一种番茄诱抗剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种植物诱抗剂及在番茄中的应用方法，属于农业病害防控技术领域。


背景技术：

2.根结线虫(meloidogyne spp.)的寄主种类多，分布广，危害严重，每年造成巨大的损失，是农作物危害有重要病原线虫之一。根结线虫在植株根系上形成根结，从而破坏水分和养分的吸收能力，导致减产。根结线虫还可与其他的病原物发生复合侵染，加重危害。根结线虫病严重的威胁着蔬菜产业的可持续发展。
3.随着人们对健康和环境保护认识不断提高，一些杀线虫剂已不适应现代绿色农业发展的需求，例如杀线虫剂甲基溴、二溴氯丙烷、涕灭威等已被淘汰或禁用。传统的化学杀线虫剂，如：噻唑膦等也越来越受限制。因此，杀线虫剂面临着种类减少的问题，然而世界范围内频繁发生的植物线虫危害导致杀线虫剂的市场价值逐年上升，在2020年约为14亿美元，因此农业生产中急需安全高效的防治根结线虫的新型药剂。目前，采用天然产物诱导植物抗线虫作用是防控根结线虫病的一个重要的方向。
4.采用诱抗性是防控植物根结线虫病的新型策略，植物的诱导抗性日益受到人们的重视。诱导抗性具有广谱性、持久特性的特点。由于诱导抗性是一种植物自身免疫反应，它的表达可能受到许多因素的影响，包括环境、基因型、作物营养和植物种类等。因此，研究一种可用于番茄的诱抗剂，以使得抗根结线虫具有重要的研究意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种番茄诱抗剂及其在提高番茄抗根结线虫病作用中的应用，番茄诱抗剂通过诱导番茄自身免疫相关基因，提高番茄抗性，实现对根结线虫病的防控，避免使用化学物质对环境造成的污染。
6.根据本技术的一个方面，提供了一种丁酸甲酯在诱导番茄对根结线虫抗性中的应用。
7.进一步的，所述根结线虫选自北方根结线虫或南方根结线虫。
8.根据本技术的另一个方面，还提供了一种丁酸甲酯在提高番茄抗性相关基因的表达量的应用。
9.进一步的，所述番茄抗性相关基因选自lepr1、lepr2、lepod和lelox基因的至少一种。
10.进一步的，所述番茄抗性相关基因的表达量为番茄抗性相关基因的mrna水平的表达量或番茄抗性相关基因的蛋白质水平的表达量。
11.根据本技术的另一个方面，还提供了一种番茄诱抗剂，所述诱抗剂包含丁酸甲酯。
12.在一些具体实施方案中，所述诱抗剂包含丁酸甲酯和乙醇，所述丁酸甲酯和乙醇的质量比为1：1～10。
13.丁酸甲酯(mb)及乙醇(ea)均是一种具有挥发性的小分子化合物，存在于植物果实中，可以作为一种香味添加剂。同时一些微生物代谢也可以产生丁酸甲酯及乙醇。在研究中我们发现丁酸甲酯及乙醇在高浓度下具有杀线虫活性，同时在低浓度下可以诱导番茄产生诱导抗性，从而抵御根结线虫的危害，因此研发了一种番茄诱抗剂及其在诱导番茄产生抗性防御根结线虫危害的应用。
14.在一些优选实施方案中，所述丁酸甲酯和乙醇的质量比为1：2～5；优选的，所述丁酸甲酯和乙醇的质量比为1：3。
15.在一些具体实施方案中，所述诱抗剂的配置方法为：称取1000μg的丁酸甲酯液体、3000μg的乙醇液体，混合均匀，移至100ml的棕色容量瓶中用清水定容，震荡均匀即可使用。由于丁酸甲酯及乙醇具有挥发性，配置的溶液要现用现配，避免挥发降解。
16.根据本技术的另一个方面，还提供了所述的番茄诱抗剂在诱导番茄对根结线虫的抗性中的应用。
17.在一些具体实施方案中，所述应用时，番茄处于真叶期，番茄诱抗剂的浓度为10～500μg/ml。具体的使用方法包括：在番茄苗生长到第2片真叶展开时，将配置好的10～500μg/ml番茄诱抗剂溶液采用灌根方法注入根际土壤，用量为15ml/株,7d后再用一次。
18.本发明的有益效果为：
19.1、本发明首次提出了丁酸甲酯在诱导番茄对根结线虫抗性中的应用，丁酸甲酯时生物天然产物，对植物及环境无害，通过激发植物自身免疫反应，提高番茄及番茄抗性防御根结线虫的侵染，从而有助于实现番茄根结线虫病的绿色防控。
20.2、本发明提供的番茄诱抗剂，在番茄上具有良好的诱抗效果，处理后番茄抗病相关基因lepr1、lepr2、lepod、lelox显著上调表达，同时对诱导番茄防御根结线虫病效果达到了51.8％，具有显著的防治效果，而且该诱抗剂使用方法简便。
21.3、本发明中番茄诱抗剂在诱导番茄对根结线虫抗性中的应用，该应用有助于实现番茄根结线虫病的绿色防控；同时保障蔬菜的高产、安全、无公害生产，解决农药超量残留等问题，具有巨大的应用潜力，适于农业生产需求。
附图说明
22.图1分根法检测诱抗剂的处理示意图；
23.图2诱抗剂处理诱导番茄抗性基因的表达特征结果。
具体实施方式
24.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
25.下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.本发明以2片真叶展开时的番茄为试验对象，番茄品种为“丽春”。mb及ea购买于北京华威锐科化工有限公司。其纯度≥99％。1.8％阿维菌素产自北京绿色农业科技公司，购于市场。根结线虫来自于中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害课题组。
27.一种番茄诱抗剂中包含丁酸甲酯(mb)及乙醇(ea)。
28.所述mb及ea的质量为1:1～10，优选质量比为1:2～5，更优选质量比为1:3，该诱抗剂的使用浓度为50
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500μg/ml，优选浓度为20～100μg/ml。
29.所述诱抗剂的配置方法为：称取1000μg的mb液体、3000μg的ea液体，混合均匀，移至100ml的棕色容量瓶中用清水定容，震荡均匀即可使用。由于mb及ea具有挥发性，配置的溶液要现用现配，避免挥发降解。
30.实施例1分根法检测诱抗剂对番茄抗性相关基因表达的诱导作用
31.将1片真叶期的“丽春”番茄苗移栽到分根装置中，分根装置由两个相邻的方形培养钵(7
×7×
8cm)组成，如图1所示；基质由草炭土和蛭石(2:1，v/v)组成，移栽时，将根系等分为两部分，分别置于两个方形钵中，于25℃的温室生长。在番茄苗第二片真叶期完全展开时进行试验，在左侧钵中注入20μg/ml的诱抗剂溶液15ml。分别在0h、2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h时取右侧培养钵中的根系样品。每个时间点处理5株.重复3次。取样时，用水轻轻冲洗番茄根系，去除根系上粘附的基质等，将根系放入液氮研磨，采用全式金一步法反转录qpcr试剂盒(green one
‑
step qrt
‑
pcr supermix)，提取番茄根系rna，反转录成cdna，进行qpcr(bio
‑
rad cfx96)。每个时间点取样5株，重复3次。检测番茄抗性相关基因lepr1(番茄病程相关蛋白1)、lepr2(番茄病程相关蛋白2)、lepod(番茄过氧化物酶)、lelox(番茄脂氧合酶)的表达特征，以leactin(番茄肌动蛋白)基因为内参(表1)，使用
△△
ct法计算抗性基因的相对表达量。
32.qpcr结果如图2所示，由图2可知，在采用诱抗剂处理以后，番茄抗性基因lepr1的表达量迅速增加，在12h时达到高峰，为对照(0h)的109.6倍，并在24
‑
48h内一直保持相对平稳的状态(101.7、92.6、98.4倍)，在72h时表达量开始下降(52.9倍)。在处理后，番茄抗性基因lepr2的表达量表现为稳定的逐步增加，在72h时达到高峰，为对照(0h)的111.7倍。番茄lepod基因在24h时表达量迅速提升，在36h时达到高峰，为对照(0h)的126.7倍，随后48
‑
72h有所降低(82.0、92.7)，但是仍然保持在80倍以上，处于较高水平。在处理后，番茄抗性相关基因lelox的表达量前期(2
‑
36h)表现为稳定的逐步增加，中间略有波动，在48h时开始显著提升(63.6倍)，在72h时达到高峰，为对照(0h)的72.6倍。通过qpcr结果可以看出，在诱导剂处理后，4个抗性相关基因都不同程度的显著提高，lepr1及lepod表达较快，分别在12h、36h达到高峰，而lepr2及lelox表达相对较慢，分别在72h达到峰值，但是lelox的表达量显著低于其他三个基因的表达水平。lepr1、lepr2、lepod三个基因的表达与水杨酸(sa)信号调控的获得性抗性紧密相关，而lox表达则与茉莉酸(ja)信号通路调控的免疫反应相关，这说明在诱抗剂处理后，首先快速激活了番茄的sa信号通路，然后是ja信号通路，两个信号通路共同调控番茄免疫反应，研究结果进一步证实了诱抗剂可以激活番茄的免疫抗性。
33.表1抗性相关基因表达检测基因及引物
[0034][0035]
实施例2分根法检测诱抗剂对番茄抗根结线虫病作用
[0036]
采用分根法测试诱导后番茄抗性对根结线虫的防御作用，将一叶期“丽春”番茄苗移栽到分根装置中，分根装置由两个相邻的方形培养钵(7
×7×
8cm)组成(图1)，基质由草炭土和蛭石(2:1，v/v)组成，移栽时，将根系等分为两部分，分别置于两个方形钵中，于25℃的温室生长。在番茄苗第2片真叶完全展开时进行试验，在左侧钵中距离番茄苗主根大约2
‑
3cm处，将移液器的塑料枪头轻轻插入育苗基质中，深度约为1cm，然后注入诱抗剂溶液15ml，分别试验设置的处理浓度分别为1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和500μg/ml，在处理2d时在右侧钵中接种根结线虫，每钵接种量为300条/株。对照为清水模拟处理。同时以阿维菌素单钵处理作为对照，具体操作为，将番茄种植在培养钵中(7
×7×
8cm)，每钵1株苗，处理10盆，重复3次，将1.8％阿维菌素乳油用清水稀释1000倍，每株用量为15ml。在接种线虫7d后，各处理再用me溶液处理一次。接种线虫30天后，对根系上的根结数进行统计分析，根据公式1确定me诱导抗性效果。
[0037]
在接种线虫30d后，轻轻冲洗掉根系上的基质土壤，检测根系上的根结数量，通过表2结果可看出，清水对照的根结数量为131.6个/株，而1μg/ml的处理中根结数量为127.1个/株，没有显著差异(表2)。10μg/ml处理中根结数量显著减少，防效达到39.1％。在20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和500μg/ml处理后番茄对根结线虫的抗性效果显著提高，分别达到了47.0％、48.6％、51.2％、51.8％。试验中，阿维菌素的防控效果达到了80.1％。通过数据方差分析说明20
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100μg/ml的诱抗剂浓度是诱导番茄抗根结线虫较为稳定且经济有效的浓度，适合作为诱抗剂使用。
[0038][0039]
表2 me诱导番茄抗根结线虫病盆栽效果
[0040][0041]
实施实3在番茄上应用诱抗剂防控根结线虫病
[0042]
将“丽春”番茄种植在培养钵中(9
×9×
10cm)，每钵1株苗，当第2片真叶时，在每个植株的根际土壤中注入的20μg/ml me溶液15ml，在处理后2天，每钵接种根结线虫量为300条/株。对照为清水模拟处理。试验中将1.8％阿维菌素乳油用清水稀释1000倍，作为阳性对照处理，每株用量为15ml。每种处理由10个盆组成，重复3次。在me处理中，接种线虫7d后，再用me溶液处理一次。接种线虫30天后，对番茄根系上的根结数进行统计分析，确定诱抗剂的效果，结果见表3。由表3的结果可看出，在20μg/ml诱抗剂处理后，平均根结数量为71.8个/株，清水对照的数量为140.9个/株，诱导抗性的防治效果达到了49.0％。试验中，阿维菌素的防控效果达到了82.6％。将本次试验结果与实施例2的分根诱导抗性防治结果及阿维菌素效果(47.0％、80.1％)进行对比，两组数据间差异不显著，说明20μg/ml诱抗剂在番茄上应用效果稳定，可以用于防控番茄根结线虫病。
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表3诱抗剂防控根结线虫病盆栽效果
[0044][0045]
以上对本发明所提供的一种番茄诱抗剂及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。