
15.2.3对照品溶液的制备取35种对照品各约10mg，精密称定，分别置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，各配制成约1mg
▪
ml
‑1的对照品储备液。分别精密量取各对照品储备液1ml，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含对照品各约10μg
▪
ml
‑1的混合溶液，并用甲醇逐步稀释至浓度分别约为20、50、100、200、500、1000ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液。
16.2.4供试品溶液的制备取样品5贴，除去不粘层，置于冷冻研磨管中，在研磨管中加入一个钢制撞子，通入液氮，
‑
196℃下电池驱动钢制撞子振荡撞击样品（速度为10cps，每次2min，循环2次）得到样品粉末，将样品粉末迅速转移至50ml甲醇中，超声处理20分钟，4000r/min离心10分钟，取上清用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。当供试品溶液中化学成分的浓度超出标准曲线线性范围时，用甲醇稀释至线性范围内再进行分析。
17.2.5质谱条件的优化分别将35种对照品储备液(约1mg
▪
ml
‑1)用甲醇稀释成约1μg
▪
ml
‑1的对照溶液，选用esi离子化模式，单针进样，采用一级质谱扫描得到准分子离子峰，再对准分子离子产生的子离子的去簇电压和碰撞电压进行优化，以最高丰度的子离子作为定量离子，次高丰度的子离子作为定性离子。采用多反应监测（mrm）扫描方式对各化学成分的检测离子在最佳去簇电压和碰撞电压的条件下同时扫描。各化学成分质谱参数见表1。
18.表1质谱参数表1质谱参数
ꢀ
注：*为定量离子2.6 方法学考察2.6.1线性关系考察将“2.3”项下系列浓度为20、50、100、200、500、1000ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液，按“2.1”和“2.2”项下的色谱和质谱条件进样测定，以35种化学成分的定量离子对色谱峰峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x，ng
▪
ml
‑1）绘制标准曲线，得线性回归方程，结果见表2。结
果表明，在规定的范围内，浓度与峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99。
19.2.6.2专属性试验将“2.3”项下浓度为200ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件测定，得到对照品mrm色谱图，见图1；取空白样品按照“2.4”项下方法处理并测定，空白样品谱图中未见各化学成分的干扰峰，表明该方法专属性好。
20.2.6.3精密度试验将“2.3”项下浓度为200ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件平行测定6次，结果见表2，各成分峰面积的rsd为0.42%～5.45%（n=6），表明该方法精密度良好。
21.2.6.4重复性试验取空白样品6份，分别精密加入混合对照品溶液适量，使各成分浓度均约为200ng
▪
ml
‑1，按照“2.4”项下方法处理并测定，结果见表2，各组分峰面积rsd为1.73%～6.39%（n=6），表明该方法重复性良好。
22.2.6.5回收率试验取空白样品9份，其中3份为一组，分别加入浓度为100、200、500ng
▪
ml
‑1的混合对照品溶液，按照“2.4”项下方法处理并测定，计算回收率。结果见表2，各组分回收率范围均在80.0%～120.0%之间（n=9），表明加样回收率较好。
23.2.6.6稳定性试验取“2.6.4”项下溶液1份，室温下分别放置0、2、4、8、12h后测定，结果见表2，各组分峰面积的rsd为0.87%～5.31%（n=5），表明稳定性良好。
24.2.6.7检测限和定量限取混合对照品溶液适量，加甲醇逐步稀释后测定，以s/n=3计算各化学成分的检测限，以s/n=10计算各化学成分的定量限，结果见表2。
25.2.7样品测定对市场流通的8批样品进行检测，1批样品中检出盐酸苯海拉明，经计算每贴含量为0.8mg。
26.表235种化学成分方法学试验结果
ꢀ
注：编号1～35与表1相同。
27.3.讨论目前，文献中报道的医疗器械类贴剂处理方式主要有两种，一是裁剪后直接用甲醇或乙醇等提取，此方法提取率较低；二是经乙醚、正己烷等化学试剂处理后再进行提取，此方法操作复杂，化学试剂使用量多；本试验采用冷冻研磨法，将样品快速冷冻后研磨成粉末，可以增大样品与溶剂的接触面积，有利于样品中化学成分的释放，操作简单、提取耗时短、提取率高、化学试剂使用较少。
28.混合对照品各组分母离子和子离子具有专一性，相互间不会造成干扰。通过比较
供试品和对照品溶液中离子色谱峰的保留时间，初步判断供试品溶液中可能含有的化学成分，然后通过提取母离子和特征碎片离子，对含有的化学成分进一步确证。
29.本试验选择的35种化合物，涵盖了镇咳类（磷酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸二氧丙嗪、磷酸苯丙哌林、那可丁）、祛痰类（盐酸氨溴索、盐酸溴己新）、肾上腺素类（沙丁胺醇、盐酸麻黄碱、硫酸特布他林、盐酸丙卡特罗、盐酸妥洛特罗、盐酸克伦特罗、盐酸班步特罗、盐酸氯丙那林）、平喘类（二羟丙茶碱、多索茶碱）、糖皮质激素类（地塞米松、曲安奈德、醋酸可的松、丙酸氯倍他索、丙酸倍氯米松）、抗生素类（磺胺甲恶唑、吡哌酸、甲氧苄啶、磺胺嘧啶、氧氟沙星、克拉霉素、罗红霉素）、镇静催眠类（地西泮、硝西泮）、抗过敏类（马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、富马酸酮替芬）、非甾体抗炎药（双氯芬酸钠）等临床常用药品，因疗效确切，价格较低，易被添加在止咳平喘贴剂中，长期使用会对儿童身体健康产生不利影响。本试验建立的35种化合物的测定方法，可快速、准确的测定医疗器械类小儿止咳平喘贴剂中非法添加的化学成分，为打击此类贴剂的制假行为提供了有力的支持。