一种鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法与流程

1.本发明涉及植物种植技术领域，具体涉及一种鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法。


背景技术：

2.鳟鱼秋海棠是斑叶竹节秋海棠的一个栽培品种，茎粗，支撑着天使翅膀般的大叶子，上面散布着明亮的银色斑点，叶背则是令人惊艳的深红色。温暖的环境里会开出成簇的白花，4~7个花瓣包裹着黄色的花心，与深绿色的叶片形成强烈的视觉反差。鳟鱼秋海棠可以长到两米高，成熟的叶子在20~25cm左右，株型高挑，深受国内园艺爱好者的喜爱，成为网红植物之一。传统繁殖方式多采用扦插、分株等方式，但未能满足市场对鳟鱼秋海棠的极大需求。
3.cn109952957a公开了一种海棠的组织培养方法以及培养基，其具体公开了用于诱导所述不定芽形成无根苗的增殖培养基；所述增殖培养基具有如下成分：ms 0.48
‑
0.52mg/l 6
‑
ba 0.18
‑
0.22mg l naa 0 .8
‑
0.12mg/l pvp。根据其说明书的记载可知，其繁殖20天的生根率仅仅22~64.29%，其生根率低，繁殖周期长。
4.cn 103636501a公开了一种金吉丽海棠组织培养快速繁殖方法，其具体公开了生根培养在增殖培养基中培养 22～28d，基部再生出丛芽，将长度超过 2.5cm 的嫩枝从芽丛上分离，接入生根培养基，培养 50d 后，形成健壮的生根苗，其中，所述的生根培养基的配方为：ms 培养基中 0.2mg
·
l
‑
1iba 3％蔗糖 0.54％琼脂，ph 5.2～5.5。根据其说明书记载，其在繁育50天后才形成健壮的生根苗，其繁殖周期过长。
5.因此如何在短的生根周期内繁育提高生根率成为了本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明提供一种鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法，能够有效的缩短繁殖周期，且所述的繁殖方法生根率高、存活率高。
7.本发明解决其技术问题采用以下技术方案：一种鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体的制备与消毒；s2、愈伤组织诱导培养；s3、不定芽诱导增殖培养；s4、继代培养；s5、生根培养；s6、移栽。
8.作为一种优选方案，所述愈伤组织诱导培养、不定芽诱导增殖培养、继代培养分别采用愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导增殖培养基、继代培养基进行培养，所述愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导增殖培养基、继代培养基均采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms
培养基中均加入：1100~2000mg硝酸铵、1200~2500mg硝酸钾、200~400mg七水硫酸镁、100~300mg磷酸二氢钾、300~600mg二水氯化钙、0.5~1.2mg碘化钾、4~10mg硼酸、10~30mg四水硫酸锰、5~10mg七水硫酸锌、0.1~0.4mg二水合钼酸钠、0.01~0.05mg五水硫酸铜、0.01~0.04mg六水合氯化钴、20~50mg七水合硫酸亚铁、20~50mg乙二胺四乙酸二钠、0.05~0.2mg盐酸硫胺素、0.1~0.8mg烟酸、0.2~1mg盐酸吡哆醇、1~4mg甘氨酸、50~120mg肌醇、20~50g白糖、2~8g卡拉胶、0.01~2mg 6
‑
苄氨基嘌呤、0.01~0.3mg萘乙酸。
9.作为一种优选方案，所述生根培养基采用生根培养基进行培养，所述生根培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：700~1200mg硝酸铵、500~1200mg硝酸钾、100~300mg七水硫酸镁、500~2000mg改性淀粉、800~3000mg辣木叶提取物、100~300mg磷酸二氢钾、100~400mg二水氯化钙、0.5~1.2mg碘化钾、4~10mg硼酸、10~30mg四水硫酸锰、5~10mg七水硫酸锌、0.1~0.4mg二水合钼酸钠、0.01~0.05mg五水硫酸铜、0.01~0.04mg六水合氯化钴、20~50mg七水合硫酸亚铁、20~50mg乙二胺四乙酸二钠、0.05~0.2mg盐酸硫胺素、0.1~0.8mg烟酸、0.2~1mg盐酸吡哆醇、1~4mg甘氨酸、50~120mg肌醇、15~40g白糖、2~8g卡拉胶、0.1~0.5mg 6
‑
苄氨基嘌呤、0.1~0.5mg萘乙酸、2~5g活性炭。
10.作为一种优选方案，所述生根培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：825mg硝酸铵、950mg硝酸钾、185mg七水硫酸镁、1400mg改性淀粉、1500mg辣木叶提取物、170mg磷酸二氢钾、220mg二水氯化钙、0.83mg碘化钾、6.2mg硼酸、22.3mg四水硫酸锰、8.6mg七水硫酸锌、0.25mg二水合钼酸钠、0.025mg五水硫酸铜、0.025mg六水合氯化钴、27.8mg七水合硫酸亚铁、37.3mg乙二胺四乙酸二钠、0.1mg盐酸硫胺素、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、2mg甘氨酸、100mg肌醇、20g白糖、7g卡拉胶、0.2mg 6
‑
苄氨基嘌呤、0.4mg萘乙酸、3g活性炭。
11.本发明所述的发明人在大量的研究中发现，采取上述所述的物质加入到生根培养基中，能够有效的提高生根率、存活率，且能够缩短生根时间，提高根系的质量，在20天前即可实现100%生根，能够有效的缩短繁殖时间。
12.作为一种优选方案，所述改性淀粉的制备方法为：（1）将1重量份淀粉加入到3~6重量份混合酸溶液中，以200~600rpm转速搅拌60~120min，得到淀粉混合液；（2）将1~4重量份肌醇六磷酸、1~3重量份吐温60、1~3份抗坏血酸、0.1~0.5重量份硅烷偶联剂kh550加入到10~20重量份去离子水中，配制成改性液；（3）将1重量份改性液滴入2~5重量份淀粉混合液中，以200~500rpm转速搅拌40~100min，过滤，干燥，得到改性淀粉。
13.采取上述所制备得到的改性淀粉能够有效的促进生根，提高存活率，有效的缩短生根时间，且发明人发现，不同的改性方法制备得到的改性淀粉对于提高生根率、存活率是不同，而采取上述所述的改性淀粉的制备方法制备得到的改性淀粉相比于其他方法能够显著的提高生根率、存活率。
14.作为一种优选方案，所述辣木叶提取物的制备方法为：（11）将辣木叶粉碎至60~100目，得到辣木叶粉；（12）将辣木叶粉溶解到无水乙醇和乙醚的混合溶液中，混合均匀，离心分离，得到预处理辣木叶粉；所辣木叶粉与混合溶液的重量比为1：3~7，所述混合溶液中无水乙醇和乙
醚重量比为1：0.5~2；（13）将预处理辣木叶粉加入到去离子水中，以200~600w超声浸提20~40min，过滤，收集滤液；所述预处理辣木叶粉与去离子水重量比为1：5~10；（14）调节滤液ph至6.2~6.8，以0.5~1.5bv/h上hpd
‑
600大孔吸附树脂柱，洗脱速度为1~2bv/h，去离子水洗 1~2bv，40~60wt％乙醇溶液洗1~3bv，收集乙醇溶液洗液，干燥，即得辣木叶提取物。
15.本发明的发明人在大量的研究中发现，采取上述所制备得到的辣木叶提取物能够有效的提高生根率、存活率，且采取上述的制备方法能够有效的促进利于生根的辣木叶活性成分的溶出，也就是说，采取上述制备方法制备得到的辣木叶提取物相比于其他方法制备得到的辣木叶提取物（如醇提、水提）能够更加显著的提高生根率、存活率。
16.且发明人发现，在本发明所述的生根培养基中，上述所述的辣木叶提取物与改性淀粉联用具有显著的协同增效作用。
17.作为一种优选方案，所述步骤s1具体为：采集幼嫩的鳟鱼秋海棠叶片，将鳟鱼秋海棠叶片清洗，消毒，切片，即成外植体。
18.作为一种优选方案，所述愈伤组织诱导培养具体为：将外植体划伤，将划伤后的外植体接入愈伤组织诱导培养基，在温度为22~28℃、湿度为45~70%下，暗培养55~65天。
19.作为一种优选方案，所述不定芽诱导增殖培养具体为：将经过愈伤组织诱导培养的外植体切片，切片后接入不定芽诱导增殖培养基中培养40~50天，所述不定芽诱导增殖培养条件为：温度为22~28℃、湿度为45~70%、光照强度为800~1200 lux、光照时间为6~10h/day。
20.作为一种优选方案，所述继代培养具体为：取经过不定芽诱导增殖培养的外植体的丛芽团块切割成4~6个生长点的团块，转入继代培养基中培养40~50天，培养完成后，在丛芽上切取幼苗，所述继代培养条件为：温度为22~28℃、湿度为45~70%、光照强度为800~1200 lux、光照时间为6~10h/day。
21.作为一种优选方案，所述生根培养具体为：将幼苗接种到生根培养基培养，所述生根培养条件为：温度为22~28℃、湿度为45~70%、光照强度为800~1200 lux、光照时间为6~10h/day。
22.作为一种优选方案，所述移栽具体为：将经过生根培养的幼苗，清洗晾干，移至大棚定植在穴盘中，进行炼苗过渡培养；所述穴盘基质由泥炭：椰糠按照重量比2~5:1混合而成。
23.本发明的有益效果：本发明所述的鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法，能够有效的缩短繁殖周期，且所述的繁殖方法生根率高、存活率高，且在培育过程中能够有效的避免污染，达到快速繁殖的目的。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1一种鳟鱼秋海棠的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：s1、外植体的制备与消毒；采集幼嫩的新叶，叶片用无菌水浸泡冲洗2分钟，75%酒精浸泡消毒20秒，0.3%二氧化氯溶液浸泡消毒15分钟，倒去二氧化氯溶液，用无菌水冲洗3次，外植体消毒完毕，在超净工作台上，将消毒好的叶片，切去边缘组织，切成2cm
×
2cm大小的叶片，即成外植体。
26.s2、愈伤组织诱导培养；将外植体用刀片划伤叶片，增加愈伤组织生长的机率划伤，将划伤后的外植体接入愈伤组织诱导培养基，在温度为25℃、湿度为55%下，暗培养60天，切口位置出现愈伤组织。
27.s3、不定芽诱导增殖培养；将长有愈伤组织的外植体切成1cm
×
1cm大小的组织，切片后接入不定芽诱导增殖培养基中培养48天，所述的愈伤组织长出丛芽团块，所述不定芽诱导增殖培养条件为：温度为25℃、湿度为55%、光照强度为1000lux、光照时间为8h/day。
28.s4、继代培养；取经过不定芽诱导增殖培养的外植体的丛芽团块切割成5个生长点的团块，转入继代培养基中培养42天，此时团块上长出幼苗，在丛芽团块上切取幼苗，所述继代培养条件为：温度为25℃、湿度为55%、光照强度为1000lux、光照时间为8h/day。
29.s5、生根培养；将幼苗（幼苗数量控制在50个）接种到生根培养基培养，培养20天，所述生根培养条件为：温度为25℃、湿度为55%、光照强度为1000lux、光照时间为8h/day。
30.注（培养20天的生根率）。
31.s6、移栽。
32.将经过生根培养的幼苗，清洗晾干，移至大棚定植在穴盘中，进行炼苗过渡培养；所述穴盘基质由泥炭：椰糠按照重量比3:1混合而成。炼苗过渡培养条件：光照2000lux，温度26摄氏度，湿度95%。15天后，待新叶萌发，提高光照强度至4000lux，温度27摄氏度，湿度75%，45天后即可出圃。
33.所述愈伤组织诱导培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：1650mg硝酸铵、1900mg硝酸钾、370mg七水硫酸镁、170mg磷酸二氢钾、440mg二水氯化钙、0.83mg碘化钾、6.2mg硼酸、22.3mg四水硫酸锰、8.6mg七水硫酸锌、0.25mg二水合钼酸钠、0.025mg五水硫酸铜、0.025mg六水合氯化钴、27.8mg七水合硫酸亚铁、37.3mg乙二胺四乙酸二钠、0.1mg盐酸硫胺素、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、2mg甘氨酸、100mg肌醇、30g白糖、6.0g卡拉胶、1.2mg 6
‑
苄氨基嘌呤、0.15mg萘乙酸。
34.所述不定芽诱导增殖培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：1650mg硝酸铵、1900mg硝酸钾、370mg七水硫酸镁、170mg磷酸二氢钾、440mg二水氯化钙、0.83mg碘化钾、6.2mg硼酸、22.3mg四水硫酸锰、8.6mg七水硫酸锌、0.25mg二水合钼酸钠、0.025mg五水硫酸铜、0.025mg六水合氯化钴、27.8mg七水合硫酸亚铁、37.3mg乙二胺四乙酸二钠、0.1mg盐酸硫胺素、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、2mg甘氨酸、100mg肌醇、30g白糖、6.0g卡拉胶、0.5mg 6
‑
苄氨基嘌呤、0.03mg萘乙酸。
35.所述继代培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：1237.5mg硝酸铵、1425mg硝酸钾、277.5mg七水硫酸镁、127.5mg磷酸二氢钾、330mg二水氯化钙、0.6225mg碘化钾、4.65mg硼酸、16.725mg四水硫酸锰、6.45mg七水硫酸锌、0.1875mg二水合钼酸钠、0.1875mg五水硫酸铜、01875mg六水合氯化钴、20.85mg七水合硫酸亚铁、27.975mg乙二胺四乙酸二钠、0.075mg盐酸硫胺素、0.375mg烟酸、0.375mg盐酸吡哆醇、1.5mg甘氨酸、75mg肌醇、30g白糖、6.0g卡拉胶、0.03mg 6
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苄氨基嘌呤、0.03mg萘乙酸。
36.所述生根培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：825mg硝酸铵、950mg硝酸钾、185mg七水硫酸镁、1400mg改性淀粉、1500mg辣木叶提取物、170mg磷酸二氢钾、220mg二水氯化钙、0.83mg碘化钾、6.2mg硼酸、22.3mg四水硫酸锰、8.6mg七水硫酸锌、0.25mg二水合钼酸钠、0.025mg五水硫酸铜、0.025mg六水合氯化钴、27.8mg七水合硫酸亚铁、37.3mg乙二胺四乙酸二钠、0.1mg盐酸硫胺素、0.5mg烟酸、0.5mg盐酸吡哆醇、2mg甘氨酸、100mg肌醇、20g白糖、7g卡拉胶、0.2mg 6
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苄氨基嘌呤、0.4mg萘乙酸、3g活性炭。
37.所述改性淀粉的制备方法为：（1）将1重量份淀粉加入到5重量份混合酸溶液中，以300rpm转速搅拌80min，得到淀粉混合液；所述混合酸溶液由草酸、酒石酸、柠檬酸、去离子水按照重量比1：1：1：17配制而成；（2）将2.5重量份肌醇六磷酸、1.5重量份吐温60、2份抗坏血酸、0.2重量份硅烷偶联剂kh550加入到13.8重量份去离子水中，配制成改性液；（3）将1重量份改性液滴入3重量份淀粉混合液中，以400rpm转速搅拌80min，过滤，干燥，得到改性淀粉。
38.所述辣木叶提取物的制备方法为：（11）将辣木叶粉碎至80目，得到辣木叶粉；（12）将辣木叶粉溶解到无水乙醇和乙醚的混合溶液中，混合均匀，以5000rpm转速离心分离10min，弃去滤液，得到预处理辣木叶粉；所辣木叶粉与混合溶液的重量比为1：5，所述混合溶液中无水乙醇和乙醚重量比为1：1；（13）将预处理辣木叶粉加入到去离子水中，以400w超声浸提30min，过滤，收集滤液；所述预处理辣木叶粉与去离子水重量比为1：8；（14）调节滤液ph至6.8，以1bv/h上hpd
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600大孔吸附树脂柱，洗脱速度为1bv/h，去离子水洗 1.5bv，50wt％乙醇溶液洗2bv，收集乙醇溶液洗液，干燥，即得辣木叶提取物。
39.实施例2实施例2与实施例1不同之处在于，实施例2所述的生根培养基中每升ms培养基中加入的物质的量不同于实施例1，其他都相同。
40.所述生根培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：700mg硝酸铵、1200mg硝酸钾、100mg七水硫酸镁、500mg改性淀粉、800mg辣木叶提取物、300mg磷酸二氢钾、100mg二水氯化钙、1.2mg碘化钾、4mg硼酸、30mg四水硫酸锰、10mg七水硫酸锌、0.1mg二水合钼酸钠、0.05mg五水硫酸铜、0.01mg六水合氯化钴、50mg七水合硫酸亚铁、20mg乙二胺四乙酸二钠、0.2mg盐酸硫胺素、0.1mg烟酸、1mg盐酸吡哆醇、1mg甘氨酸、120mg肌醇、15g白糖、8g卡拉胶、0.1mg 6
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苄氨基嘌呤、0.5mg萘乙酸、2g活性炭。
41.实施例3
实施例3与实施例1不同之处在于，实施例3所述的生根培养基中每升ms培养基中加入的物质的量不同于实施例1，其他都相同。
42.所述生根培养基采用ms培养基为基础培养基，其中每升ms培养基中加入：1200mg硝酸铵、500mg硝酸钾、300mg七水硫酸镁、1200mg改性淀粉、1600mg辣木叶提取物、100mg磷酸二氢钾、400mg二水氯化钙、0.5mg碘化钾、10mg硼酸、10mg四水硫酸锰、10mg七水硫酸锌、0.1mg二水合钼酸钠、0.05mg五水硫酸铜、0.01mg六水合氯化钴、20mg七水合硫酸亚铁、50mg乙二胺四乙酸二钠、0.05mg盐酸硫胺素、0.8mg烟酸、0.2mg盐酸吡哆醇、4mg甘氨酸、50mg肌醇、40g白糖、2g卡拉胶、0.5mg 6
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苄氨基嘌呤、0.1mg萘乙酸、5g活性炭。
43.对比例1对比例1与实施例1不同之处在于，对比例1所述的生根培养基中采用等量的辣木叶提取物替换改性淀粉，其他都相同。
44.对比例2对比例2与实施例1不同之处在于，对比例2所述的生根培养基中采用等量的改性淀粉替换辣木叶提取物，其他都相同。
45.对比例3对比例3与实施例1不同之处在于，对比例3采用淀粉替换改性淀粉，其他都相同。
46.对比例4对比例4与实施例1不同之处在于，对比例4所述的改性淀粉的制备方法不同于实施例1，其他都相同。
47.在本对比例中，所述的改性淀粉不经过所述的改性液的处理。
48.所述改性淀粉的制备方法为：（1）将1重量份淀粉加入到5重量份混合酸溶液中，以300rpm转速搅拌80min，得到淀粉混合液；所述混合酸溶液由草酸、酒石酸、柠檬酸、去离子水按照重量比1：1：1：17配制而成，过滤，干燥，得到改性淀粉。
49.对比例5对比例5与实施例1不同之处在于，对比例5所述的辣木叶提取物的制备方法不不同于实施例1，其他都相同。
50.在本对比例中，所述的辣木叶提取物为辣木叶的乙醇提取物。
51.所述的辣木叶提取物的制备方法为：（11）将辣木叶粉碎至80目，得到辣木叶粉；（12）将辣木叶粉加入到70%乙醇水溶液中，浸泡10h，以400w超声处理20min，过滤，干燥，得到辣木叶提取物。
52.为了进一步证明本发明的效果，提供了以下测试方法：1.记录实施例1~3、对比例1~5所述的繁殖方法生根培养的生根培养基培养20天的生根率以及存活率，见表1。
53.表1
从表1中可看出，本发明所述的鳟鱼秋海棠快速繁殖方法能够有效的提高生根率以及存活率。
54.对比实施例1~3可知，经过优化生根培养基的添加物，能够有效的提高生根率、存活率。
55.对比实施例1与对比例1、2可知，本发明将所述的改性淀粉、辣木叶提取物联用能够有效的提高生根率、存活率，且二者具有一定的协同增效作用。
56.对比实施例1与对比例3、4可知，采取所述的改性淀粉能够显著的提高生根率、存活率，且不同方法制备得到的改性淀粉对于生根率、存活率提高程度是不同的，采取本发明所述的改性淀粉的改性方法相比于其他方法能够更加显著的提高生根率、存活率。
57.对比实施例1与对比例5可知，采取本发明所述的辣木叶提取物的制备方法相比于其他方法制备得到的辣木叶提取物能够更加显著的提高生根率、存活率。
58.以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。