一种水产养殖用微生态饲料添加剂及其使用方法与流程

1.本发明涉及一种水产养殖用微生态饲料添加剂及使用方法，具体涉及一种澳洲淡水龙虾用微生态饲料添加剂，属于水产养殖微生物技术领域。


背景技术：

2.随着水产养殖业的快速发展和养殖密度的大幅度提升，为了减少养殖病害的发生，一方面需要改善养殖生态环境，另一方面需要提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物。目前在改善养殖环境方面，有各种底改用、消毒用的化学制剂产品，也有光合细菌、自养硝化细菌和缺氧反硝化细菌产品；在提高养殖动物免疫力方面，有大蒜素、复合酶、中药成分（如柠檬草），也有植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌微生物制剂作为抗生素的替代添加剂，以避免造成药物残留、耐药性微生物增加、水体正常微生物种群失调以及养殖动物内脏机能损伤等一系列不良后果。但是，现有技术仍然存在以下几个问题：1. 目前提高水产养殖动物免疫力的产品，在改善养殖环境方面并不突出，饲料与饵料的持续投加很容易使水体中的亚硝氮和氨氮超标，对水产养殖动物产生毒害死亡；2.提高水产养殖动物免疫力的产品，施用的成本较高；3.当前改善养殖环境方面的产品对水产养殖动物免疫力提升的效果较弱，尽管持续投加，但养殖环境仍然容易受干扰，菌相、藻相发生极剧变化，使水产养殖动物病害死亡加重。
3.经过检索发现公开号为cn109043225a的中国专利公开了一种提高小龙虾个体重量的饲料，该饲料包含麦麸、大豆饼、马油渣、荷花粉、鸭舌草发酵料、蚕蛹粉、苜蓿粉、枯草芽孢杆菌、骨粉、调节剂；其中调节剂包含d
‑
葡萄糖醛酸、l
‑
焦谷氨酸钙、富马酸亚铁、血根碱、甜菜碱；鸭舌草发酵料的制备方法为将采集的鸭舌草全草加入糖蜜、edta螯合铁、茎瘤固氮根瘤菌混合，打浆得到打浆料；将打浆料与醋糟沼液混合后发酵即可。上述小龙虾饲料的发酵料中含有茎瘤固氮根瘤菌，茎瘤固氮根瘤菌混合在鸭舌草等的打浆料中，其作用是针对鸭舌草中的高含量纤维素等难分解的物质进行分解，然后和醋糟沼液中的醋酸发酵菌一起发酵，促进醋酸的产生。其中茎瘤固氮根瘤菌会被醋酸的低ph值所抑制，需要将ph值调到5.6左右再进行发酵；同时茎瘤固氮根瘤菌是一种自生固氮菌，在没有豆科植物共生的情况下，依然能够将氮气固定转变成生物体的铵。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提出一种水产养殖用微生态饲料添加剂及使用方法。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种水产养殖用微生态饲料添加剂，包括根瘤菌和氧化微杆菌，所述根瘤菌为根瘤菌(rhizobium rosettiformans)，其保藏编号为cgmcc no.22739，所述氧化微杆菌为氧化微杆菌(microbacterium oxydans)，其保藏编号为cgmcc no.22738。
6.本发明采用根瘤菌(rhizobium rosettiformans，保藏号cgmcc no.22739)作为饲料添加剂。根瘤菌分泌的胞外多糖能够有效地提高澳洲淡水龙虾的免疫力；而残留在饲料上的根瘤菌能够以水体中的氨氮、亚硝氮或者硝氮这类无机氮作为唯一氮源生长繁殖，有利于控制水体中氨氮与亚硝氮的浓度；碳源利用更为广泛，根瘤菌能够以植物秸秆这类廉价的废弃物作为碳源，使培养成本显著下降。
7.本发明采用氧化微杆菌 (microbacterium oxydans，保藏号cgmcc no.22738)作为饲料添加剂。氧化微杆菌能够富集水体中的微量元素，而且该菌体对磷的吸收量达到普通细菌的3倍以上，能够有效地补充澳洲淡水龙虾生长对微量元素和磷的高需求，进而保障澳洲淡水龙虾的机体免疫功能发挥显著作用；而残留饲料上的氧化微杆菌有利于降低水体中磷酸盐的浓度，进而降低了蓝藻水华的发生风险；氧化微杆菌还对一些澳洲淡水龙虾的病原菌有拮抗作用，有利于减少养殖病害的发生；氧化微杆菌对池塘中的祼藻有拮抗作用，有利于减少裸藻水华的发生风险；氧化微杆菌的碳源利用广泛，能够以植物秸秆这类廉价的废弃物作为碳源，使培养成本显著下降。
8.总之，本发明通过在饲料或者植物性饵料中添加特定的菌剂，首先能够促进澳洲淡水龙虾的生长，提高机体免疫力和抗病力，极大提升养殖的存活率；其次，可以有效降低由于饲料残留与动物粪便大量累积引起的水质恶化，稳定水体中氨氮和亚硝氮；再者，所使用的菌株可以利用无机氮源和廉价的有机碳源，使培养成本显著下降。
9.上述技术方案中，所述饲料添加剂是由根瘤菌经扩大培养后的液态菌剂和氧化微杆菌经扩大培养后的液态菌剂混合组成。
10.进一步的，所述饲料添加剂中根瘤菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml，氧化微杆菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml。
11.本发明又进一步的，所述饲料添加剂是由根瘤菌冻干粉与氧化微杆菌冻干粉混合组成，按冻干粉质量比根瘤菌：氧化微杆菌=1～2:3～1。
12.本发明还提供一种微生态饲料添加剂的使用方法，将液态的所述饲料添加剂直接喷涂在饲料或植物性饵料表面，风干后使用。
13.本发明的添加剂是直接作用在饲料中，推测其中的根瘤菌能够改善虾肠道的健康，促进营养物质的消化吸收，且根瘤菌分泌的胞外多糖，有利于提高澳洲淡水龙虾的免疫力；残留饲料上的根瘤菌能够以水体中的氨氮、亚硝氮或者硝氮这类无机氮作为唯一氮源，有利于控制水体中氨氮与亚硝氮的浓度，维持健康的水体环境。同时，本发明所使用的根瘤菌并不是自生固氮菌，没有豆科植物的共生，它不具有单独固氮的能力，反而能够以水体中的氨氮、亚硝氮或者硝氮这类无机氮作为唯一氮源，并具有好氧反硝化脱氮的能力，有利于从水质和免疫两个方面来提升养殖澳洲淡水龙虾的成活率。本发明所使用的氧化微杆菌，不仅能够富集水体中的微量元素，其菌体对磷的吸收量显著高于其他细菌，还对一些病原菌有拮抗作用、对水华祼藻有拮抗作用。这些优点都有利于氧化微杆菌在水产养殖中的应用。
14.进一步的，所述饲料中根瘤菌的含量为 1
×
106cfu/g～2
×
107cfu/g，氧化微杆菌的含量为1
×
106cfu/g～2
×
107cfu/g。
15.进一步的，所述饲料添加剂为根瘤菌经扩大培养后的液态菌剂和氧化微杆菌经扩大培养后的液态菌剂混合组成的液态复合菌剂，其中根瘤菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～
1
×
109cfu/ml，氧化微杆菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml。
16.进一步的，所述饲料添加剂为根瘤菌冻干粉与氧化微杆菌冻干粉混合组成的固态复合菌剂，按冻干粉质量比根瘤菌：氧化微杆菌=1～2:3～1，固态复合菌剂由水溶解为液态菌剂使用。
17.进一步的，所述液态菌剂中根瘤菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml，氧化微杆菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml。
18.进一步的，所述饲料添加剂的剂型为粉剂或液剂。
19.当饲料添加剂为液剂时，将根瘤菌、氧化微杆菌分别置于lb培养基中培养，得到根瘤菌扩大培养液和氧化微杆菌扩大培养液；根瘤菌扩大培养液和氧化微杆菌扩大培养液混合形成液态复合菌剂作为饲料添加剂。
20.当饲料添加剂为粉剂时，将根瘤菌扩大培养液、氧化微杆菌扩大培养液分别经离心收集、低温冷冻干燥后，得到根瘤菌冻干粉和氧化微杆菌冻干粉，二者混合得到固态复合菌剂作为饲料添加剂。
21.本发明的优点如下：首先，能够促进澳洲淡水龙虾的生长，提高机体免疫力和抗病力，极大提升养殖的存活率和增长率，效果显著优于乳酸菌与枯草芽孢杆菌这类公认的免疫增强菌剂；其次，能够有效稳定水体中氨氮和亚硝氮的水平；最后，所使用的菌株可以利用无机氮源和廉价的有机碳源进行培养，使得培养成本显著下降。
附图说明
22.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
23.图1为本发明实施例1中投喂不同饲料后水体中no2浓度的情况图。
24.图2为本发明实施例1中投喂不同饲料后水体中nh4浓度的情况图。
25.图3为本发明实施例1中投喂不同饲料后澳洲淡水龙虾成活率的示意图。
26.图4为本发明实施例1中投加嗜水气单胞菌后澳洲淡水龙虾的成活率及特定生长率的示意图。
27.图5为本发明实施例2中投喂不同饲料后澳洲淡水龙虾成活率的示意图。
28.图6为本发明实施例3中投喂不同饲料后澳洲淡水龙虾成活率的示意图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
30.本发明提供一种水产养殖用微生态饲料添加剂，包括根瘤菌和氧化微杆菌。其中，根瘤菌为根瘤菌rhizobium rosettiformans，保藏编号为cgmcc no.22739；氧化微杆菌为氧化微杆菌microbacterium oxydans，保藏编号为cgmcc no.22738。上述菌种的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年6月21日。
31.本发明的微生态饲料添加剂可以为液剂，也可以为粉剂。当微生态饲料添加剂为
液剂时，是由根瘤菌经扩大培养后的液态菌剂和氧化微杆菌经扩大培养后的液态菌剂混合组成的复合液态菌剂；当微生态饲料添加剂为粉剂时，是由根瘤菌冻干粉与氧化微杆菌冻干粉按冻干粉质量比根瘤菌：氧化微杆菌=1～2:3～1混合组成的复合固态菌剂，该复合固态菌剂在使用时需要采用水等溶剂溶解为复合液态菌剂后才能使用。上述两种复合液态菌剂中，根瘤菌的活菌数量为1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml，氧化微杆菌的活菌数量1
×
108cfu/ml～1
×
109cfu/ml。
32.复合液态菌剂直接喷洒于水产养殖各种的配方饲料表面，风干后可以直接使用。饲料喂食澳洲淡水龙虾后，饲料会在水域底部有少量残留，而残留饲料上的菌剂会对水质产生好的影响，被澳洲淡水龙虾吃进去的饲料会对澳洲淡水龙虾产生较好的影响，提高其免疫力。
33.本发明所用到的化学试剂及材料均为市购。
34.实施例1将根瘤菌rhizobium rosettiformans、氧化微杆菌microbacterium oxydans分别接种到lb培养基中进行扩大培养。lb培养基的基础配方如下：5g/l酵母粉、10g/l蛋白胨、10g/l氯化钠。该培养基成本较高，在大规模使用时，为降低成本可以在常规的无机盐培养基中添加玉米淀粉作为碳源，其本身含有的无机氨作为氮源。基础培养基配方可以是mgso4·
7h2o 1g/l, kh2po
4 0.5g/l, k2hpo
4 4.0g/l, nacl 1.0 g/l,cacl
2 20 mg/l，feso
4 5 mg/l,zncl
2 5 mg/l, mncl2·
4h2o 5mg/l,cucl
2 0.5mg/l。
35.将用作对比处理的乳酸菌接种于mrs培养基进行扩大培养，芽孢杆菌接种于lb培养基进行扩大培养。mrs培养基的配方如下：10g/l蛋白陈、5g/l牛肉粉、4g/l酵母粉、1ml/l吐温80、2g/l磷酸氢二钾、5g/l乙酸钠、2g/l柠檬酸三铵、0.2g/l硫酸镁、0.05g/l硫酸锰。
36.将根瘤菌扩大培养后的菌液以及氧化微杆菌扩大培养后的菌液分别浓缩后混合制成混合菌液，该混合菌液中根瘤菌的活菌数量为6
×
108cfu/ml，氧化微杆菌的活菌数量为6
×
108cfu/ml。同时，将用作对比处理的扩大培养后的乳酸菌菌液、芽孢杆菌菌液分别浓缩后制成混合菌液，该混合菌液中两个菌种的活菌数量与根瘤菌、氧化微杆菌相同。
37.另外，还可以将根瘤菌扩大培养液、氧化微杆菌扩大培养液分别离心收集、低温冷冻干燥制成根瘤菌冻干粉和氧化微杆菌冻干粉，二者按质量比1～2:3～1混合得到固态复合菌剂，使用时用水溶解稀释即可。
38.将上述含有根瘤菌、氧化微杆菌的混合菌液以及含有乳酸菌、芽孢杆菌的混合菌液分别喷洒在澳洲淡水龙虾的饲料表面，风干。其中，喷洒含有根瘤菌和氧化微杆菌菌液的饲料中，根瘤菌、氧化微杆菌的含量均为6
×
106cfu/g；喷洒含有乳酸菌和芽孢杆菌菌液的饲料中，乳酸菌、芽孢杆菌的含量均为6
×
106cfu/g。同时，采用喷洒等体积去离子水的饲料作为空白对照组进行如下试验。
39.（1）饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料对澳洲淡水龙虾标粗期水质的维持及成活率的影响试验虾采用体重约0.02g/只的幼虾，饲养密度为185只/m2，采用瓦片构建虾巢，每日的饲喂量为虾体重的10%，每日换水1/3，试验用水为曝气过的自来水，每2天补一次液体离子钙，试验周期为20天，水温为25℃。试验以投加无任何菌剂的配方饲料为空白对照组，同时以添加了当前公认能提高免疫力的“乳酸菌 芽孢杆菌”的配方饲料作为对比处理。饲
料中所含单菌剂浓度均为6
×
106cfu/g 。如图1至图3所示，饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料对澳洲淡水龙虾标粗期水质有很好的维持作用，能够在没有水生植物维系、不加光合细菌、反硝化细菌调控的情况下，使水体中的氨根离子和亚硝酸离子均保持在危险阈值以下，且成活率比普通配方饲料提高了16.4%，比当前公认能提高免疫的“乳酸菌 芽孢杆菌”的配方饲料提高了8.7%。
40.（2）在菌剂、苦草协同调控水质下，饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料对澳洲淡水龙虾抵抗病原菌浸袭的作用试验虾采用体重约17g/只的成虾，饲养密度为37只/m2，每日饲喂量为虾体重的5%，苦草覆盖度为75%，试验用水为预先经苦草、光合细菌、硝化反硝化细菌处理的塘水，待水质稳定后再放入虾，每5天补一次液体离子钙。补充红糖碳源，保持codc
r
约20mg/l。视水质情况酌情进行换水处理。试验周期30天，水温30℃。投加能够引起甲壳病、肠炎、水肿病、烂尾病和偷死症的嗜水气单胞菌（aeromonas hydrophila），初浓度为3
×
104个/ml，此后每5天继续补加嗜水气单胞菌，浓度为3
×
104个/ml。试验以投加无任何菌剂的配方饲料为空白对照，同时以添加了当前公认能提高免疫的“乳酸菌 芽孢杆菌”的配方饲料作为对比处理。饲料中所含单菌剂浓度均为6
×
106cfu/g 。如图4所示，饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料有利于澳洲淡水龙虾抵抗嗜水气单胞菌的侵袭，成活率比空白提高了124.2%，比当前公认能提高免疫的“乳酸菌 芽孢杆菌”的配方饲料提高了15.6%，且含“根瘤菌和氧化微杆菌”的饲料在特定生长率方面与含“乳酸菌 芽孢杆菌”的饲料相当。
41.（3）氧化微杆菌对磷的富集能力实验采用 0.1
×
hoaglands培养基（其中再添加0.125克酵母粉、0.25克蛋白胨），tp含量为5.79mg/l。按照表1将不同的菌接种于0.1
×
hoaglands培养基，每个菌的接种量均为2%。于28℃，120rpm条件下培养48h。试验结果表明，氧化微杆菌对水体磷的吸收去除率最高，达到69.48%。
42.表1菌磷吸收去除率短波单胞菌4.98%鞘氨醇菌8.62%光合红螺菌5.32%节杆菌11.64%假单胞菌11.65%芽孢杆菌14.63%氧化微杆菌69.48%根癌农杆菌23.06%（4）氧化微杆菌对微量元素的富集能力实验采用lb培养基，添加feso4，使fe离子浓度达到100mg/l，氧化微杆菌接种量为2%，于28℃，120rpm条件下培养48h。结果显示，菌体富集铁的能力达到8.7mg/g干重，与富铁酵母的铁含量相当。
43.实验采用lb培养基，添加znso
4 ，使zn离子浓度达到100mg/l，氧化微杆菌接种量为2%，于28℃，120rpm条件下培养48h。结果显示，菌体富集锌的能力达到14.6mg/g干重，远
高于一般益生菌的富锌能力0.55mg/l。
44.（5）氧化微杆菌对一些病原菌和水华祼藻的拮抗能力试验采用lb培养基扩掊氧化微杆菌，采用pd培养基扩培黑腐丝囊霉菌（丝囊霉菌是引起虾瘟病的真菌病原），分别将黑腐丝囊霉菌和氧化微杆菌按一定浓度加入共培养培养基进行培养，共培养的培养基为lb培养基与pda培养基按照重量比1:1混合后得到的培养基。黑腐丝囊霉菌的添加量为5
×
103个/ml，氧化微杆菌的添加量为5
×
104个/ml和5
×
105个/ml，以不加氧化微杆菌的为空白。培养三天后用pda培养基计数黑腐丝囊霉菌的菌落数，结果见表2。
45.表2 3天后霉菌的抑制率空白0%氧化微杆菌（5
×
104个/ml）49.09%氧化微杆菌（5
×
105个/ml）73.47%结果表明，氧化微杆菌对黑腐丝囊霉菌有很好的抑制效应。
46.试验采用lb培养基扩掊氧化微杆菌，采用hut培养基扩培水华血红裸藻（裸藻水华可使生态系统面临崩溃、致病细菌大量繁殖），分别将水华裸藻和氧化微杆菌按一定浓度加入共培养培养基，共培养的培养基为hut培养基。血红裸藻添加量为5
×
106个/ml，氧化微杆菌的添加量为5
×
107个/ml和5
×
108个/ml，以不加氧化微杆菌的为空白。培养三天后用hut培养基计数水华血红裸藻的菌落数，结果见表3。
47.表3 3天后血红裸藻的抑制率空白0%氧化微杆菌（5
×
107个/ml）68.95%氧化微杆菌（5
×
108个/ml）87.01%结果表明，氧化微杆菌对血红裸藻有很好的抑制效应。
48.实施例2按照实施例1的方法配制根瘤菌浓度为1
×
106cfu/g、氧化微杆菌浓度为3
×
106cfu/g的饲料。
49.试验虾采用体重约17g/只的成虾，饲养密度为37只/m2，每日饲喂量为虾体重的5%，苦草覆盖度为75%，试验用水为预先经苦草、光合细菌、硝化反硝化细菌处理的塘水，待水质稳定后再放入虾，每5天补一次液体离子钙。补充红糖碳源，保持codc
r
约20mg/l。视水质情况酌情进行换水处理。试验周期30天，水温30℃。投加能够引起甲壳病、肠炎、水肿病、烂尾病和偷死症的嗜水气单胞菌（aeromonas hydrophila），初浓度为3
×
104个/ml，此后每5天继续补加嗜水气单胞菌，浓度为3
×
104个/ml。试验以投加无任何菌剂的配方饲料为空白对照。饲料中所含根瘤菌浓度为1
×
106cfu/g、氧化微杆菌3
×
106cfu/g。如图5所示，饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料有利于澳洲淡水龙虾抵抗嗜水气单胞菌的侵袭，成活率比空白提高了118.3%。
50.实施例3按照实施例1的方法配制根瘤菌浓度为2
×
107cfu/g、氧化微杆菌浓度为1
×
107cfu/g的饲料。
51.试验虾采用体重约17g/只的成虾，饲养密度为37只/m2，每日饲喂量为虾体重的5%，苦草覆盖度为75%，试验用水为预先经苦草、光合细菌、硝化反硝化细菌处理的塘水，待水质稳定后再放入虾，每5天补一次液体离子钙。补充红糖碳源，保持codc
r
约20mg/l。视水质情况酌情进行换水处理。试验周期30天，水温30℃。投加能够引起甲壳病、肠炎、水肿病、烂尾病和偷死症的嗜水气单胞菌（aeromonas hydrophila），初浓度为3
×
104个/ml，此后每5天继续补加嗜水气单胞菌，浓度为3
×
104个/ml。试验以投加无任何菌剂的配方饲料为空白对照。饲料中所含根瘤菌浓度为2
×
107cfu/g、氧化微杆菌1
×
107cfu/g。如图6所示，饲喂含有根瘤菌和氧化微杆菌的饲料有利于澳洲淡水龙虾抵抗嗜水气单胞菌的侵袭，成活率比空白提高了130.3%。
52.除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。