对携带HER2外显子21插入的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物的制作方法

对携带her2外显子21插入的癌细胞具有抗肿瘤活性的化合物1.本技术要求2019年3月29日提交的美国临时专利申请号62/826,758的权益，其全部内容被通过引用并入本文。2.背景3.本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号ca190628的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。4.1.领域5.本发明大体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及治疗具有her2外显子21突变的患者的方法。6.2.相关领域的描述7.erb‑b2受体酪氨酸激酶2(erbb2)(也称为人表皮生长因子受体2(her2))扩增发生在许多癌症类型中，且靶向剂例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗美坦新偶联物(t‑dm1)、拉帕替尼和来那替尼已显示与单独的化学疗法相比改善了临床结果(vogel等人，2002年)。已有报告称，erbb2(her2)的激活突变存在于许多癌症类型中(kris等人，2015年)。虽然存在经fda批准的针对携带her2扩增的癌症的靶向疗法，但尚无经批准的专门针对her2突变的靶向疗法。然而，美国国家综合癌症网络的非小细胞肺癌(nsclc)指南建议用广泛的分子表达谱(molecularprofiling)检测新诊断的患者，以检测出her2突变(ettinger等人，2018年)。8.最近针对her2突变性癌症的靶向剂的临床研究集中在共价第二代酪氨酸激酶抑制剂(tki)上，如阿法替尼、来那替尼和达克替尼。summit泛癌研究报告称，对于所有her2突变，接受来那替尼治疗的患者具有低于15％的客观反应率(orr)(hyman等人，2018年)。然而，在多项研究中，当按癌症类型对患者进行分层时，乳腺癌患者具有对单药来那替尼12.5％‑32％的orr(hyman等人，2018年；ma等人，2017年)；而肺癌患者具有对作为单药的来那替尼0％‑4％的反应率(hyman等人，2018年；mazieres等人，2015年)，证明了her2抑制疗效的癌症特异性差异。有趣的是，在单一癌症类型中，her2靶向剂似乎会引发变异特异性差异。在summit试验中，具有her2激酶结构域点突变的患者对来那替尼具有21.4％的orr，而具有外显子20插入的患者对来那替尼具有7.1％的orr(hyman等人，2018年)。此外，对her2突变性nsclc，达克替尼具有11.5％的orr，但在具有her2外显子20插入突变p.y772dupyvma的患者中未出现反应(kris等人，2015年)，而在两项单独的阿法替尼研究中，外显子20插入阳性的nsclc患者对阿法替尼具有18.2％和18.8％的反应率。9.对her2单克隆抗体和药物‑抗体偶联物的研究显示了相似的结果。泛癌研究mypathway在35种不同的肿瘤类型中检测了抗her2单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合的疗效，并对所有her2突变和癌症类型报告了11％的orr。在该研究中，在所纳入的35种肿瘤类型中，只有21％的nsclc患者和1例胆管癌患者有反应。此外，在一项测事试t‑dm1疗效的泛her2突变性nsclc研究中，携带外显子20插入突变的患者具有54.5％的orr，但具有外显子19突变的患者没有部分反应。这些癌症特异性和变异特异性的患者预后差异表明，对于详细、系统地了解不同癌症类型的her2突变情况以及针对所鉴定的各种her2突变找出有效疗法的需求仍未满足。10.her2激活突变的临床前研究也报告了对各种tki的不同敏感性。对her2胞外结构域内的突变的研究表明，这些突变与对非共价抑制剂(如拉帕替尼)的耐药性有关，但对共价tki(包括来那替尼、阿法替尼和奥希替尼)表现出强烈的敏感性，而外显子19内的突变表明对拉帕替尼和共价抑制剂的不同敏感性。此外，研究表明，her2外显子20突变对非共价和共价tki(如奥希替尼、纳扎替尼、诺司替尼和奥莫替尼)具有广泛耐药性。此外，基于共价喹唑啉胺的tki(来那替尼、阿法替尼和达克替尼)对各个her2外显子20突变诱导不同反应。然而，只有不常见的her2突变对临床相关浓度的这些tki表现出敏感性。最近，有报告称，在患者可达到的浓度下，波齐替尼有效抑制了her2外显子20插入突变，且在一名携带her2外显子20突变的患者中，波齐替尼治疗诱导了放射学反应。然而，尚未找到靶向her2突变癌症最常见变体的单一her2tki。11.概述12.本公开的实施方案提供了用于治疗具有her2外显子21突变的患者的癌症的方法和组合物。在一个实施方案中，提供了治疗受试者的癌症的方法，包括对受试者施用有效量的波齐替尼，其中受试者已被确定具有一个或更多个her外显子21突变。在特定方面，受试者为人类。13.在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。14.在某些方面，一个或更多个her2外显子21突变包括氨基酸832‑883之间1‑18个核苷酸的一个或更多个点突变、插入和/或缺失。在一些方面，已确定受试者具有2、3或4个her2外显子21突变。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842、r868和l869组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自v842i、r868w和l869r组成的组。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842和r868组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i和r868w组成的组。15.在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂耐药或已表现出耐药。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、伊布替尼、纳扎替尼或来那替尼。16.在某些方面，可口服施用波齐替尼。在一些方面，以5mg‑25mg例如6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg或25mg的剂量施用波齐替尼。在某些方面，以8mg、12mg或16mg的剂量施用波齐替尼。在一些方面，每日一次施用波齐替尼。在某些方面，连续施用波齐替尼。在一些方面，以28天为周期施用波齐替尼。17.在某些方面，通过分析来自受试者的基因组样品确定受试者具有her2外显子21突变。在一些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在特定方面，通过核酸测序(例如，对肿瘤组织或血浆中的循环游离dna进行dna测序)或pcr分析确定her2外显子21突变的存在。18.在某些方面，该方法还包括施用另外的抗癌疗法。在一些方面，抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或免疫疗法。在某些方面，波齐替尼和/或抗癌疗法通过静脉内、皮下、骨内、口服、透皮、以缓释剂、以控释剂、以延迟释放剂、作为栓剂或舌下给药。在一些方面，施用波齐替尼和/或抗癌疗法包括局部(local)、区域性(regional)或全身施用。在特定方面，施用两次或更多次(例如每天、每隔一天或每周一次)波齐替尼和/或抗癌疗法。19.在一些方面，癌症为口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖道癌、胃肠癌、中枢神经系统组织癌或外周神经系统组织癌、内分泌癌或神经内分泌癌或造血癌、胶质瘤、肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、黑素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆管癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、李美法尼肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺肿瘤、骨肉瘤、多发性神经内分泌肿瘤i型和ii型、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。20.在另一个实施方案中，提供了用于确定有一个或更多个her2外显子21突变的患者的包含波齐替尼的药物组合物。在某些方面，一个或更多个her2外显子21突变包括氨基酸832‑883之间1‑18个核苷酸的点突变、插入和/或缺失。在某些方面，已确定受试者具有2、3或4个her2外显子21突变。21.在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。22.在一些方面，波齐替尼被口服施用。在一些方面，以5mg‑25mg(例如6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg或25mg)的剂量施用波齐替尼。在一些方面，以8mg、12mg或16mg的剂量施用波齐替尼。在某些方面，每日一次施用波齐替尼。在一些方面，连续施用波齐替尼。在一些方面，以28天为周期施用波齐替尼。23.在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂耐药或已表现出耐药。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、依鲁替尼、纳扎替尼或来那替尼。24.在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842、r868和l869组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自v842i、r868w和l869r组成的组。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842和r868组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i和r868w组成的组。在一些方面，患者正在接受抗癌疗法疗法。25.在又一个实施方案中，提供了预测患有癌症的受试者对单独的波齐替尼或波齐替尼与抗癌疗法的组合的反应的方法，其包括检测从所述患者获得的基因组样品中的her2外显子21突变，其中如果样品对her2外显子21突变的存在呈阳性，则预测患者对单独的波齐替尼或波齐替尼与抗癌疗法的组合具有良好反应。在一些方面，基因组样品是从唾液、血液、尿液、正常组织或肿瘤组织中分离的。在某些方面，通过核酸测序或pcr分析确定her2外显子21突变的存在。在某些方面，her2外显子21突变包括氨基酸832‑883之间1‑18个核苷酸的一个或更多个点突变、插入和/或缺失。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842、r868和l869组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i、r868w和l869r组成的组。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842和r868组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i和r868w组成的组。26.在某些方面，对单独的波齐替尼或波齐替尼与抗癌疗法的组合的良好反应包括减少肿瘤尺寸或负荷、阻断肿瘤生长、减少肿瘤相关疼痛、减少癌症相关病理学、减少癌症相关症状、癌症无进展、无病间隔期增加、距进展的时间增加、诱导缓解、减少转移或增加患者存活。在又一方面，对预测具有良好反应的患者施用单独的波齐替尼或波齐替尼与抗癌疗法的组合。27.在一些方面，波齐替尼被进一步确定为波齐替尼盐酸盐。在某些方面，波齐替尼盐酸盐被配制成片剂。28.在一些方面，波齐替尼被口服给药。在一些方面，以5mg‑25mg(例如6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg、24mg或25mg)的剂量施用波齐替尼。在一些方面，以8mg、12mg或16mg的剂量施用波齐替尼。在某些方面，每日一次施用波齐替尼。在一些方面，连续施用波齐替尼。在一些方面，以28天为周期施用波齐替尼。29.在一些方面，受试者对先前施用的酪氨酸激酶抑制剂耐药或已表现出耐药。在某些方面，酪氨酸激酶抑制剂为拉帕替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、伊布替尼、纳扎替尼或来那替尼。30.通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应了解的是，该详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅通过示例给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得明显。31.附图简要说明32.以下附图构成本说明书的一部分并被包括是为了进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。33.图1a‑1j：her2突变出现在多种癌症类型中，突变热点出现在整个受体上。按癌症列出的her2突变(a)和her2外显子20突变(b)频率的加权平均值的条形图。条代表加权平均值±sem。点的尺寸代表每个数据库中的患者人数。guardanthealth报告的通过cfdna检测到的her2突变频率针对odegaard等人2018年报告的临床敏感性进行了归一化。34.图2a‑2h：her2突变热点因癌症类型而异。cbioportal和mdanderson数据库中报告的(a)所有癌症(n＝2338)、(b)肺癌(n＝177)、(c)乳腺癌(n＝143)和(d)结直肠癌(n＝219)中her2突变位置频率的饼图。(e)cbioportal和mdanderson报告的所有癌症(n＝2338个her2突变)中10种最常见her2突变的棒棒糖图。条的长度与突变的频率有关。(e‑h)在cbioportal和mdanderson数据库中，遍布nsclc(f，n＝177)、乳腺癌(g，n＝143)和结直肠癌(h，n＝219)的10种最常见her2突变的棒棒糖图；条的长度与报道的突变频率相关。35.图3a‑3c：酪氨酸激酶结构域中最常见的her2变体是激活突变。表达her2外显子19(a)、her2外显子20(b)和her2外显子21(c)突变的稳定ba/f3细胞系在无il‑3条件下生长14天的细胞成活力。每3天通过celltiterglo测定确定细胞成活力。绘制了各细胞系的平均值±sem(n＝3个生物学独立实验)。36.图4a‑4f：波齐替尼是所检测的ba/f3细胞中her2突变的最有效抑制剂。(a)在graphpad中计算的稳定表达所指示的突变并在药物治疗72小时后的ba/f3细胞的logic50值的热图。通过celltiterglo测定确定细胞成活力(n≥3)。表达her2突变的所有ba/f3细胞系(b)、her2外显子19突变细胞系(c)、her2外显子20突变细胞系(d)或her2外显子21突变细胞系(e)在使用阿法替尼、来那替尼、他索替尼‑tki或波齐替尼进行药物治疗72小时后的平均ic50值。条代表平均值±sem(n≥3)。(c‑e)采用anova与邓恩多重比较检验确定组间的统计学意义。用所指示的抑制剂处理表达l755s或l755p的ba/f3细胞的平均ic50值(f)。点代表平均值±sem(n≥3)。通过配对t检验确定统计学意义。37.图5a‑5d：her2突变体的分子动力学模拟揭示y772dupyvma和l755p突变的药物敏感性降低的可能机制。(a)150ns加速分子动力学模拟期间her2v777l和y772dupyvma外显子20突变体的α‑c‑螺旋位置。(b)her2外显子20突变体呈α‑c‑螺旋“内”构象与α‑c‑螺旋“外”构象的分子动力学快照的群体百分比。(c)v777l和y772dupyvma突变体的分子动力学快照。p‑环和激酶铰链构象有微小差异，但α‑c‑螺旋位置有显著偏移(v777l为“外”位置，y772dupyvma为“内”位置)。(d)l755p和l755sher2突变体的分子动力学快照。l755p突变体缺乏与v790的主链氢键，导致激酶铰链不稳定和p‑环朝结合位点收缩。38.图6a‑6f：表达her2突变的人细胞系对波齐替尼也最敏感。表达外显子20插入突变，her2g776delinsvc(a)、her2y772dupyvma(b)、her2g778dupgsp(c)的mcf10a细胞用所指示的定抑制剂处理72小时的剂量反应曲线。(d)mcf10aher2选择性指数的柱状图。对于每种所指示药物，将突变细胞系的ic50值除以表达her2wt的细胞系的平均ic50值。点代表每种细胞系的平均值±sem，条代表所有三种细胞系的平均值±最小值/最大值(每种细胞系n≥3)。(e)携带her2外显子19突变l755s的cw‑2大肠细胞用所指示抑制剂处理72小时的剂量反应曲线。(a‑c,e)曲线代表平均值±sem，n＝3。(f)第21天时cw‑2肿瘤体积的柱状图。用溶媒对照(n＝5)、30mg/kg来那替尼(n＝5)、20mg/kg阿法替尼(n＝5)或5mg/kg波齐替尼(n＝5)治疗小鼠，5天/周，且随机取虚线表示的350mm3肿瘤。点代表单个肿瘤，条代表平均值±sem。采用单因素anova确定统计学意义。39.图7a‑7d：具有her2突变的nsclc患者对波齐替尼具有42％的确定反应率。(a)临床试验nct03066206中前12个her2外显子20患者的反应的瀑布图。示出了客观部分反应(从左起：第7、8、10、11和12条)，示出了未确定的反应(第9条)，示出了疾病稳定(第3‑6条)，且示出了疾病进展(第1‑2条)。(b)前12例her2外显子20患者的无进展生存期的kaplan‑meier图显示，截至2018年12月，mpfs为5.6个月。(c)具有her2y772dupyvma突变的患者在波齐替尼治疗前1天和治疗后8周的ct扫描。(d)具有her2l755p突变性nsclc的患者在波齐替尼治疗前1天和治疗后4周的pet扫描。患者以前经过铂基化学疗法联合曲妥珠单抗、纳武单抗和抗tdm1治疗并进展，但使用波齐替尼治疗后靶病变减少了12％。40.图8a‑8g：波齐替尼治疗诱导细胞表面的her2蓄积，并且波齐替尼和t‑dm1联合治疗增强了抗肿瘤活性。(a)在10nm波齐替尼处理24小时后，表达her2y772dupyvma、her2g778dupgsp和her2g776delinsvc的mc10a细胞系上her2受体表达的facs分析。条代表平均值±sem，通过学生t检验确定了dmso和波齐替尼处理组之间的显著差异。(b)表达her2y772dupyvma、her2g778dupgsp和her2g776delinsvc的mcf10a细胞系经波齐替尼、t‑dm1或波齐替尼和指定剂量的t‑dm1处理后的ic50值的柱状图。条代表平均值±sem(n＝3个独立实验)，通过单因素anova和事后邓恩多重比较确定了显著差异。(c)用所指示抑制剂治疗的her2y772dupyvmansclcpdx的肿瘤生长曲线。波齐替尼治疗每周施用5天，t‑dm1在治疗开始时施用1次。(d)无进展生存期(pfs)的kaplan‑meier曲线，其中pfs定义为自最佳反应的肿瘤倍增。采用mantel‑cox对数秩检验确定组间的显著差异。在实施安乐死时，对小鼠进行检查。(e)用所指示抑制剂治疗的小鼠在第15天肿瘤体积百分比变化的点图。(f)第15天和第45天各组荷瘤小鼠数量的图表。(g)用所指示抑制剂治疗的her2y772dupyvma小鼠的肿瘤体积蜘蛛图。虚线指示随机化取的点(300mm3)。41.图9a‑9d：在guardant、cbioportal和mdanderson数据库中，外显子20插入突变多样性因癌症类型而异。所有癌症类型，n＝517(a)中her2外显子20插入突变频率的饼图。进一步按癌症类型：(b)肺癌，n＝362，(c)乳腺癌，n＝30，(d)其他癌症，n＝125分析了外显子20插入突变的频率。42.图10a‑10b：常见的her2突变是组成型磷酸化，且p‑her2表达与药物敏感性无关。(a)通过采用elisa法确定的p‑her2与总her2的比值确定相对p‑her2表达。条代表平均值±sem，且n＝3。nd＝低于检测限。(b)针对ba/f3her2突变细胞系，绘制了相对her2与波齐替尼ic50值的相关性。pearson相关性和p值通过graphpadprism(n＝3)确定。43.图11a‑11b：分子建模显示her2突变体的结合口袋尺寸不同。(a)her2激酶结构域外显子19、20和21蛋白骨架分别呈蓝色、粉红色和橙色。模板x射线结构(pdb3pp0)中的配体呈绿色棒状，并提供了突变残基/插入位置的标记。(b)来自加速分子动力学模拟的her2突变体的结合口袋体积的曲线。44.图12：波齐替尼抑制her2突变细胞系中的p‑her2。使用所指示药物和剂量治疗2小时后，表达g776delinsvc的mcf10a细胞的蛋白质印迹。45.图13：波齐替尼抑制外显子19突变结肠直肠癌异种移植物的肿瘤生长。将携带her2l755s突变的cw‑2细胞注射到6周龄雌性nu/nu裸鼠的侧腹。当肿瘤达到350mm3时，将小鼠随机分配到4个组：20mg/kg阿法替尼、5mg/kg波齐替尼、30mg/kg来那替尼或溶媒对照。每周测量三次肿瘤体积，小鼠在周一至周五(每周5天)接受药物。符号代表每个时间点的平均值±sem。采用双因素anova和tukey多重比较检验确定统计显著性。星号指示溶媒与波齐替尼或来那替尼之间的显著差异。从首次检测到显著差异的第10天开始，在其下方列出了每次比较的p值。46.示例性实施方案的描述47.本研究确定了各种恶性肿瘤中her2突变的最常见基因组变体的频率。系统地证明了16种最常见her2突变的激活潜能，并评估了它们对11种常用egfr和her2tki的药物敏感性。发现外显子20的插入突变和外显子19的p.l755p(而不是p.l755s)突变是许多测试的tki难治的。对耐药性her2变体，l755p和外显子20插入的分子动力学建模表明，这些突变影响受体的构象状态，减小了药物结合口袋的整体尺寸。此外，将波齐替尼鉴定为所有评估的her2突变的强效抑制剂。而且，本研究表明，波齐替尼在携带最具耐药性her2变体，外显子20插入、外显子21突变和l755p的nsclc患者中具有临床活性。最后，这些研究表明，波齐替尼介导的细胞表面受体聚集增强了t‑dm1活性，t‑dm1活性可利来提高体内抗肿瘤活性，导致her2突变性nsclc的pdx模型中肿瘤的完全消退。48.因此，本公开的某些实施方案提供了治疗具有her2外显子21突变的癌症患者的方法。特别是，本方法包括对确定具有her外显子21突变的患者施用波齐替尼(也称为hm781‑36b)或阿法替尼。波齐替尼的尺寸和柔性克服了空间位阻，在纳摩尔低浓度下抑制her2外显子21突变体。因此，波齐替尼或阿法替尼以及结构相似的抑制剂是强效her2抑制剂，可用于靶向对不可逆的第2代和第3代tki耐药的her2外显子21插入。49.i.定义50.如本说明书所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或更多个/种。如权利要求中所用，当与词“包括”一起使用时，词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可表示一个/种或一个/种以上。51.权利要求中使用术语“或”来意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个/另一种(another)”可以意指至少第二个/第二种或更多个/更多种。52.术语“约”是指规定值±5％。[0053]“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者中的该疾病(例如，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，(2)改善经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病(例如，逆转病理学和/或症状学)，和/或(3)实现经历或表现出疾病的病理学或症状学的受试者或患者的该疾病的任何可测量减少。例如，治疗可包括施用有效量的波齐替尼或阿法替尼。[0054]“预防性治疗”包括：(1)降低或减轻可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未经历或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中发生该疾病的风险，和/或(2)减缓可能处于疾病的风险和/或易患疾病但尚未出现或表现出该疾病的任何或所有病理学或症状学的受试者或患者中该疾病的病理学或症状学的发作。[0055]如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人类、猴、牛、绵羊、山羊、犬、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，患者或受试者为灵长类动物。人类患者的非限制性实例为成人、青少年、婴儿和胎儿。[0056]如在本说明书和/或权利要求中使用的术语，术语“有效”是指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的情况下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药物有效量”是指当对受试者或患者施用化合物以治疗或预防疾病时，足以实现对疾病的此类治疗或预防的化合物的量。[0057]如本文所用，术语“ic50”指的是所获得的最大反应的抑制剂量的50％。这种定量测量指示，需要多少特定药物或其他物质(抑制剂)才能将给定的生物、生化或化学过程(或过程的成分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半。[0058]例如，通过促进杀伤癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应，促进对癌细胞或肿瘤的免疫反应、预防或抑制癌症进展或增加具有癌症的受试者的寿命，“抗癌”药能够对受试者的癌细胞/肿瘤产生不利影响。[0059]术语“插入”或“插入突变”是指向dna序列中加入一个或更多个核苷酸碱基对。例如，her2外显子21插入突变包括氨基酸832‑883之间1‑18个核苷酸的一种或更多种插入。[0060]“杂交(hybridize)”或“杂交(hybridization)”是指核酸之间的结合。杂交条件可根据待结合核酸的序列同源性而变化。因此，如果受试核酸之间的序列同源性高，则使用严格条件。如果序列同源性较低，则使用温和条件。当杂交条件严格时，杂交特异性增加，并且这种杂交特异性的增加导致非特异性杂交产物的产量降低。然而，在温和的杂交条件下，杂交特异性降低，并且这种杂交特异性的降低导致非特异性杂交产物的产量增加。[0061]“探针(probe)”或“探针(probes)”是指长度为至少八(8)个核苷酸并且由于探针中至少一条序列与靶区域中序列的互补性而与靶序列形成杂交体结构的多核苷酸。多核苷酸可包括dna和/或rna。在某些实施方案中，探针被可检测地标记。探针的尺寸可以有很大差异。通常，探针的长度为例如至少8‑15个核苷酸。其他探针的长度为例如至少20、30或40个核苷酸。还有一些探针稍微更长一些，例如长度为至少50、60、70、80或90个核苷酸。探针也可以具有落入前述范围内的任何具体长度。优选地，探针不含有与用于在聚合酶链式反应期间引发靶序列的序列互补的序列。[0062]“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物，其可以是未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。[0063]“修饰的核糖核苷酸”或脱氧核糖核苷酸是指，可用于代替核酸中天然存在的碱基的分子，包括但不限于修饰的嘌呤和嘧啶，稀有碱基，可转换(convertible)核苷，嘌呤和嘧啶的结构类似物，标记的、衍生的和修饰的核苷和核苷酸，共轭核苷和核苷酸，序列修饰物，末端修饰物，间隔子修饰物，以及具有主链修饰的核苷酸，所述主链修饰包括但不限于核糖修饰的核苷酸、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯、亚磷酰胺(phosphonamidite)、甲基膦酸酯、甲基亚磷酰胺(methylphosphoramidite)、甲基亚膦酰胺(methylphosphonamidite)、5'‑β‑氰乙基亚磷酰胺(5’‑β‑cyanoethylphosphoramidite)、亚甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、肽核酸、非手性和中性核苷酸间键(internucleotidiclinkage)。[0064]“变体”是指分别相对于野生型或受试者群体中最普遍的形式，因一个或多个核苷酸或氨基酸的交换、缺失或插入而不同的多核苷酸或多肽。交换、缺失或插入的核苷酸或氨基酸的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多，例如25、30、35、40、45或50个。[0065]“引物”或“引物序列”是指与靶核酸序列(例如，要扩增的dna模板)杂交以引发核酸合成反应的寡核苷酸。引物可以是dna寡核苷酸、rna寡核苷酸或嵌合序列。引物可以含有天然、合成或修饰的核苷酸。引物长度的上限和下限都是凭经验确定的。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交后形成稳定双链体所需的最小长度。在这种杂交条件下，非常短的引物(长度通常少于3‑4个核苷酸)不会与靶核酸形成热力学稳定的双链体。上限通常由在靶核酸中预定核酸序列以外的区域中形成双链体的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约10至约40个核苷酸长的范围内。在某些实施方案中，例如，引物的长度可以为10‑40、15‑30或10‑20个核苷酸长。当置于适当条件下时，引物能够在多核苷酸序列上作为合成起始点。[0066]“检测(detection)”、“可检测的(detectable)”及其语法等效物是指确定靶核酸序列的存在和/或数量和/或身份的方式。在一些实施方案中，检测发生在扩增靶核酸序列时。在其他实施方案中，靶核酸的测序可以表征为“检测”该靶核酸。连接于探针的标记可以包括可通过例如化学或物理方式检测的本领域已知的多种不同标记中的任一种。可以连接于探针的标记可以包括例如荧光材料和发光材料。[0067]“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”及其语法等同体是指以依赖模板的方式复制靶核酸序列的至少一部分的任何方法，包括但不限于，用于以线性或指数方式扩增核酸序列的大量技术。用于进行扩增步骤的示例性手段包括，连接酶链式反应(lcr)、连接酶检测反应(ldr)、连接后q‑复制酶扩增、pcr、引物延伸、链置换扩增(sda)、超支化(hyperbranched)链置换扩增、多重置换扩增(mda)、核酸链基扩增(nasba)、两步多重扩增(two‑stepmultiplexedamplification)、滚环扩增(rca)、重组酶‑聚合酶扩增(rpa)(twistdx,cambridg,uk)和自持序列复制(3sr)，包括其多重化形式或组合，例如但不限于ola/pcr、pcr/ola、ldr/pcr、pcr/pcr/ldr、pcr/ldr、lcr/pcr、pcr/lcr(也称为组合链式反应‑ccr)等。此类技术的描述尤其可见于sambrooketal.molecularcloning,3rdedition(分子克隆，第三版)。[0068]本文通常使用的“药学上可接受的”是指，在合理医学判断范围内、适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，但没有过度毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相称的其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型。[0069]“药学上可接受的盐”是指，如上所定义的药学上可接受的并且具有所需的药理学活性的本发明化合物的盐。此类盐的非限制性实例包括与无机酸或与有机酸形成的酸加成盐，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸；有机酸例如1,2‑乙二磺酸、2‑羟基乙磺酸、2‑萘磺酸、3‑苯基丙酸、4,4'‑亚甲基双(3‑羟基‑2‑烯‑1‑羧酸)、4‑甲基双环[2.2.2]辛‑2‑烯‑1‑羧酸、乙酸、脂肪族一元和二元羧酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、十二烷基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻‑(4‑羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、四丁基乙酸和三甲基乙酸。药学上可接受的盐还包括，当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱的非限制性实例包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇和n‑甲基葡糖胺。应当认识到，构成本发明任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不是关键的，只要盐作为一个整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其他实例及其制备和使用方法提供于handbookofpharmaceuticalsalts:properties,anduse(药用盐手册：性质和使用)(p.h.stahl&c.g.wermutheds.,verlaghelveticachimicaacta,2002)。[0070]ii.her2外显子21突变[0071]本公开的某些实施方案涉及确定受试者是否具有一个或更多个her2外显子21突变，特别是图2所示的一种或更多种插入突变。受试者可能有2、3、4或更多个her2外显子21突变。突变检测方法是本领域已知的，其包括pcr分析和核酸测序以及fish和cgh。在特定方面，通过dna测序检测外显子21突变，例如从肿瘤或来自血浆的循环游离dna检测。[0072]her2外显子21突变可包括氨基酸832‑883之间1‑18个核苷酸的一个或更多个点突变、插入和/或缺失。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842、r868和l869组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i、r868w和l869r组成的组。在一些方面，一个或更多个her2外显子21突变位于选自由v842和r868组成的组的一个或更多个残基处。在一些方面，一个或更多个外显子21突变选自由v842i和r868w组成的组。[0073]在某些方面，受试者可能在egfr残基c797处具有或发展突变，这可能导致对tki(例如波齐替尼)的耐药性。因此，在某些方面，确定受试者在egfrc797和/或t790处无突变(例如c797s和/或t790m)。在一些方面，可对具有t790突变(例如t790m)的受试者施用奥希替尼，并且可对具有c797突变(例如c797s)的受试者施用化学疗法和/或放射疗法。[0074]患者样品可以是包括来自受试者肺癌的核酸的任何身体组织或体液。[0075]在某些实施方案中，样品将是包含循环肿瘤细胞或细胞游离dna的血液样品。在其他实施方案中，样品可以是组织，例如肺组织。肺组织可以来自肿瘤组织，并且可以是新鲜冷冻的或福尔马林固定石蜡包埋的(ffpe)。[0076]在某些实施方案中，获得肺肿瘤ffpe样本。[0077]适用于本文所述方法的样品含有遗传材料，例如基因组dna(gdna)。基因组dna通常从生物样品中提取，例如血液或口腔内壁的黏膜刮屑(scraping)，但也可以从其他生物样品中提取，包括尿液、肿瘤或咳吐物(expectorant)。样品本身通常包括有核细胞(例如血液细胞或口腔细胞)或从受试者取出的组织，包括正常组织或肿瘤组织。用于获得、处理和分析样品的方法和试剂是本领域已知的。在一些实施方案中，在例如抽血的医疗保健提供者的帮助下获得样品。在一些实施方案中，在没有医疗保健提供者的帮助下获得样品，例如，在非侵入性获得样品的情况下，例如使用口腔拭子或刷子获得的、包含口腔细胞的样品，或漱口水样品。[0078]在某些情况下，可以处理生物样品以进行dna分离。例如，可以将细胞样品或组织样品中的dna与样品的其他组分分离。可以使用本领域已知的标准技术从生物样品中收获细胞。例如，可以通过离心细胞样品并重悬浮沉淀的细胞来收获细胞。可以将细胞重悬浮于缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。在离心细胞悬浮液以获得细胞团块后,可以裂解细胞以提取dna，例如gdna。参见，例如ausubeletal.(2003)。可以浓缩和/或纯化样品以分离dna。从受试者获得的所有样品，包括那些经过任何类型的进一步处理的样品，都视为是从受试者获得的。可使用常规方法从生物样品中提取基因组dna，包括例如苯酚提取。或者可以使用诸如组织试剂盒(qiagen,chatsworth,calif.)和基因组dna纯化试剂盒(promega)等试剂盒提取基因组dna。样品来源的非限制性例子包括尿液、血液和组织。[0079]可以使用本领域已知的方法确定本文所述her2外显子21突变是否存在。例如，凝胶电泳、毛细管电泳、尺寸排阻层析、测序和/或阵列可用于检测插入突变的存在或不存在。在需要时，可以使用本领域已知的方法，例如pcr，来完成核酸的扩增。在一个实例中，从受试者获得样品(例如，包含基因组dna的样品)。然后检查样品中的dna，以确定本文所述插入突变的身份。可以通过本文所述的任何方法，例如通过测序，或通过将基因组dna、rna或cdna中的基因与核酸探针例如dna探针(其包括cdna和寡核苷酸探针)或rna探针杂交，检测插入突变。可以将核酸探针设计为与具体变体特异性杂交或优先杂交。[0080]一组探针通常是指一组用于检测本公开的可操作治疗建议中使用的靶遗传变异(例如，her2外显子21突变)的引物，通常是引物对，和/或可检测地标记的探针。在扩增反应中使用引物对来界定跨越每个上述基因的靶遗传变异的扩增子。由一组匹配的探针检测该组扩增子。在示例性实施方案中，本发明的方法可以使用用于检测一组靶遗传变异诸如her2外显子21突变的taqmantm(rochemolecularsystems,pleasanton,calif.)测定。在一个实施方案中，该组探针是用于生成扩增子的一组引物，该扩增子通过诸如下一代测序反应等核酸测序反应检测。在这些实施方案中，例如，可以采用ampliseqtm(lifetechnologies/iontorrent,carlsbad,calif.)或truseqtm(illumina,sandiego,calif.)技术。[0081]对核酸标志物的分析可以使用本领域已知的技术来进行，包括但不限于序列分析和电泳分析。序列分析的非限制性实例包括maxam‑gilbert测序、sanger测序、毛细管阵列dna测序、热循环测序(searsetal.,1992)、固相测序(zimmermanetal.,1992)、质谱测序例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi‑tof/ms；fuetal.,1998)和杂交测序(cheeetal.,1996；drmanacetal.,1993；drmanacetal.,1998)。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。此外，可以使用来自公司例如lifetechnologies/iontorrentpgm或proton、illuminahiseq或miseq以及roche/454下一代测序系统的市售试剂盒和仪器进行下一代测序方法。[0082]其他核酸分析方法可以包括直接手动测序(churchandgilbert,1988；sangeretal.,1977；美国专利第5,288,644号)；自动荧光测序；单链构象多态性分析(sscp)(schaferetal.,1995)；钳夹变性凝胶电泳(cdge)；二维凝胶电泳(2dge或tdge)；构象敏感凝胶电泳(csge)；变性梯度凝胶电泳(dgge)(sheffieldetal.,1989)；变性高效液相色谱(dhplc,underhilletal.，1997)；红外基质辅助激光解吸/电离(ir‑maldi)质谱(wo99/57318)；迁移率变化分析(oritaetal.,1989)；限制酶分析(flavelletal.,1978；geeveretal.,1981)；实时定量pcr(racaetal.,2004)；异源双链分析；化学错配切割(cmc)(cottonetal.,1985)；rna酶保护测定(myersetal.,1985)；使用识别核苷酸错配的多肽，例如大肠杆菌(e.coli)的muts蛋白；等位基因特异性pcr，以及这些方法的组合。参见，例如，美国专利公开第2004/0014095号，其全部内容通过引用并入本文。[0083]在一个实例中，鉴定样品中her2突变的方法包括，使来自所述样品的核酸与能够与编码突变her2蛋白或其包含突变的片段的核酸特异性杂交的核酸探针接触，和检测所述杂交。在具体实施方案中，所述探针用例如放射性同位素(3h、32p或33p)、荧光剂(若丹明或荧光素)或显色剂可检测地标记。在具体实施方案中，探针是反义寡聚体，例如pna、吗啉代‑氨基磷酸酯、lna或2'‑烷氧基烷氧基。探针可以为约8个核苷酸至约100个核苷酸，或约10至约75个、或约15至约50个、或约20至约30个核苷酸。在另一方面，将本公开的所述探针提供在试剂盒中，用于鉴定样品中的her2突变，所述试剂盒包括与her2基因中的突变位点特异性杂交或邻近该位点杂交的寡核苷酸。该试剂盒还可以包括基于使用该试剂盒的杂交测试结果，使用波齐替尼或阿法替尼治疗患有含有her2插入突变的肿瘤的患者的说明书。[0084]另一方面，检测样品中外显子21突变的方法包括，从所述样品扩增对应于所述her2基因的外显子21或其疑似含有突变的片段的核酸，并将扩增的核酸的电泳迁移率与相应野生型her2基因或其片段的电泳迁移率进行比较。迁移率的差异指示扩增的核酸序列中存在突变。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测定电泳迁移率。[0085]或者，可以使用酶促突变检测(emd)(deltitoetal.,1998)分析核酸以检测突变。emd使用噬菌体解离酶t4内切核酸酶vii，该酶沿着双链dna进行扫描，直到它检测并切割由点突变、插入和缺失导致的碱基对错配引起的结构扭曲。例如通过凝胶电泳检测通过解离酶切割形成的两个短片段，指示存在突变。emd方法的优点是，使用单一方案来鉴别直接从pcr反应测定的点突变、缺失和插入，消除了对样品纯化的需要，从而缩短杂交时间并提高信噪比。可以分析含有高达20倍过量的正常dna和尺寸高达4kb的片段的混合样品。然而，emd扫描不能鉴定突变阳性样品中发生的具体碱基变化，如有必要，需要另外的测序程序来鉴定该突变。如美国专利第5,869,245号所证明的，可以使用类似于解离酶t4内切核酸酶vii的celi酶。[0086]iii.治疗方法[0087]本文还提供了用于治疗或延缓个体中癌症进展的方法，其包括向确定具有her2外显子21突变(例如外显子21插入)的受试者施用有效量的波齐替尼、阿法替尼或结构类似的抑制剂。受试者可能具有一个以上的her外显子21突变。[0088]考虑待被治疗的癌症的实例包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、肺肿瘤前病变、结肠癌、黑素瘤和膀胱癌。在特定方面，癌症是非小细胞肺癌。[0089]在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人类(例如，患本文所述病症或处于患本文所述病症的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者需要增强免疫反应。在某些实施方案中，受试者是免疫功能受损的，或处于免疫功能受损的风险。例如，受试者正在接受或已经接受化疗治疗和/或放射疗法。或者，或组合地，受试者由于感染而导致免疫功能受损或处于免疫功能受损的风险。[0090]某些实施方案涉及确定对具有her2外显子21突变的受试者施用波齐替尼(也称为hm781‑36b、hm781‑36和1‑[4‑[4‑[(3,4‑二氯‑2‑氟苯氨基)‑7‑甲氧基喹唑啉‑6‑基]‑氧基哌啶‑1‑基]丙‑2‑烯‑1‑酮。波齐替尼是一种基于喹唑啉的泛her抑制剂，其不可逆地阻断通过her家族的酪氨酸激酶受体(包括her1、her2和her4)的信号传递。波齐替尼或结构类似的化合物(例如，美国专利号8,188,102和美国专利公开号20130071452；通过引用并入本文)可以用于本方法中。[0091]波齐替尼，如波齐替尼盐酸盐，可以例如以片剂形式口服施用。波齐替尼可以以4mg‑25mg的剂量，例如以5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、21mg、22mg、23mg或24mg的剂量施用。可以每天、每隔一天、每3天或每周一次施用。可以按连续时间表，如28天为一个周期给药。[0092]在一些方面，可对具有t790突变(例如t790m)的受试者施用奥希替尼，并且可对具有c797突变(例如c797s)的受试者施用如本文所述化学疗法和/或放射疗法。可以单独或联合波齐替尼施用奥希替尼、化学疗法和/或放射疗法。可以以25mg至100mg，例如约40mg或80mg的剂量施用奥希替尼。可以每天、每隔一天、每2天、每3天或每周一次给药。奥希替尼可以例如以片剂形式口服施用。[0093]可以以10mg‑50mg，例如10mg、20mg、30mg、40mg或50mg的剂量施用阿法替尼。可以每天、每隔一天、每2天、每3天或每周一次施用阿法替尼。可以口服阿法替尼，例如以片剂形式。[0094]a.药物组合物[0095]本文还提供了用于确定具有her2外显子21突变(例如外显子21插入)的受试者的药物组合物和制剂，其包括波齐替尼或阿法替尼和药学上可接受的载体。[0096]可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(remington'spharmaceuticalsciences22ndedition(雷明顿药物学，第22版),2012)混合来制备冻干制剂或水溶液形式的本文所述药物组合物和制剂。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3‑戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属配合物(例如锌‑蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如可溶性人ph‑20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxterinternational,inc.)。某些示例性shasegp(包括rhuph20)和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。[0097]b.联合疗法[0098]在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的波齐替尼或阿法替尼。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、dna疗法、病毒疗法、rna疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述疗法的组合。另外的疗法可以为辅助疗法或新辅助疗法的形式。[0099]在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如止吐剂等)。在一些实施例中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法与手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向pbk/akt/mtor途径、hsp90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。[0100]相对于另外的癌症疗法，例如免疫检查点疗法，可以在各种组合之前、期间、之后或以各种组合施用波齐替尼或阿法替尼。施用间隔可以从同时到几分钟到几天到几周。在将波齐替尼或阿法替尼与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得这两种化合物仍能够对患者产生有利的联合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相隔约12‑24或72小时内，更具体而言，彼此相隔约6‑12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，如果各自施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)到几周(1、2、3、4、5、6、7、或8)，可能需要显著延长治疗时间。[0101]可以采用各种组合。对于下文的实例而言，波齐替尼或阿法替尼为“a”，抗癌疗法为“b”：[0102]a/b/ab/a/bb/b/aa/a/ba/b/bb/a/aa/b/b/bb/a/b/bb/b/b/ab/b/a/ba/a/b/ba/b/a/ba/b/b/ab/b/a/ab/a/b/ab/a/a/ba/a/a/bb/a/a/aa/b/a/aa/a/b/a。[0103]考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何化合物或疗法施用至患者应当遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。[0104]1.化学疗法[0105]根据本发明的实施方案，可以使用各种各样的化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式来分类，例如，它们是否以及在哪个阶段影响细胞周期。或者，药剂可基于其直接交联dna、嵌入dna或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。[0106]化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌、美托替呢(meturedopa)和瑞多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利司他丁(callystatin)；cc‑1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(包括合成类似物kw‑2189和cb1‑tm1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱；肉球菌素(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔抗生素类(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γli和卡奇霉素ωi1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；双膦酸盐，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星、6‑重氮‑5‑氧代‑l‑正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代‑阿霉素、氰基吗啉代‑阿霉素、2‑吡咯并‑阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素c、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链霉黑素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5‑氟尿嘧啶(5‑fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6‑巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6‑氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺素，例如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如弗林酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶、阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；亚丝醌；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登素类，例如美登木素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫达醇(mopidanmol)；二胺硝呢(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2‑乙基酰肼；甲基苄肼；psk多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”‑三氯三乙胺；单端孢霉烯毒素(尤其是t‑2毒素、犹孢菌素a(verracurina)、漆斑菌素a和蛇形菌素(anguidine))；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；伽胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“ara‑c”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛、吉西他滨；6‑硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位化合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp‑16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，cpt‑11)；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇类，例如视黄酸；卡培他滨；卡铂、甲基苄肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维苯(navelbine)、法呢基‑蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和任何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。[0107]2.放射疗法[0108]导致dna损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ射线、x射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的dna损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利第5,760,395号和第4,870,287号)和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对dna、对dna前体、对dna复制和修复以及对染色体的组装和维持产生广泛的损伤。x射线的剂量范围从每天50‑200伦琴的长时间(3‑4周)剂量到2000‑6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期、发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。[0109]3.免疫疗法[0110]本领域技术人员应当理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于免疫效应细胞以及靶向和破坏癌细胞的分子的使用。利妥昔单抗就是这样实例。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以作为治疗的效应物，或者它可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白a链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性t细胞和nk细胞。[0111]抗体‑药物缀合物已成为开发癌症治疗剂的突破性方法。癌症是世界上导致死亡的主要原因之一。抗体药物缀合物(adc)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(mab)。这种方法将mab对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相结合，从而产生将有效载荷(药物)递送至具有富集水平的抗原的肿瘤细胞的“武装的”mab。药物的靶向递送也最大限度地减少了其在正常组织中的暴露，从而降低了毒性并提高了治疗指数。fda批准的两种adc药物，即2011年批准的(维布妥昔单抗(brentuximabvedotin))和2013年批准的(曲妥珠单抗美坦新偶联物(trastuzumabemtansine)或t‑dm1)验证了该方法。目前有30多种adc候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(lealetal.,2014)。随着抗体工程和接头‑有效载荷(linker‑payload)优化越来越成熟，新adc的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向mab的生成。adc靶标的两个标准是在肿瘤细胞中的表达上调/高水平和稳健的内化。[0112]在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带适合靶向，即不存在于大多数其他细胞上的某标志物。存在许多肿瘤标志物，并且在本实施方案的背景中，这些标志物中的任何一种都可能适合被靶向。常见的肿瘤标志物包括cd20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、tag‑72、hmfg、唾液酸化路易斯抗原(sialyllewisantigen)、muca、mucb、plap、层黏连蛋白受体、erbb和p155。免疫疗法的另一方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如il‑2、il‑4、il‑12、gm‑csf、γ‑ifn、趋化因子,例如mip‑1、mcp‑1、il‑8，以及生长因子,例如flt3配体。[0113]免疫疗法的实例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利第5,801,005号和第5,739,169号；huiandhashimoto,1998；christodoulidesetal.,1998)、细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ，il‑1、gm‑csf和tnf(bukowskietal.,1998；davidsonetal.,1998；hellstrandetal.,1998)；基因疗法，例如tnf、il‑1、il‑2和p53(qinetal.,1998；austin‑ward和villaseca,1998；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)；以及单克隆抗体，例如抗cd20、抗神经节苷脂gm2和抗p185(hollander,2012；hanibuchietal.,1998；美国专利第5,824,311号)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。[0114]在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么调高信号(例如，共刺激分子)要么降低信号。免疫检查点阻断可以靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷a2a受体(a2ar)、b7‑h3(也称为cd276)、b和t淋巴细胞衰减子(btla)、细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla‑4，也称为cd152)、吲哚胺2,3‑双加氧酶(ido)、杀伤细胞免疫球蛋白(kir)、淋巴细胞活化基因3(lag3)、程序性死亡因子1(pd‑1)、t细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(tim‑3)和t细胞激活抑制物igv结构域(vista)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向pd‑1轴和/或ctla‑4。[0115]免疫检查点抑制剂可以是药物例如小分子、配体或受体的重组形式，或者特别地是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开wo2015016718；pardoll,natrevcancer,12(4):252‑64,2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合、人源化或人源形式的抗体。如技术人员应当知道的，本公开中提及的某些抗体可使用替代名称和/或等效名称。在本发明的上下文中，这类替代和/或等效名称是可互换的。例如，众所周知，帕博利珠单抗(lambrolizumab)也以替代和等效名称mk‑3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。[0116]在一些实施方案中，pd‑1结合拮抗剂是抑制pd‑1与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，pd‑1配体结合配偶体是pdl1和/或pdl2。在另一个实施方案中，pdl1结合拮抗剂是抑制pdl1与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，pdl1结合配偶体是pd‑1和/或b7‑1。在另一个实施方案中，pdl2结合拮抗剂是抑制pdl2与其结合配偶体结合的分子。在具体方面，pdl2结合配偶体是pd‑1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中，上述专利均通过引用并入本文。用于本文提供的方法中的其他pd‑1轴拮抗剂是本领域已知的，例如美国专利公开号us20140294898、us2014022021和us20110008369中描述的，上述专利公开均通过引用并入本文。[0117]在一些实施方案中，pd‑1结合拮抗剂是抗pd‑1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗pd‑1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和ct‑011。在一些实施方案中，pd‑1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含pdl1或pdl2的融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的fc区)的细胞外部分或pd‑1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，pd‑1结合拮抗剂是amp‑224。纳武单抗，也称为mdx‑1106‑04、mdx‑1106、ono‑4538、bms‑936558和是描述于wo2006/121168中的抗pd‑1抗体。派姆单抗，也称为mk‑3475、merck3475、帕博利珠单抗、和sch‑900475，是描述于wo2009/114335中的抗pd‑1抗体。ct‑011，也称为hbat或hbat‑1，是描述于wo2009/101611中的抗pd‑1抗体。amp‑224，也称为b7‑dcig，是描述于wo2010/027827和wo2011/066342中的pdl2‑fc融合可溶性受体。[0118]可以在本文提供的方法中靶向的另一免疫检查点是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla‑4)，也称为cd152。人ctla‑4的完整cdna序列的genbank登录号为l15006。ctla‑4存在于t细胞表面，且当与抗原呈递细胞表面的cd80或cd86结合时充当“关闭”开关。ctla4是在辅助性t细胞表面表达并向t细胞传递抑制信号的免疫球蛋白超家族成员。ctla4类似于t细胞共刺激蛋白cd28，且这两种分子都与抗原呈递细胞上的cd80和cd86(也分别称为b7‑1和b7‑2)结合。ctla4向t细胞传递抑制信号，而cd28则传递刺激信号。细胞内ctla4也存在于调节性t细胞中，且可能对其功能很重要。通过t细胞受体和cd28激活t细胞会导致ctla‑4即b7分子的抑制性受体的表达增加。[0119]在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla‑4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。[0120]可以使用本领域公知的方法生成适用于本发明方法的抗人ctla‑4抗体(或从其衍生的vh和/或vl结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗ctla‑4抗体。例如，本文公开的方法可以使用以下公开的抗ctla‑4抗体：美国专利第8,119,129号；国际专利公开号wo01/14424、wo98/42752和wo00/37504(cp675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))；美国专利第6,207,156号；hurwitzetal.,1998；camachoetal.,2004；以及mokyretal.,1998。每一前述出版物的教导均在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合ctla‑4的抗体。例如，人源化ctla‑4抗体描述于国际专利申请号wo2001014424和wo2000037504以及美国专利第8,017,114号中；其全部通过引用并入本文。[0121]示例性抗ctla‑4抗体是伊匹单抗(也称为10d1、mdx‑010、mdx‑101和)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，wo01/14424)。在其他实施方案中，该抗体包含伊匹单抗的重链和轻链cdr或vr。因此，在一个实施方案中，该抗体包含伊匹单抗vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域以及伊匹单抗vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争结合ctla‑4上的相同表位。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。[0122]用于调节ctla‑4的其他分子包括：ctla‑4配体和受体(例如美国专利号5,844,905、5,885,796和国际专利申请号wo1995001994和wo1998042752中描述的，其全部通过引用并入本文)和免疫黏附素(例如美国专利号8,329,867中描述的，其通过引用并入本文)。[0123]4.手术[0124]大约60％的癌症患者会接受某些类型的手术，这包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌性组织被物理去除、切除和/或破坏并且可以与其他疗法结合使用，例如本发明实施方式的疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理切除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和通过显微镜控制的手术(莫氏手术(mohs’surgery))。[0125]在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或其他抗癌疗法的局部区域应用来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同的剂量。[0126]5.其他剂[0127]预期其他剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的疗效。这些另外的剂包括影响细胞表面受体和细胞间隙连接(gapjunction)的上调的剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的剂或其他生物剂。通过提高细胞间隙连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑了细胞黏附抑制剂来提高本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(fak)抑制剂和洛伐他汀。还预期，增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他剂，例如抗体c225，可以与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗功效。[0128]iv.试剂盒[0129]用于检测her2外显子21突变(例如本文公开的那些突变)的试剂盒也在本公开的范围内。这种试剂盒的实例可以包括一组外显子21突变特异性引物。该试剂盒还可以包括使用引物检测本文所述具体her2外显子21突变的存在或不存在的说明书。该试剂盒还可以包括用于诊断目的的说明书，其指出在来自癌症患者的样品中对本文所述her2外显子21突变的阳性鉴定表明对酪氨酸激酶抑制剂波齐替尼或阿法替尼或结构相似的抑制剂的敏感性。该试剂盒还可以包括这样的说明书，该说明书指出在来自癌症患者的样品中对本文所述her2外显子21突变的阳性鉴定表明患者应该用波齐替尼或阿法替尼或结构相似的抑制剂治疗。[0130]v.实施例[0131]包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术遵循发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以视为构成其实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，且这些改变仍然获得类似或相似的结果。[0132]实施例1‑用于具有her2外显子21突变的癌细胞的药物的鉴定[0133]her2突变最常见于膀胱癌、胃癌和胆管癌：为了了解her2突变在不同癌症类型中的多样性，查询了几个数据库，包括来自cbioportal、mdanderson癌症中心和基础医学公司(foundationmedicine)的群组(cohort)以及来自guardanthealth的cfdna群组。在所有数据库中，分析了25种不同癌症类型的所有非同义her2突变(表2)。计算了her2突变的加权平均频率。与在aacrgenie数据库中观察到的情况相似(meric‑bernstam等人，2018年)，her2突变最常见于膀胱癌(8.3％)、胆管癌(5.3％)和胃癌(4.5％)(图1a)；且her2外显子20突变最常见于小肠癌(1.8％)、肺癌(1.5％)和乳腺癌(0.9％)(图1b)。[0134]her2突变最常见于her2的酪氨酸激酶结构域，且突变热点因恶性肿瘤而异：接下来，分析了cbioportal和mdanderson报告的her2受体不同区域内的突变频率。在所有癌症类型中，her2突变最常见于酪氨酸激酶结构域(46％)，包括外显子20(20％)、外显子19(11％)和外显子21(9％)的突变(图2a)。此外，胞外结构域突变占her2突变的37％。在所有查询的癌症中，最常见的her2突变为p.s310f/y(11.0％)、p.y772_a775dupyvma(5.7％)、p.l755p/s(4.6％)、p.v842i(4.4％)和p.v777l/m(4.0％)(图2e)。在肺癌中，大多数her2突变发生在外显子20内(48％)，其中y772_a775dupyvma占所有her2突变的34％(图2b、2f)。在乳腺癌中，大多数her2突变发生在外显子19内(37％)，其中l755突变最常见，占her2突变的22％(图2c)。然而，与一种变异体占优势的肺癌不同，在乳腺癌中，外显子19突变的突变多样性较大(图2g)。在结直肠癌中，her2突变最常见于外显子21(23％)和胞外结构域(23％)，其中外显子21中的v842i变体最常见(19％)(图2d、2h)。[0135]y772dupyvma是所有癌症类型中最常见的hr2外显子20插入突变：her2外显子20突变是her2酪氨酸激酶结构域内最常见的突变(占所有her2突变的16％和酪氨酸激酶结构域突变的43％)，而且her2外显子20插入突变仍然是临床挑战。为了了解外显子20插入的多样性和患病率，在cbioportal、mdanderson和guardanthealth数据库中按癌症类型分析了her2外显子20插入序列的发生率。y772dupyvma插入是最常见的her2外显子20插入，其占所有her2外显子20插入的70％，且p.g778dupgsp(14％)和p.g776delinsvc(9％)插入是第二和第三常见的(图9a)。nsclc中的外显子20插入突变(n＝362)显示外显子20插入突变的最大多样性(图9b)，乳腺癌中的外显子20插入突变(n＝30)显示插入序列的极小多样性，仅报告了三种不同的变体(图9c)。在其他癌症类型中观察到了其他罕见的插入突变，但在所分析的每种癌症类型中，y772和g778处的复制出现频率最高(图9d)。[0136]经常检测到的her2改变是激活突变：为了评估常见her2突变的功能影响，使得ba/f3细胞稳定表达外显子19、20和21的16个最常检测到的her2突变。发现16个测试的her2突变均可诱导ba/f3细胞的il‑3非依赖性存活(图3a‑3c)。此外，这16个her2突变的表达导致磷酸化her2的表达(图10a)，指示这些突变导致受体活化。[0137]波齐替尼是经测试的最有效的tki，并在体外抑制最常见的her2突变：尽管最近的报道强调了基于共价喹唑啉胺的tki(即阿法替尼、达克替尼、波齐替尼、来那替尼)在her2突变疾病的临床前模型中的有效性，但阿法替尼、达克替尼和来那替尼的临床研究具有较低的orr以及患者结局的癌症特异性和变异体特异性差异。为了系统评估最常检测到的her2变体的药物敏感性，针对11种共价和非共价egfr和her2tki筛选了her2突变的ba/f3细胞的组。her2突变体对非共价抑制剂，拉帕替尼和沙帕替尼(sapatinib)表现出稳健的耐药性(图4a)。共价tki，奥希替尼、依鲁替尼和纳扎替尼在抑制表达外显子20突变的细胞的细胞活力方面无效；然而，这些tki对表达d769变体的细胞确实显示出活性(图4a)。相比之下，共价、基于喹唑啉胺的tki，阿法替尼、来那替尼、达克替尼、他索替尼‑tki和波齐替尼对所有三个外显子的her2突变体均具有抑制活性(图4a)。在测试的所有her2突变变体和tki中，波齐替尼具有最低的平均ic50，且在降低细胞活力方面明显比阿法替尼、来那替尼或他索替尼‑tki更有效(图4b)。此外，尽管波齐替尼对her2外显子19和20突变的疗效显著高于阿法替尼、来那替尼或他索替尼‑tki，但对外显子21突变体的平均ic50无显著差异(图4c‑4e)，表明突变位置影响药物结合。此外，在外显子19内，l755s和l755p变体对所有检测的tki的药物敏感性具有显著差异(图4f)，表明该位点的特定氨基酸变化影响药物结合亲和力。[0138]her2突变位置和氨基酸变化影响药物结合亲和力：为了进一步了解突变位置和氨基酸变化如何能够影响药物结合亲和力和抑制效力，使用分子动力学模拟检查了这些突变如何影响her2激酶结构域的结构和动力学。l755s、l755p、y772dupyvma和v777lher2突变体的分子模型(图11a)是使用公众可得的x射线结构(pdb3pp0)为模板构建的，并进行了加速分子动力学以增加蛋白质构象取样。在这些her2突变体中，所取样的蛋白质构象范围，特别关于p‑环和α‑c‑螺旋位置，其各不相同。甚至在外显子20突变之间也明显存在差异，尤其是在α‑c‑螺旋区，其中α‑c‑螺旋构象在“内”(具有较小结合口袋的活性构象)和“外”(具有较大结合口袋的非活性构象)之间的持续时间的变化。v777l突变体大量采样了“外”构象，而y772dupyvma突变体同时采样了“内”和“外”构象(图5a)。总的来说，构象状态的这些差异导致y772dupyvma突变体以“内”构象存在的频率是v777l突变体的10倍(图5b)，并且，平均而言，与v777l相比，y772dupyvma的结合口袋尺寸更小(图5c和11b)。此外，与v777l相比，y772drupyvma的较小结合口袋可能是导致来那替尼抗y772dupyvma效力较弱的原因，因为来那替尼含有朝α‑c‑螺旋定向的吡啶环。[0139]对her2突变体结合口袋体积的进一步分析(图10b)表明，相同残基的突变对蛋白质构象的影响可能截然不同。特别是，l755p突变的脯氨酸残基缺少氢键供体，该供体会分别破坏l755和v790之间β3和β5链之间的主链氢键。这两条β‑链之间缺乏稳定性导致β‑折叠不稳定和激酶铰链区的结构重排(图5d)。特别是l755p的l800残基突出到活性位点中，大大减小了口袋尺寸。β3链构象的变化也导致p‑环向内塌陷，进一步减少了口袋体积，并使该突变体对大多数tki不太敏感。此外，铰链活动度的变化也可能在激酶激活中发挥作用。l755p突变体确认中的这些明显变化与l755s突变体的表现形成对比，l755s突变体的构象和口袋体积轮廓与野生型her2更相似(图11b)。[0140]her2突变性人癌细胞系显示对波齐替尼的敏感性增强：检测her2抑制剂的临床研究显示了药物敏感性的癌症类型特异性差异(hyman等人，2018年)。为了确定共价、基于喹唑啉胺的tki在her2突变疾病模型中是否具有活性，在人癌细胞系中测试了egfr/her2tki的组。用her2外显子20突变转染瘤前mcf10a乳腺上皮细胞，并评估其对12种egfr/her2tki的体外敏感性。表达g776delinsvc、y772dupyvma或g778dupgspher2突变的mcf10a细胞对波齐替尼最敏感，ic50值分别为12nm、8.3nm和4.5nm(图6a‑6c)。相比之下，他索替尼‑tki和来那替尼分别产生了21nm和150nm的平均ic50值(图6a‑6c)，表明波齐替尼的药效分别是他索替尼‑tki和来那替尼的2.6倍和19倍(p<0.001)。此外，使用波齐替尼和来那替尼的mcf10aher2g776delinsvc细胞的蛋白印迹显示，10nm的波齐替尼(而非来那替尼)完全抑制p‑her2(图12a)。由于野生型(wt)her2不会转化ba/f3细胞以独立于il‑3生长，因此使用mcf10a细胞来确定tki对突变型her2与wther2相比的选择性。为此，计算了每种抑制剂的选择性指数(si，突变体ic50值/wtic50值)，并发现波齐替尼是在mcf10a细胞系中测试的最具突变选择性的tki(si＝0.028)，其次是吡咯替尼(si＝0.063)和他索替尼‑tki(si＝0.111)(图6d)。与使用ba/f3细胞获得的数据一致(图3c)，在her2外显子19突变结直肠癌(cw‑2)模型中，波齐替尼、他索替尼‑tki和来那替尼之间的敏感性差异不太明显，但具有显著性(p＝0.02和p＝0.0004)，平均ic50值分别为3.19nm、4.24nm和68.8nm(图6e)。此外，在cw‑2结直肠细胞的异种移植小鼠模型中，在第21天，与溶媒治疗组相比，波齐替尼(5mg/kg)治疗的动物显示肿瘤体积缩小58％(p＝0.011)。相比之下，与溶媒对照(p＝0.023)相比，接受来那替尼(30mg/kg)治疗的动物显示肿瘤体积增大(28％)，而且与溶媒对照相比，阿法替尼(20mg/kg)治疗未显著影响肿瘤生长(图6f、13)。[0141]波齐替尼在her2突变nsclc患者中具有抗肿瘤活性：基于这些临床前数据和先前已发表的关于外显子20突变的工作(robichaux等人，2018年)，一项研究者发起的、对egfr和her2外显子20突变性nsclc(nct03066206)进行的波齐替尼ii期临床试验已启动。患者每天一次口服16mg波齐替尼治疗，直至进展、死亡或停药。根据recistv1.1，每八周评估客观反应。在前12例携带her2外显子20插入突变的可评估患者中，6/12(50％)患者有部分反应(pr)的最佳反应。2个月后，5/12的重复扫描证实了这一反应(证实的客观反应率，42％)(图7a)。在这12例患者中，2例患者在首次反应评估时具有疾病进展(pd)，导致83％的疾病控制率(dcr)。截至2018年12月，12例患者中10例有进展，前且前12例患者的中位pfs为5.6个月(图7b)。到目前为止，纳入研究的所有患者都携带两个最常见的her2外显子20插入(y772dupyvma和g778dupgsp)之一(图7a)。具有y772dupyvma突变的一位nsclc患者在治疗前和治疗后(8周)的代表性图像显示右肺稳健的肿瘤缩小(图7c)。包括既往治疗线数的患者特征可见于表3。此外，一名接受大量预治疗的携带her2外显子19点突变(l755p)的nsclc患者接受了同情用药方案(c‑ind18‑0014)治疗。该患者每日接受16mg波齐替尼治疗，四周时肿瘤缩小(图7d，白色框)。根据recistv1.1，患者疾病稳定(sd)(‑靶病变减少12％)。该患者在疾病控制的情况下继续接受波齐替尼超过7个月，直至成像显示疾病进展，并停用波齐替尼。该患者在波齐替尼治疗结束时临床状况良好，并继续接受进一步的全身治疗。[0142]波齐替尼与t‑dm1联合治疗增强抗肿瘤活性：先前在her2阳性乳腺癌模型中进行的her2tki拉帕替尼研究和在egfr突变性nsclc模型中进行的egfr抑制剂研究已表明，tki治疗导致细胞表面受体累积增加，增加的细胞表面her2/egfr增加了对抗体依赖性细胞毒性(adcc)的敏感性。为确定波齐替尼治疗是否增加细胞表面的总her2受体表达，在低剂量波齐替尼治疗24小时后，通过facs分析了细胞表面her2表达。发现，平均而言，波齐替尼治疗使细胞表面her2表达增加2倍(图8a，p<0.0001)。接下来，检测了波齐替尼和t‑dm1的组合是否会降低体外细胞活力，并发现，虽然单独的t‑dm1不会抑制mcf10aher2突变细胞系的细胞活力，但t‑dm1和波齐替尼的组合导致ic50值显著低于单独的每种剂，呈剂量依赖性(图8b)。为了体内验证这些结果，在her2突变nsclcpdx模型(her2y772dupyvma)中测试了低剂量波齐替尼与单剂量t‑dm1的组合(图8c)。为了评估对治疗的反应，确定了无进展生存期(pfs)，定义为从最佳反应到肿瘤倍增的时间。接受溶媒对照的小鼠的中位pfs(mpfs)为3天，而接受低剂量波齐替尼或t‑dm1的小鼠的mpfs分别为15天和27天。然而，接受单剂量t‑dm1联合低剂量波齐替尼治疗的(14/20)小鼠在第45天仍保持无肿瘤(图8d)。此外，在最佳反应时(第15天)，与单独接受t‑dm1的2/9小鼠或接受低剂量波齐替尼的0/12小鼠相比，低剂量波齐替尼(2.5mg/kg)和单剂量t‑dm1(10mg/kg)的组合导致20/20小鼠(100％)肿瘤完全消退(图8c‑8f)。到第30天，在接受单独的t‑dm1的所有小鼠中肿瘤生长重新开始；然而，在接受联合治疗的14/20小鼠中，无肿瘤复发的迹象(图8f、8g)。[0143]在此，报告了发生在各种肿瘤类型中的her2突变，但是具体的突变热点因恶性肿瘤而异。此外，对her2tki的敏感性在突变位置上是异质性的，her2外显子20插入和l755p突变对大多数her2tki具有耐药性，可能是由于药物结合口袋体积缩小所致。此外，将波齐替尼鉴定为强效泛her2突变选择性抑制剂，在携带her2外显子20插入和l755p突变的nsclc患者中具有临床疗效。最后，认可了波齐替尼治疗诱导her2在细胞表面的累积，并且波齐替尼和t‑dm1的组合增强了体外和体内抗肿瘤活性。[0144]泛癌分析显示，her2突变热点因癌症类型而异，并且在体外对her2tki具有不同的敏感性，这可能会影响临床疗效。在summit试验中，来那替尼对乳腺癌患者的疗效最好，大多数反应者呈l755s、v777l或l869r突变阳性。在体外ba/f3药物筛查中，这些突变与低ic50值相关。相比之下，结直肠癌患者对来那替尼无反应。与该临床观察结果一致的是，发现v842i突变是结直肠癌病例中最常见的her2突变，并且在药物筛查测定中，该特异性突变对来那替尼不敏感。这些数据表明，恶性肿瘤之间的不同tki敏感性可部分由癌症特异性突变热点解释，这直接影响药物敏感性。然而，仍然存在关于her2突变的分布为何因肿瘤类型而异以及给定突变是否在不同肿瘤类型中产生相似的药物反应的关键问题。summit试验的数据显示，虽然特定的外显子20插入与乳腺癌患者的来那替尼敏感性相关，但这些相同的突变与所有其他癌症类型中的耐药性相关，证明了这些肿瘤类型特异性敏感性差异可能存在值得进一步研究的潜在机制。[0145]外显子20插入突变和外显子19l755p突变对大多数her2tki耐药。体外药物筛查显示，外显子20插入突变和l755p突变对检测的每种tki均具有最高ic50值。分子动力学模拟显示，这些突变诱导的构象变化影响药物结合口袋的整体尺寸和移动性。总之，这些体外和计算机模拟结果与临床观察结果一致，即具有her2外显子20插入突变的患者既往地对tki反应不佳。在外显子20插入频繁发生的肺癌中，携带her2外显子20插入突变的患者对来那替尼、达克替尼和阿法替尼分别具有0％、11.5％和18.2％‑18.8％的反应率。此外，虽然l755s突变已显示对来那替尼有反应，但l755p突变对tki和抗体‑药物偶联物两者均有很强的耐药性。[0146]实施例2–材料与方法[0147]her2突变的患病率和变异频率分析：为了确定mdanderson癌症中心、cbioportal、基础医学公司或guardanthealth数据库中报告的每个her2突变的频率，单独查询了每个数据库，然后根据每个数据库中的患者总数对频率进行加权，并以加权平均值进行报告。为了确定cbioportal中不同癌症类型的her2突变频率，选择并导出了所有非重叠研究。对于重叠研究，仅使用最大的数据集。为了确定mdanderson癌症中心的her2突变频率，查询了个体化癌症治疗研究所(instituteforpersonalizedcancertherapy)的数据库所有独立于癌症类型的her2突变。为了确定来自基础医学公司的her2外显子20突变的频率，对具有her2缺失、框偏移、插入和点突变的患者的去标识数据进行了制表，并排除了少于5个突变的癌症类型。最后，为了确定guardanthealth的her2外显子20突变的频率，查询了guardant360临床数据库中2015年10月至2018年5月期间(70和73个基因的组)测试的具有erbb2外显子20突变的样本。是经clia证明、cap/nysdoh认证的全面cfdnangs测试，其报告出snv、插入缺失(indel)、融合，且snv多达73种基因。然后对guardanthealth报告的频率进行归一化针对odegaard等2018年报告的临床敏感性校正。具体而言，将频率除以临床敏感性百分比(85.9％)。[0148]ba/f3细胞系产生和il‑3剥夺：如前所述建立ba/f3细胞系(robichaux等人，2018年)。简言之，通过逆转录转导ba/f3细胞系12小时产生稳定的ba/f3细胞系。通过使用lipofectamine2000(invitrogen)将表1(addgene和bioinnovatise)中汇总的基于pbabe‑puro的载体转染到phoenix293t‑ampho细胞(orbigen)中产生逆转录病毒。转导后3天，向rpmi培养基中加入2μg/ml的嘌呤霉素(invitrogen)。选择5天后，用facs分选的fitc‑her2(biolegend)对细胞染色。然后使细胞系在缺乏il‑3的情况下生长两周，并每三天使用celltiterglo测定(progema)评估细胞活力。将所得稳定细胞系维持在无il‑3的含10％fbs的rpmi‑1640培养基中。[0149]细胞活力测定和ic50估算：如前所述，使用celltiterglo测定(promega)确定细胞活力(robichaux等人，2018年)。简而言之，将每孔2000‑3000个细胞铺于384孔板(greinerbio‑one)中，一式三份。用7种不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂或单独的溶媒处理细胞，终体积40μl/孔。3天后，向每个孔中加入11μlcelltiterglo。摇晃平板15分钟，使用fluostaroptima多模式酶标仪(bmglabtech)确定生物发光。将生物发光值针对dmso处理的细胞归一化，并使用非线性回归拟合具有可变斜率的归一化数据，在graphpadprism中对归一化值作图。通过graphpadprism计算50％抑制时的ic50值。[0150]针对磷酸化和总her2的elisa以及与ic50值的相关性：如上所述，从亲代ba/f3细胞系和表达her2突变的每个ba/f3细胞系中收获蛋白。加入5μg/ml蛋白至每个elisa板中，并按照磷酸化her2(cellsignaling，#7968)和总her2(cellsignaling，#7310)的制造说明书所述进行elisa。通过elisa测定的p‑her2与总her2的比值确定相对p‑her2表达。将相对p‑her2比值相对于如上所述计算的波齐替尼ic50值作图。pearson相关性和p值通过graphpadprism确定。[0151]酪氨酸激酶抑制剂和t‑dm1：所有抑制剂均购自selleckchemical，但egf816和吡咯替尼除外，它们购自medchemexpress。将所有抑制剂以10mm的浓度溶于dmso中，并储存在‑80℃。在丢弃之前，将抑制剂限制在两个冻融循环。t‑dm1购自mdanderson癌症中心机构药房并重构。[0152]分子动力学模拟：使用moe计算机程序(chemicalcomputinggroup)通过在pdb3pp0x射线结构中引入计算机模拟突变构建her2突变体的蛋白质结构模型。使用namd模拟软件包进行经典和加速分子动力学模拟。补充信息部分提供了更多详细信息。[0153]人细胞系：mcf10a细胞购自atcc，并在补充了1％青霉素/链霉素、5％马血清(sigma)、20ng/mlegf、0.5mg/ml氢化可的松和10μg/ml胰岛素的dmem/f12培养基中培养。通过逆转录转导建立稳定的细胞系，并使用lipofectamine2000(invitrogen)将表1(addgene和bioinnovatise)中汇总的基于pbabe‑puro的载体转染到phoenix293t‑ampho细胞(orbigen)中，从而产生逆转录病毒。转导后2天，向rpmi培养基中加入0.5μg/ml的嘌呤霉素(invitrogen)。选择14天后，在如上所述的细胞活力测定中检测细胞。cw‑2细胞由mta的riken细胞系数据库提供，并在含10％fbs和1％青霉素/链霉素的rpmi中保存。[0154]体内异种移植物研究：通过将50％基质胶中的1x106细胞注射到6周龄雌性nu/nu裸鼠中建立cw‑2细胞系异种移植物。当肿瘤达到350mm3时，将小鼠随机分配到4个组：20mg/kg阿法替尼、5mg/kg波齐替尼、30mg/kg来那替尼或溶媒对照(0.5％甲基纤维素，2％吐温80的dh2o溶液)。每周测量肿瘤体积三次。小鼠在周一至周五(每周5天)接受药物，但在周三开始给药，在给药的前3天后允许停药2天。[0155]y772dupyvmapdx小鼠购自jaxlabs(模型#tm01446)。将来自表达her2y772dupyvma的肿瘤的片段接种到5至6周龄的雌性nsg小鼠中(jaxlabs#005557)。每周测量小鼠3次，当肿瘤体积达到200mm3‑300mm3时，将小鼠随机分配到4个治疗组：溶媒对照(0.5％甲基纤维素，0.05％吐温80的dh2o溶液)、2.5mg/kg波齐替尼、10mg/kgt‑dm1，或2.5mg/kg波齐替尼和10mg/kgt‑dm1的组合。每周测量三次肿瘤体积和体重。2.5mg/kg波齐替尼治疗的小鼠每周一至周五(每周5天)接受口服给药。在随机分配日，10mg/kgt‑dm1治疗的小鼠接受一个静脉(iv)剂量的t‑dm1。波齐替尼和t‑dm1联合治疗的小鼠接受一个iv剂量的t‑dm1，并在t‑dm1给药3天后开始每周5日的2.5mg/kg波齐替尼。如果小鼠体重下降超过10％或体重下降至20g以下，则使小鼠接受休药期。无进展生存期定义为连续两次测量自最佳反应的肿瘤倍增。完全消退定义为肿瘤负荷减少大于95％，对于肿瘤完全消退的小鼠，肿瘤倍增定义为连续两次以上测量大于75mm3。实验的完成符合良好动物实践(goodanimalpractices)，并获得mdanderson癌症中心机构动物护理和使用委员会(houston，tx)的批准。[0156]表1：用于产生稳定细胞系的载体[0157][0158]表2：各个数据库中按癌症类型分类的患者总数。[0159][0160]表3：患者特征和既往治疗的线数。[0161][0162]facs：将过表达her2突变的mcf10a细胞铺于6孔平板中过夜，然后用10nm波齐替尼处理。24小时后，用pbs洗涤两次细胞，并进行胰酶消化。然后将细胞重悬在含0.5％fbs的pbs中，然后用biolegend的抗her2‑fitc抗体(#324404)在冰上染色45分钟。用含0.5％fbs的pbs洗涤细胞两次，用流式细胞术分析。igg和未染色对照用于门控。[0163]蛋白质印迹：对于蛋白质印迹，在pbs中洗涤细胞，然后在rippa裂解缓冲液(thermofisher)和用蛋白酶抑制剂混合片剂(roche)裂解。将蛋白质(30μg‑40μg)上样到购自biorad的凝胶中。使用biorad半干转印槽，然后使用抗pher2、her2、ppi3k、pi3k、p‑akt、akt、p‑erk1/2和erk1/2(1:1000；cellsignaling)的抗体进行检测。用抗粘着斑蛋白或β‑肌动蛋白的抗体(sigma‑aldrich)作为上样对照，检测印迹，并使用ecl蛋白质印迹底物(promega)曝光。[0164]her2表达水平及其与ba/f3突变体ic50的相关性：从ba/f细胞系中收获蛋白质，并按照所述制造说明书对总her2(cellsignaling，#7310)进行elisa。将elisa确定的相对表达针对如上所述计算的ic50值作图。pearson相关性和p值通过graphpadprism确定。[0165]临床试验和cind标识符：患者提供了书面知情同意书，同意在同情用药方案(mdanderson癌症中心cind‑18‑0014)或临床试验nct03066206中使用波齐替尼治疗。方案经mdanderson癌症中心机构审查委员会和美国食品药品监督管理局批准。[0166]***[0167]根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员来说明显的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文所述方法和所述方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，显然，某些化学和生理学相关的剂可以替代本文所述的剂，同时会获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员明显的类似替代和修改都视为落入所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念内。[0168]参考文献[0169]以下参考文献在其提供了示例性程序或补充本文所述内容的其他细节的程度上被通过引用专门并入本文。[0170]arcilaetal.，clincancerres18：4910‑8，2012.[0171]arcilaetal.，molcancerther12(2)：220‑229，2013.[0172]austin‑wardandvillaseca，revistameddicadechile，126(7)：838‑845，1998.[0173]ausubeletal.，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&amp；sons，newyork，ny，2003.[0174]bukowskietal.，clinicalcancerres.，4(10)：2337‑2347，1998.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