一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法与流程

技术特征：
1.一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养多种细胞系，收集细胞；（2）在保证细胞总量一致情况下，对上述不同的细胞进行一系列不同比例的混合，制成混合细胞样品组用以模拟样本异质性或高丰度干扰；（3）将上述混合细胞样品制成质控标准品；（4）对上述质控标准品进行蛋白分析实验，获取数据；（5）对数据中各种细胞所拥有的独立特征蛋白进行定量，并对比各特征蛋白定量数据是否与上述混检的细胞数量比例相一致及偏差程度，即用于评价该蛋白组学分析方法对抗样本异质性干扰的能力；分析各特征蛋白定量数据在存在或不存在高丰度蛋白干扰时的一致性及偏差程度，即用于评价该蛋白质组学分析方法对抗高丰度蛋白干扰的能力。2.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细胞系含有人源细胞系，包括正常细胞和癌细胞；所述人源细胞系的细胞种类包括组织细胞、间质细胞、免疫细胞或红细胞。3.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，所述细胞系选自：来自肺组织的正常成纤维细胞和带有egfr突变的肺部腺癌细胞，或者带有egfr突变的肺部腺癌细胞和正常红细胞，或者来自肺组织的正常成纤维细胞、带有egfr突变的肺部腺癌细胞和正常红细胞。4.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（1）中，排除样本异质性时，使用多种具有独立蛋白表达特征的同组织来源细胞系；排除高丰度干扰能力时，使用组织细胞与含有特定高丰度蛋白的细胞。5.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（2）中，至少混合两种细胞，不同细胞沉淀混合总和一致，包括细胞数、细胞质量或细胞体积。6.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（3）中，所述混合细胞样品制成标品的方法包括：直接混匀冷冻或加入琼脂糖混匀后进行冷冻，或者优选用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块并进行福尔马林固定，最终制成为福尔马林固定的细胞蜡块。7.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质组样本制备，方法如下：a)标品前处理；b)加入裂解液，超声裂解；c)去交联，离心取上清；d)蛋白浓度测定；e)蛋白还原烷基化；f)蛋白酶解；g)肽段脱盐抽干及复溶后肽段定量。8.根据权利要求7所述的质控方法，其特征在于：步骤a）中，标品前处理包括：冷冻样本进行液氮研磨；细胞蜡块标品先加入有机溶剂进行脱蜡，结束后采用不同比例乙醇进行脱蜡后的复水；步骤b）中，加入裂解液，超声裂解包括：裂解液含有sds、尿素、edta或酶抑制剂中的一种或几种，超声裂解优选为使用超声探头接触式超声，1~5s
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on，1~5s
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off，时间3
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20 min；
步骤c）中，去交联，离心取上清包括：去交联为温度80~100 ℃，离心为2
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4℃，8,000
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12,000 g 5
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60 min；步骤d）中，蛋白浓度测定包括：使用bca方法进行蛋白定量；步骤e）中，蛋白还原烷基化包括：加入二硫苏糖醇后于45～95℃条件下反应5～60分钟，再加入烷基化试剂碘乙酰胺或氯乙酰胺避光室温反应5~60分钟；或直接加入三(2
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羧乙基)膦及氯乙酰胺，45～95℃条件下反应5～60分钟；步骤f）中，蛋白酶解包括：使用sp3磁珠试剂盒对蛋白进行富集清洗，再加入酶解缓冲液，反应条件为温度为25～37 ℃，时间为2～16小时；步骤g）中，肽段脱盐抽干包括：使用冷冻旋转真空干燥进行抽干。9.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（4）中，所述蛋白分析实验包括蛋白质谱检测，方法包括以下步骤：使用液相色谱
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串联质谱法进行检测，检测方法包括dia、dda、prm检测方法。10.根据权利要求1所述的质控方法，其特征在于，步骤（5）中，对数据中特定蛋白定量数据进行定量对比包括：使用软件包括spectranaut、maxquant、peaks对原始数据进行定性定量比对分析抽提得到总蛋白定量表，对总蛋白定量表进行数据校正，校正方法包括中位数校正、fot校正、ibaq校正、内标校正，对反映细胞特征的蛋白进行分析比较，并计算相应细胞比例以检测分析方法抗异质性及高丰度蛋白的干扰。

技术总结
本发明公开了一种排除样本异质性及高丰度干扰能力的质控方法，包括以下步骤：（1）培养多种细胞系，收集细胞；（2）在保证细胞总量一致情况下，对上述不同的细胞进行一系列不同比例的混合，制成混合细胞样品组用以模拟样本异质性及高丰度干扰；（3）将上述混合细胞样品制成质控标准品；（4）对上述指控标准品进行蛋白分析实验；（5）对数据中各种细胞所拥有的独立特征蛋白进行定量和分析。本发明方法通过对不同种类细胞的混合模拟临床组织样本异质性，以已知混合比例与最终蛋白分析的定量结果进行对照分析，可用于评价各实验室间蛋白分析系统对样本异质性及高丰度的抗干扰能力，作为蛋白组学分析过程中系列质控方法之一。学分析过程中系列质控方法之一。


技术研发人员：李捷 陈亮宇 吴小雷 宋雷
受保护的技术使用者：谱天（天津）生物科技有限公司
技术研发日：2021.10.26
技术公布日：2021/11/24