新人工核酸、其制造方法及用途与流程

新人工核酸、其制造方法及用途
【技术领域】
1.本发明涉及新人工核酸、其制造方法及用途等。


背景技术：

2.寡核苷酸是天然dna或天然rna或人工核酸的短的序列，已知对于通过在各种各样的基因的转录及翻译水平调节基因的表达，或检查基因的序列状况来治疗或诊断特定的疾病非常有用。
3.调节基因的表达或检查－诊断基因信息的方法可由目标对象大分为两种。第一，如信使rna(mrna)或微rna(mirna)一样，目标对象是单链rna或单链dna的情况，第二，目标对象是双链基因组dna的情况。
4.在目标对象是单链rna或单链dna时，能由寡核苷酸与单链rna或单链dna互补结合而形成双链的反义法抑制基因的翻译过程(或者基因诊断)。另外，在寡核苷酸是双链rna分子时，与寡核苷酸的目标mrna的互补的结合由risc复合体的“剪切刀”酶引起目标mrna的分解(rna干涉法)。在rna干涉法的情况中，寡核苷酸可为可与目标mrna的3'utr区域(3'非翻译区域)结合而由不完全的互补性的效力抑制目标mrna的翻译的与内源性微rna同等的寡核苷酸(微rna模拟物)。
5.寡核苷酸例如，通过与长的反义非编码rna互补结合，或通过抑制互补的微rna，可诱导基因的活化或这的转录的增加、作为结果而也可增加微rna的目标mrna的翻译(反义微rna)。
6.在目标对象是双链基因组dna时，有寡核苷酸与双链基因组dna相互作用(结合)而调节(控制)基因的表达的方法。
7.图1是与非专利文献1的图5相对应的附图，显示寡核苷酸向双链基因组dna的结合样式。上述方法可由结合样式的差异区分为两种类。一个是寡核苷酸通过hoogsteen型氢键或逆hoogsteen型氢键结合于双链基因组dna的“外侧”而形成三重链而调节基因表达的反义基因法(图1的a)。另一个是通过寡核苷酸将基因组dna的双链部分解开，寡核苷酸链侵入而与成为单链的dna再形成watson
‑
crick型氢键而调节基因表达的链侵入法(图1的b～d)。
8.在作为在调节基因的表达或检查－诊断基因信息的方法中使用的功能性材料的寡核苷酸中，要求与目标核酸的序列特异性优良的结合亲和性或对于分解酶的强的抵抗性或生物体内的安全性等的特性。天然原料的dna或rna缺乏对分解酶的抵抗性，结合亲和性也不充分，作为功能性原料不适。因此，旨在寡核苷酸的高功能化而至今开发了大量的人工核酸。
9.作为其代表性的，可举与肽核酸(pna)、交联结构型核酸、吗啉代核酸(pmo)一同，将核酸的磷酸二酯部的非结合氧原子一个用硫原子取代的硫代磷酸酯型核酸(ps寡)等。
10.作为上述交联结构型核酸的代表例，举lna(下述结构式1)、bna
nc
(下述结构式2)、ena(下述结构式3)。
11.【化1】
[0012][0013]
证实这些交联结构型核酸经watson
‑
crick型氢键而对于单链rna以序列高选择性地结合的能力优良(专利文献1～3)。这样以往的人工核酸作为控制特定基因的表达或以高灵敏度高精度验证－诊断基因序列的功能性原料利用。
[0014]
但是，在寡核苷酸的用途的多样化推进之中既开发的人工核酸的功能性中尚留有改善的余地，要求旨在进一步的的高功能化的新人工核酸的开发。
[0015]
【现有技术文献】
[0016]
【专利文献】
[0017]
专利文献1：美国专利申请公开第2003/105309号说明书
[0018]
专利文献2：美国专利申请公开第2007/167387号说明书
[0019]
专利文献3：美国专利申请公开第2003/207841号说明书
[0020]
【非专利文献】
[0021]
非专利文献1：acc.chem.res.1999,32,624～630页
[0022]
【发明的概要】
[0023]
【发明要解决的课题】
[0024]
本发明的目的在于提供对于各种各样的基因组技术有用的新人工核酸、它们的制造方法及用途等。
[0025]
【用于解决课题的手段】
[0026]
本发明人为了达成上述课题而经锐意探讨的结果发现，使任选有取代基的氨基经指定的接头结合于上述结构式2所表示的bna
nc
的氮原子上的人工核酸共具对于单链dna的序列高选择性而强固的结合能、及优良的分解酶抗性能。另外，本发明人发现，上述人工核酸对于反义法、反义基因法(含链侵入法)等、各种各样的基因组技术有用。本发明人基于涉及的见解而重复进一步探讨，从而完成本发明。
[0027]
本发明包含以下的实施方式。
[0028]
项1.
[0029]
下述式(1)所表示的化合物或其盐：
[0030]
【化2】
[0031][0032]
(式中，
[0033]
base是任选有取代基的芳香族杂环基、或者任选有取代基的芳香族烃环基，
[0034]
a1是直链亚烷基，
[0035]
a2是单键或亚烷基，
[0036]
x是任选有取代基的亚烷基、或者此亚烷基中的至少1个亚甲基被置换为
‑
n(r
x
)
‑
(式中，r
x
是氢原子或烷基)、
‑
o
‑
、或者
‑
s(＝o)
k
‑
(式中，k是0、1、或者2)的基团，r1及r2相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基、或者任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，或者，r1及r2与邻接的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同，形成任选有取代基的环，
[0037]
r3是任选有取代基的氨基)。
[0038]
项2.
[0039]
a1是亚甲基，并且，a2是单键的，项1所述的化合物或其盐。
[0040]
项3.
[0041]
x是
‑
c
n
h
2n
‑
(式中，n是1～10的整数)的，项1或2所述的化合物或其盐。
[0042]
项4.
[0043]
项1～3之任一项所述的化合物或其盐，其中
[0044]
r3是下述式(a)所表示的基团：
[0045]
【化3】
[0046][0047]
(式中，r
3a
及r
3b
相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或者氨基的保护基，或者，r
3a
及r
3b
与邻接的氮原子一同，形成任选有取代基的环)，或者r3是下述式(b)所表示的基团：
[0048]
【化4】
[0049]
[0050]
(式中，r
3c
～r
3f
相同或不同，是氢原子、烷基、或者氨基的保护基)。
[0051]
项5.
[0052]
项4所述的化合物或其盐，其中
[0053]
在式(a)中，r
3a
及r
3b
相同或不同，是氢原子、烷基、芳基、芳烷基、或者氨基的保护基，或者，r
3a
及r
3b
与邻接的氮原子一同，形成任选作为取代基而具有烷基的5～10元的含氮脂肪族杂环，
[0054]
在式(b)中，r
3c
～r
3f
相同或不同，是氢原子、或者氨基的保护基。
[0055]
项6.
[0056]
项1～5之任一项所述的化合物或其盐，其中
[0057]
r1及r2相同或不同，是氢原子、任选作为取代基而具有烷氧基的烷基、任选作为取代基而具有烷氧基的芳基、任选作为取代基而具有烷氧基的芳烷基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、式：
‑
si(r4)3(式中，各r4相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团、式：
‑
p(r5)(r6)(式中，r5及r6相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基、或者烷基氨基)所表示的基团、二羟基亚膦酰基、或者羟基巯基亚膦酰基，或者，
[0058]
r1及r2与邻接的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同，形成任选作为取代基而具有烷基的6～10元的脂肪族杂环。
[0059]
项7.
[0060]
base是任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基、任选有取代基的2
‑
氧代
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基、任选有取代基的嘌呤
‑9‑
基、或者任选有取代基的6
‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基的，项1～6之任一项所述的化合物或其盐。
[0061]
项8.
[0062]
下述式(1a)～(1c)之任一者所表示的，项1～7之任一项所述的化合物或其盐：
[0063]
【化5】
[0064][0065]
[式中，
[0066]
r
3a'
及r
3b'
相同或不同，是氢原子、烷基、或者氨基的保护基，
[0067]
z是单键、氧原子、s(＝o)
m
(式中，m是0、1、或者2)、c(r
13
)(r
14
)(式中，r
13
及r
14
相同或不同，是氢原子或烷基)、或者nr
15
(式中，r
15
是氢原子、烷基、或者氨基的保护基)，
[0068]
r
3c'
～r
3f'
相同或不同，是氢原子、或者氨基的保护基，base、r1、及r2与上述的含义相同]。
[0069]
项9.
[0070]
制造项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐的方法，其包括：
[0071]
(i)使下述式(2a)所表示的化合物与式(3a)：l1‑
x
‑
r3(式中，l1是脱离基，x及r3与上述的含义相同)所表示的化合物反应的工序：
[0072]
【化6】
[0073][0074]
(式中，base、a1、a2、r1、及r2与上述的含义相同)
[0075]
、或者
[0076]
(ii)使下述式(2b)所表示的化合物与式(3b)：r3‑
h(式中，r3与上述的含义相同)所表示的化合物反应的工序：
[0077]
【化7】
[0078][0079]
(式中，l2是脱离基，base、a1、a2、x、r1、及r2与上述的含义相同)。
[0080]
项10.
[0081]
项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中，r3是任选被氨基的保护基保护的氨基的化合物或其盐的制造的方法，所述方法包括：
[0082]
(iiia)使下述式(2b)所表示的化合物与叠氮化物盐反应：
[0083]
【化8】
[0084][0085]
(式中，l2是脱离基，base、a1、a2、x、r1、及r2与上述的含义相同)，得到下述式(1j)所表示的化合物的工序：
[0086]
【化9】
[0087][0088]
(式中，base、a1、a2、x、r1、及r2与上述的含义相同)，
[0089]
(iiib)使式(1j)所表示的化合物与下述式(3c)所表示的化合物反应之后，由水解得到下述式(1l)所表示的化合物的工序：
[0090]
【化10】
[0091][0092]
(式中，r
3g
～r
3i
相同或不同，是烷基或芳基)，
[0093]
【化11】
[0094][0095]
(式中，base、a1、a2、x、r1、及r2与上述的含义相同)、及
[0096]
(iiic)根据需要，保护式(1l)所表示的化合物的氨基的工序。
[0097]
项11.
[0098]
项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中r3是下述式(b)所表示的基团的化合物或其盐的制造方法：
[0099]
【化12】
[0100][0101]
(式中，r
3c
～r
3f
相同或不同，是氢原子、烷基、或者氨基的保护基)，
[0102]
所述方法包括使项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中r3是氨基的化合物胍基化的工序。
[0103]
项12.
[0104]
项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中base是下述式(1k')或(1q')所表示的化合物或其盐的制造方法：
[0105]
【化13】
[0106][0107]
(式中，q1是氢原子或取代基，q2及q3相同或不同，是氢原子或氨基的保护基(但是，q2及q3不同时是氢原子))，
[0108]
所述方法包括：(vib)项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中，使base是下述式(1p')所表示的化合物与氨反应的工序：
[0109]
【化14】
[0110][0111]
(式中，环g是5元或6元的含氮杂环，q1与上述的含义相同)。
[0112]
项13.
[0113]
还包括(vic)将由工序(vib)的反应得到的化合物用氨基的保护基保护的工序的，项12所述的方法。
[0114]
项14.
[0115]
项1所述的式(1)所表示的化合物或其盐之中base是下述式(1r')或(1s')所表示的化合物或其盐的制造方法：
[0116]
【化15】
[0117][0118]
(式中，q4～q7相同或不同，是氢原子或氨基的保护基)
[0119]
所述方法包括：
[0120]
项1所述的式(1)所表示的化合物之中，使base是下述式(1o')所表示的化合物或其盐与下述式(3e)或(3f)所表示的化合物反应的工序：
[0121]
【化16】
[0122][0123]
(式中，q1是氢原子或取代基)
[0124]
【化17】
[0125][0126]
(式中，q4～q7与上述的含义相同)。
[0127]
项15.
[0128]
具有下述式(4)所表示的单元的寡核苷酸或其盐：
[0129]
【化18】
[0130][0131]
(式中，
[0132]
base是任选有取代基的芳香族杂环基、或者任选有取代基的芳香族烃环基，
[0133]
a1是直链亚烷基，
[0134]
a2是单键或亚烷基，
[0135]
x是任选有取代基的亚烷基、或者此亚烷基中的至少1个亚甲基被置换为
‑
n(r
x
)
‑
(式中，r
x
是氢原子或烷基)、
‑
o
‑
、或者
‑
s(＝o)
k
‑
(式中，k是0、1、或者2)的基团，r3是任选有取代基的氨基)。
[0136]
项16.
[0137]
在检查试样中检测目标核酸的方法，其包括：
[0138]
(i)将含上述目标核酸的目标部位的碱基序列由使用夹核酸的核酸扩增法，选择性地扩增的工序，其中上述夹核酸是项15所述的寡核苷酸或其盐、及
[0139]
(ii)检测上述被扩增的碱基序列的工序。
[0140]
项17.
[0141]
用于检测检查试样中的目标核酸，或选择性地扩增检查试样中的含目标核酸的目标部位的碱基序列的组合物，其中
[0142]
(a)上述组合物含引物及探针，该引物及探针之中至少任一方是项15所述的寡核苷酸或其盐，
[0143]
(b)上述组合物含正向引物、反向引物及探针，该正向引物、反向引物及探针之中至少任一方是项15所述的寡核苷酸或其盐，或者，
[0144]
(c)上述组合物含夹核酸及引物，该夹核酸及引物之中至少任一方是项15所述的寡核苷酸或其盐。
[0145]
项17a.
[0146]
项15所述的寡核苷酸或其盐用于使用引物及探针检测检查试样中的目标核酸的用途，其中上述寡核苷酸或其盐是上述引物及探针之中至少任一方。
[0147]
项17b.
[0148]
项15所述的寡核苷酸或其盐用于将检查试样中的目标核酸使用正向引物、反向引物及探针进行检测的用途，其中上述寡核苷酸或其盐是上述正向引物、反向引物及探针之中至少任一方。
[0149]
项17c.
[0150]
项15所述的寡核苷酸或其盐用于使用夹核酸及引物选择性地扩增检查试样中的含目标核酸的目标部位的碱基序列的用途，其中上述寡核苷酸或其盐是上述夹核酸及引物之中至少任一方。
[0151]
项18.
[0152]
用于向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的组合物，其含有对于上述目标部位的碱基序列具有互补的碱基序列的项15所述的寡核苷酸或其盐。
[0153]
项18a.
[0154]
项15所述的寡核苷酸或其盐用于向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的用途，其中上述寡核苷酸或其盐对于上述目标部位的碱基序列具有互补的碱基序列。
[0155]
项19.
[0156]
向单离的双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的方法，其包括将对于上述目标部位的碱基序列具有互补的碱基序列的项15所述的寡核苷酸或其盐和上述双链dna混合的工序。
[0157]
项20.
[0158]
项19所述的方法，其中
[0159]
上述工序是：(i)将上述寡核苷酸或其盐和上述双链dna在单链dna结合蛋白质的存在下混合的工序，或(ii)将上述寡核苷酸或其盐和上述双链dna在单链dna结合蛋白质的非存在下混合的工序，
[0160]
上述工序是(ii)之时，还包括对混合物进行加热的工序、或者将混合物维持在25～75℃的工序。
[0161]
项21.
[0162]
含有项1～8之任一项所述的化合物或其盐、或者，项15所述的寡核苷酸或其盐的医药组合物。
[0163]
再者，在本说明书中引用的文献的公开通过参照以其整体整合到本说明书。
[0164]
【发明的效果】
[0165]
根据本发明，可提供对于各种各样的基因组技术有用的新人工核酸。
[0166]
【附图的简单的说明】
[0167]
【图1】图1与非专利文献1的图5相对应的附图，是显示寡核苷酸向双链基因组dna的结合样式。
[0168]
【图2】图2是显示消化酶的反应时间和未消化寡核苷酸的残留率的关系的坐标图。
[0169]
【图3】图3是显示pcr的循环数和δrn(荧光强度)的关系的坐标图。
[0170]
【图4】图4是对于pna确认在记载在chem.commun.,2009,1225
‑
1227的条件下发生链侵入的图。
[0171]
【图5】图5是对于本发明的寡核苷酸显示在记载在chem.commun.,2009,1225
‑
1227的条件下发生链侵入的图。
[0172]
【图6】图6是对于本发明的寡核苷酸显示在指定的温度条件下发生链侵入的图。
[0173]
【图7】图7是对于本发明的寡核苷酸显示由1碱基的相异抑制链侵入的图。
[0174]
【图8】图8是对于本发明的寡核苷酸显示在指定的温度条件下发生链侵入的图。
[0175]
【图9】图9是对于本发明的寡核苷酸显示在指定的温度条件下发生链侵入的图。
[0176]
【图10】图10是显示通过使用2种以上本发明的寡核苷酸来增强链侵入的图。
[0177]
【图11】图11是显示用于检测本发明的检查试样中的目标核酸的试剂盒的例的图。
【具体实施方式】
[0178]
【用语的定义】
[0179]
在本说明书中，“烷基”是指从直链或支链状的饱和烃除1个氢原子的一价的基团。烷基的碳原子的数不特别限定，例如1～20、优选1～10、再优选1～6、特别优选为1～4。
[0180]
作为烷基的例，举甲基、乙基、丙基(例：n
‑
丙基、i
‑
丙基)、丁基(例：n
‑
丁基、i
‑
丁基、s
‑
丁基、t
‑
丁基)、戊基(例：n
‑
戊基、i
‑
戊基、新戊基)、己基、庚基、辛基(例：n
‑
辛基、2
‑
乙基己基)、壬基、癸基。
[0181]
在本说明书中，“亚烷基”是指从直链或支链状的饱和烃除2个氢原子的二价的基团。
[0182]
亚烷基的碳原子的数不特别限定，例如1～10、优选1～8、再优选为1～6。
[0183]
作为亚烷基的例，举c1亚烷基(例：亚甲基)、c2亚烷基(例：甲基亚甲基、二亚甲基)、c3亚烷基(例：三亚甲基、二甲基亚甲基)、c4亚烷基(例：四亚甲基)、c5亚烷基(例：五亚甲基)、c6亚烷基(例：六亚甲基)。
[0184]
在本说明书中，“烯基”是指直链或支链状，从含碳
‑
碳双键的不饱和烃除1个氢原子的一价的基团。
[0185]
烯基的碳原子的数不特别限定，例如2～20、优选2～10、再优选为2～6。
[0186]
作为烯基的例，举乙烯基(即，乙烯基)、丙烯基(例：1
‑
丙烯基、烯丙基)、丁烯基、戊烯基、己烯基、牻牛儿基、法呢基。
[0187]
在本说明书中，“炔基”是指直链或支链状，从含碳
‑
碳三键的不饱和烃除1个氢原子的一价的基团。
[0188]
炔基的碳原子的数不特别限定，例如2～20、优选2～10、再优选为2～6。
[0189]
作为炔基的例，举乙炔基、炔丙基、1
‑
丁炔基。
[0190]
在本说明书中，“环烷基”是指来源于饱和脂肪族烃环的一价的基团。
[0191]
环烷基的碳原子的数不特别限定，例如3～20、优选5～12、再优选为5～10。
[0192]
作为环烷基的例，举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、正冰片基、金刚烷基。
[0193]
在本说明书中，“环烯基”是指来源于含碳
‑
碳双键的不饱和脂肪族烃环的一价的基团。
[0194]
环烯基的碳原子的数不特别限定，例如3～20、优选5～12、再优选为5～10。
[0195]
作为环烯基的例，举环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、降菠烯基、金刚烯基。
[0196]
在本说明书中，“芳香族烃环基”是指来源于芳香族烃环的一价的基团，也称为“芳基”。
[0197]
芳香族烃环的构成原子的数不特别限定，例如6～20、优选6～14、再优选6～12、特别优选为6～10。
[0198]
芳香族烃环可为单环，也可为缩合环(例：二～三环式缩合环)。
[0199]
作为芳香族烃环基的例，举苯基、茚基、萘基、芴基、菲基、蒽基。
[0200]
在本说明书中，“杂环”以包含“脂肪族杂环”及“芳香族杂环”的含意使用。
[0201]
在本说明书中，“脂肪族杂环”是指作为环的构成原子而含选自碳原子、及，氮原子、氧原子、硫原子、硅原子等的至少一个杂原子的脂肪族环。
[0202]
脂肪族杂环的构成原子的数不特别限定，例如5～20、优选5～12、再优选为6～10。
[0203]
脂肪族杂环的构成原子之中，杂原子的数不特别限定，例如是1～4。
[0204]
作为脂肪族杂环的例，可举出含有含氧脂肪族杂环(例：四氢呋喃、二氧杂环戊烷、吡喃、四氢吡喃、二噁烷)、含硫脂肪族杂环(例：四氢噻吩、硫代吡喃、四氢硫代吡喃)、含氮脂肪族杂环(例：吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷)、含氮及氧脂肪族杂环(例：吗啉)、含氮及硫脂肪族杂环(例：硫代吗啉)、硅氧烷结合的脂肪族杂环。
[0205]
在本说明书中，“芳香族杂环”是指作为环的构成原子而含选自碳原子、及，氮原子、氧原子、硫原子等的至少一个杂原子的芳香族环。
[0206]
芳香族杂环的构成原子的数不特别限定，例如5～20、优选5～12、再优选为6～10。芳香族杂环的构成原子之中，杂原子的数不特别限定，例如是1～4。
[0207]
芳香族杂环可为单环，也可为缩合环(例：二～三环式缩合环)。
[0208]
作为芳香族杂环的例，举含氧芳香族杂环(例：呋喃、苯并呋喃、异苯并呋喃、色原烷、苯并吡喃、呫吨)、含硫芳香族杂环(例：噻吩、噻蒽)、含氮芳香族杂环(例：吡咯、咪唑、吡唑、三唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚、异吲哚、吲哚赖氨酸、嘌呤、喹啉、异喹啉、1,8
‑
萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、酞嗪、蝶啶、咔唑、菲啶、吖啶、啶、吩嗪)、含氧及硫芳香族杂环(例：吩噁)、含氮及氧芳香族杂环(例：噁唑、异噁唑、呋咱、吩噁嗪)、含氮及硫芳香族杂环(例：噻唑、异噻唑、吩噻嗪)。
[0209]
在本说明书中，“杂环基”是指从上述杂环除1个氢原子的一价的基团。
[0210]
在本说明书中，“任选有取代基的”或“任选被取代基取代”以不具有取代基的情况，及，代替任意的氢原子而含具有1个取代基、或者2个以上的同种或异种的取代基的情况的两方的含意使用。再者，在具有取代基时，取代基的数不特别限定，例如1～3、优选为1或
2。
[0211]
在本说明书中，“取代基”是指代替氢原子的原子或原子团。作为取代基的例，举卤素原子(例：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、氧代基(＝o)、硫代基(＝s)、羟基、巯基、氨基、羧基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、芳基、炔基、酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氰基、杂环基、这些2种以上的组合(例：卤代烷基、氰基烷基、芳烷基、烷氧基、烷基氨基)。
[0212]
再者，“2种以上的组合”包含作为各自的取代基而例示的基团的任意的组合。
[0213]
在本说明书中，“cx
‑
y”是指后续的基团的碳原子的数是x以上y以下。x及y是正的整数，x＜y。
[0214]
在本说明书中，“卤代烷基”是指被1个或2个以上的同种或异种的卤素原子取代的烷基。
[0215]
卤代烷基的适宜的例是c1‑6卤代烷基，更适宜的例是c1‑4卤代烷基，再者适宜的例是三氟甲基、三氯甲基、或者2,2,2
‑
三氟乙基。
[0216]
在本说明书中，“氰基烷基”是指被1个或2个以上的氰基取代的烷基。
[0217]
氰基烷基的适宜的例是c1‑6氰基烷基，更适宜的例是c1‑4氰基烷基，再者适宜的例可举出氰基甲基或2
‑
氰基乙基。
[0218]
在本说明书中，“芳烷基”是指被1个或2个以上的同种或异种的芳基取代的烷基。芳烷基的适宜的例是c6‑
14
芳基c1‑4烷基，更适宜的例是苯基甲基(即，苄基)、苯基乙基(即，苯乙基)、萘基甲基、萘基乙基、三苯基甲基(即，三苯甲基)、或者芴基甲基。
[0219]
在本说明书中，“烷氧基”是指式：
‑
o
‑
烷基所表示的基团。
[0220]
烷氧基的适宜的例是c1‑6烷氧基，更适宜的例是甲氧基、乙氧基、丙氧基(例：n
‑
丙氧基、i
‑
丙氧基)、或者丁氧基(例：t
‑
丁氧基)。
[0221]
再者，卤代烷氧基、及，氰基烷氧基是指各自，式：
‑
o
‑
卤代烷基所表示的基团、及，式：
‑
o
‑
氰基烷基所表示的基团。
[0222]
在本说明书中，“烷硫基”是指式：
‑
s
‑
烷基所表示的基团。烷硫基的适宜的例是c1‑6烷硫基，更适宜的例是甲硫基、乙硫基、丙硫基(例：n
‑
丙硫基、i
‑
丙硫基)、或者丁硫基。
[0223]
再者，卤代烷硫基、及，氰基烷硫基各自是指式：
‑
s
‑
卤代烷基所表示的基团、及，式：
‑
s
‑
氰基烷基所表示的基团。
[0224]
在本说明书中，“烷基氨基”是指被1个或2个同种或异种的烷基取代的氨基。烷基氨基包含单烷基氨基及二烷基氨基。
[0225]
单烷基氨基的适宜的例是单c1‑6烷基氨基，更适宜的例是单甲基氨基、单乙基氨基、单丙基氨基(例：单(n
‑
丙基)氨基、单(i
‑
丙基)氨基)、或者单丁基氨基。
[0226]
二烷基氨基的适宜的例是二c1‑6烷基氨基，更适宜的例是二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基(例：二(n
‑
丙基)氨基、二(i
‑
丙基)氨基)、或者二丁基氨基。
[0227]
在本说明书中，“具有取代基的膦基”是指膦基(
‑
ph2)的至少1个氢原子被其他原子或原子团取代的基团。
[0228]
作为具有取代基的膦基的例，举式：
‑
p(r5)(r6)(式中，r5及r6相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基、或者烷基氨基)所表示的基团。
[0229]
在本说明书中，“任选有取代基的二羟基亚膦酰基”是指二羟基亚膦酰基(即，膦酸
基)(
‑
p(＝o)(oh)2)、或者至少1个氢原子被其他原子或原子团(例：羟基的保护基)取代的二羟基亚膦酰基。
[0230]
后者的基团包含：
[0231]
任选有取代基的，下述式所表示的基团(以下，称为“二磷酸基”)：
[0232]
【化19】
[0233]
及
[0234]
任选有取代基的，下述式所表示的基团(以下，称为“三磷酸基”)：
[0235]
【化20】
[0236][0237]
在本说明书中，“任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基”是指羟基巯基亚膦酰基(
‑
p(＝o)(oh)(sh))、或者至少1个氢原子被其他原子或原子团(例：羟基的保护基)取代的羟基巯基亚膦酰基。
[0238]
在本说明书中，“羟基的保护基”是指在化合物或其盐的合成、或者，寡核苷酸或其盐的合成中用于羟基不与反应相关的一价的基团。
[0239]
羟基的保护基例如，在酸性或中性条件下稳定，可举出可由如加氢分解、水解、电分解、及光分解一样的方法断裂的基团，但不限定于此。
[0240]
羟基的保护基的例包含任选有取代基的酰基、具有取代基的磺酰基、及具有取代基的甲硅烷基。
[0241]
在本说明书中，“酰基”是指式：
‑
c(＝o)
‑
r(式中，r是烃基)所表示的基团。r所示的烃基可为直链或支链状烃基(例：烷基)，也可为饱和或不饱和烃环基(例：环烷基、芳基)、这些的组合(例：芳烷基)。
[0242]
酰基包含烷基羰基、芳基羰基、及芳烷基羰基。
[0243]
烷基羰基的适宜的例是(c1‑
10
烷基)羰基，更适宜的例是乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰基、戊酰基、异戊酰基、辛酰基、壬酰基、或者癸酰基。芳基羰基的适宜的例是(c6‑
14
芳基)羰基，更适宜的例是苯甲酰基、或者萘甲酰基(即，α
‑
萘甲酰基、β
‑
萘甲酰基)。
[0244]
芳烷基羰基的适宜的例是(c6‑
14
芳基c1‑4烷基)羰基，更适宜的例是苄基羰基。再者，“酰基氧基”、“酰基硫代基”、及“酰基氨基”中的酰基也可例示与上述同样的基团。
[0245]
在本说明书中，“具有取代基的磺酰基”是指式：
‑
s(＝o)2r(式中，r与上述的含义相同)所表示的基团。
[0246]
具有取代基的磺酰基包含具有任选有取代基的烷基的磺酰基、及具有任选有取代基的芳基的磺酰基。
[0247]
具有烷基的磺酰基的适宜的例是c1‑6烷基磺酰基，更适宜的例是甲磺酰基或乙烷磺酰基。
[0248]
具有芳基的磺酰基的适宜的例是c6‑
14
芳基磺酰基，更适宜的例是苯磺酰基或p
‑
甲
spring harbor laboratory press,new york中记载的条件等。
[0263]
在本说明书中，“检查”是指以诊断或研究等的目的研究试样中的核酸等的受试物质。“检查试样”是指供于检查的试样。
[0264]
在本说明书中，各数值范围的上限及下限可任意地组合。
[0265]
【化合物或其盐】
[0266]
本发明的化合物或其盐是下述式(1)所表示的化合物或其盐：
[0267]
【化21】
[0268][0269]
(式中，base、a1、a2、x、r1、r2、及r3与上述的含义相同。再者，在呋喃糖的碳原子附位置编号。)
[0270]
以下，将式(n)所表示的化合物或其盐称为“化合物(n)”。
[0271]
化合物(1)在r1或r2是任选有取代基的二羟基亚膦酰基或任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基时，称为“核苷酸”，在是此外的基团时，称为“核苷”。
[0272]
base的适宜的例是任选有取代基的芳香族杂环基。
[0273]
上述芳香族杂环基含优选为的氮芳香族杂环基。
[0274]
含上述的氮芳香族杂环基优选为6～10元的含氮芳香族杂环基。上述6～10元的含氮芳香族杂环基优选为2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基、2
‑
氧代
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基、嘌呤
‑9‑
基、或者6
‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基。
[0275]
取代为上述芳香族杂环基的取代基的适宜的例是选自烷基、酰基、及任选被氨基的保护基取代的氨基的至少一种。上述取代基的数不特别限定，例如是1～3。
[0276]
base的更适宜的例是任选有取代基的胸腺嘧啶基、任选有取代基的胞嘧啶基、任选有取代基的乙酰基、或者任选有取代基的鸟嘌呤基。上述取代基优选为选自烷基、酰基、及n,n
‑
二烷基甲酰胺基的至少一种，更优选为c1‑4烷基、(c1‑4烷基)羰基、(c6‑
14
芳基)羰基、或者n,n
‑
二(c1‑4烷基)甲酰胺基。上述取代基的数优选为1～3。
[0277]
base的还适宜的例是选自下述的基团：
[0278]
2,4
‑
二氧代
‑5‑
甲基
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基(例：胸腺嘧啶
‑1‑
基)、
[0279]2‑
氧代
‑4‑
氨基
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基(即，胞嘧啶
‑1‑
基)、
[0280]2‑
氧代
‑4‑
酰基氨基
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基(即，n
‑
酰基
‑
胞嘧啶
‑1‑
基)、
[0281]2‑
氧代
‑4‑
氨基
‑5‑
甲基
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基(即，5
‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基)、
[0282]2‑
氧代
‑4‑
酰基氨基
‑5‑
甲基
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基(即，n
‑
酰基
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基)、6
‑
氨基
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基(即，腺嘌呤
‑9‑
基)、
[0283]6‑
酰基氨基
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基(即，n
‑
酰基
‑
腺嘌呤
‑9‑
基)、
[0284]2‑
氨基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基(例:鸟嘌呤
‑9‑
基)
[0285]2‑
酰基氨基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基(例:n
‑
酰基
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基)、及
[0286]2‑
(n,n
‑
二烷基甲酰胺基)氨基
‑6‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基(例：n
‑
(n,n
‑
二烷基甲酰胺基)
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基)。
[0287]
base的最适宜的例是选自下述的基团：
[0288]
胸腺嘧啶
‑1‑
基、
[0289]5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、
[0290]
n
‑
乙酰基
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、
[0291]
n
‑
异丁酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、
[0292]
n
‑
苯甲酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、
[0293]
腺嘌呤
‑9‑
基、
[0294]
n
‑
乙酰基
‑
腺嘌呤
‑9‑
基、
[0295]
n
‑
异丁酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基、
[0296]
n
‑
苯甲酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基、
[0297]
鸟嘌呤
‑9‑
基、
[0298]
n
‑
乙酰基
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、
[0299]
n
‑
异丁酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、
[0300]
n
‑
苯甲酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、及
[0301]
n
‑
(n,n
‑
二甲基甲酰胺基)
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基。
[0302]
a1是直链亚烷基(例：亚甲基、二亚甲基、三亚甲基、四亚甲基)。
[0303]
a1的适宜的例是直链c1‑4亚烷基。
[0304]
a1的更适宜的例是直链c1‑2亚烷基。
[0305]
a1的最适宜的例是亚甲基。
[0306]
a2的适宜的例是单键或直链c1‑2亚烷基(例:亚甲基、二亚甲基)。
[0307]
a2的还适宜的例是单键。
[0308]
x的适宜的例是与亚烷基、或者此亚烷基中的氮原子结合的亚甲基及与r3结合的亚甲基以外的亚甲基之中，至少1个被置换为
‑
n(r
x
)
‑
(式中，r
x
是氢原子或烷基)、
‑
o
‑
、或者
‑
s(＝o)
k
‑
(式中，k是0、1、或者2)的基团。或者，x的适宜的例是在亚烷基、或者此亚烷基中的邻接的2个碳原子间具有
‑
n(r
x
)
‑
(式中，r
x
与上述的含义相同)、
‑
o
‑
、或者
‑
s(＝o)
k
‑
(式中，k是0、1、或者2)的基团。
[0309]
x的还适宜的例是选自下述的基团：
[0310]
式：
‑
c
n
h
2n
‑
(式中，n是1～10的整数)所表示的基团、
[0311]
式：
‑
(ch2)
n1
‑
(n(r
x1
)
‑
(ch2)
n2
)
n3
‑
(式中，r
x1
是氢原子或c1‑4烷基，n1是2～10的整数，n2是2～4的整数，n3是1～5的整数，n3是2以上的整数之时，各r
x1
可互相相同，或也可不同，各n2可互相相同，也可不同)所表示的基团、
[0312]
式：
‑
(ch2)
n4
‑
(o
‑
(ch2)
n5
)
n6
‑
(式中，n4是2～10的整数，n5是2～4的整数，n6是1～5的整数，n6是2以上的整数之时，各n5可互相相同，或也可不同)所表示的基团、及
[0313]
式：
‑
(ch2)
n7
‑
(s
‑
(ch2)
n8
)
n9
‑
(式中，n7是2～10的整数，n8是2～4的整数，n9是1～5的整数，n9是2以上的整数之时，各n8可互相相同，或也可不同)所表示的基团。
[0314]
x的最适宜的例是选自下述的基团：
[0315]
式：
‑
(ch2)
n10
‑
(式中，n10是1～6的整数)所表示的基团、
[0316]
式：
‑
c2h4‑
(n(r
x2
)
‑
c2h4)
n11
‑
(式中，r
x2
是氢原子或c1‑4烷基，n11是1～5的整数，n11是2以上的整数之时，各r
x2
可互相相同，或也可不同)所表示的基团、
[0317]
式：
‑
c2h4‑
(o
‑
c2h4)
n12
‑
(式中，n12是1～5的整数)所表示的基团、及
[0318]
式：
‑
c2h4‑
(s
‑
c2h4)
n13
‑
(式中，n13是1～5的整数)所表示的基团。
[0319]
可在上述亚烷基的碳原子上任意地取代的取代基优选为卤素原子、羟基、烷氧基、巯基、烷硫基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、酰基氧基、酰基氨基、酰基硫代基。取代基的数虽取决于亚烷基的碳原子的数，例如，是1～3的整数，优选为2或3。
[0320]
r1的适宜的例是选自下述的基团：
[0321]
氢原子、
[0322]
任选有取代基的烷基、
[0323]
任选有取代基的芳基、
[0324]
羟基的保护基、
[0325]
具有取代基的膦基、
[0326]
任选有取代基的二羟基亚膦酰基、及
[0327]
任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基。
[0328]
r1所示的“任选有取代基的烷基”优选为选自卤素原子、烷氧基、及芳基的至少一种任选有取代基的烷基，更优选为任选被烷氧基取代的烷基、或者任选被烷氧基取代的芳烷基。上述取代基的数优选为1～3。
[0329]
r1所示的“任选有取代基的芳基”优选为选自卤素原子、烷基、及烷氧基的至少一种任选有取代基的芳基，更优选为任选被烷氧基取代的芳基。上述取代基的数优选为1～3。
[0330]
r1所示的“羟基的保护基”优选是烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、或者式：
‑
si(r4)3(式中，各r4相同或不同，是烷基或芳基)所表示的基团。
[0331]
r1所示的“具有取代基的膦基”优选是式：
‑
p(r5)(r6)(式中，r5及r6相同或不同，是羟基、巯基、氨基、烷氧基、卤代烷氧基、氰基烷氧基、烷硫基、卤代烷硫基、氰基烷硫基、或者烷基氨基)所表示的基团。所述基的更适宜的例是下述式所表示的膦基：
[0332]
【化22】
[0333][0334]
(式中，r
5a
及r
5b
相同或不同，是氢原子或烷基，r
6a
是氢原子、烷基、卤代烷基、或者氰基烷基)。
[0335]
r1所示的“任选有取代基的二羟基亚膦酰基”优选为二羟基亚膦酰基、二磷酸基、或者三磷酸基，更优选为二羟基亚膦酰基。这些作为取代基，可具有羟基的保护基，也可存在的羟基的全部或一部分被羟基的保护基取代。
[0336]
r1所示的“任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基”优选为羟基巯基亚膦酰基。
[0337]
r1的最适宜的例是氢原子、甲基、乙基、丙基、丁基、烯丙基、苄基、三苯甲基、甲氧基甲基、p
‑
甲氧基苄基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙酰基、异丁酰基、苯甲酰
基、甲磺酰基、p
‑
甲苯磺酰基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、t
‑
丁基二甲基甲硅烷基、t
‑
丁基二苯基甲硅烷基、下述式之任一者所表示的膦基、二羟基亚膦酰基、或者羟基巯基亚膦酰基：
[0338]
【化23】
[0339][0340]
r2的适宜的例与r1的适宜的例相同。
[0341]
r1和r2的组合的适宜的例是r1是氢原子或二甲氧基三苯甲基(例：4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基)，r2是下述式所表示的膦基的组合：
[0342]
【化24】
[0343][0344]
(式中，r
5a
及r
5b
相同或不同，是氢原子或烷基，r
6a
是氢原子、烷基、卤代烷基、或者氰基烷基)。
[0345]
在r1及r2与邻接的2个氧原子及呋喃糖的3位～5位的碳原子一同形成环时，所述环的适宜的例是任选有取代基的6～10元的脂肪族杂环，所述取代基的适宜的例是烷基。
[0346]
所述环的更适宜的例是下述式之任一者所表示的脂肪族杂环：
[0347]
【化25】
[0348][0349]
(式中，r7及r8相同或不同，是氢原子或烷基，r9～r
12
相同或不同，是烷基)。
[0350]
所述环的还适宜的例是下述式之任一者所表示的环：
[0351]
【化26】
[0352][0353]
r3的适宜的例是下述式(a)所表示的基团：
[0354]
【化27】
[0355][0356]
(式中，r
3a
及r
3b
相同或不同，是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或者氨基的保护基，或者，r
3a
及r
3b
与邻接的氮原子一同，形成任选有取代基的环)。r
3a
优选为氢原子、烷基、芳基、芳烷基、或者氨基的保护基，更优选为氢原子、烷基、或者氨基的保护基。
[0357]
r
3a
所示的“氨基的保护基”优选为(c1‑4烷基)羰基或(c1‑4卤代烷基)羰基，更优选为乙酰基或三氟甲基羰基。
[0358]
r
3b
的适宜的例与r
3a
的适宜的例相同。
[0359]
r
3a
和r
3b
的组合的适宜的例是r
3a
及r
3b
一同是氢原子的组合，r
3a
是氢原子，r
3b
是乙酰基或三氟甲基羰基的组合，r
3a
及r
3b
一同是甲基的组合，或者，r
3a
及r
3b
一同是乙酰基或三氟甲基羰基的组合。
[0360]
在r
3a
及r
3b
与邻接的氮原子一同形成环时，所述环的适宜的例是任选有取代基的5～10元的含氮脂肪族杂环，所述取代基的适宜的例是烷基或酰基。
[0361]
所述环的更适宜的例是下述式所表示的含氮脂肪族杂环：
[0362]
【化28】
[0363][0364]
[式中，z是单键、氧原子、s(＝o)
m
(式中，m是0、1、或者2)、c(r
13
)(r
14
)(式中，r
13
及r
14
相同或不同，是氢原子或烷基)、或者nr
15
(式中，r
15
是氢原子、烷基、或者酰基)]。
[0365]
所述环的还适宜的例是下述式所表示的含氮脂肪族杂环：
[0366]
【化29】
[0367][0368]
[式中，r
15
是氢原子、直链或支链状c1‑4烷基(例:甲基、乙基、丙基、丁基)、或者，(直链或支链状c1‑4烷基)羰基(例:甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、丁基羰基)]。所述环的最适宜的例是4
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基。
[0369]
r3的适宜的其他例是下述式(b)所表示的基团：
[0370]
【化30】
[0371][0372]
(式中，r
3c
～r
3f
相同或不同，是氢原子、烷基、或者氨基的保护基)。
[0373]
r
3c
～r
3f
的适宜的例是氢原子、或者氨基的保护基。
[0374]
r
3c
优选为氢原子。
[0375]
r
3d
优选为氨基的保护基，更优选为烷氧基羰基、卤代烷氧基羰基、或者氰基烷氧基羰基，特别优选为(c1‑4烷氧基)羰基、(c1‑4卤代烷氧基)羰基、或者(c1‑4氰基烷氧基)羰基。
[0376]
r
3e
优选为氨基的保护基，更优选为烷氧基羰基、卤代烷氧基羰基、或者氰基烷氧基羰基，特别优选为(c1‑4烷氧基)羰基、(c1‑4卤代烷氧基)羰基、或者(c1‑4氰基烷氧基)羰基。
[0377]
r
3f
优选为氢原子。
[0378]
r3的最适宜的例是选自下述组的基团：
[0379]
【化31】
[0380][0381]
化合物(1)的适宜的例是下述化合物(1a)～(1c)之任一者：
[0382]
【化32】
[0383][0384]
[式中，
[0385]
r
3a'
及r
3b'
相同或不同，是氢原子、烷基、或者氨基的保护基，
[0386]
z是单键、氧原子、s(＝o)
m
(式中，m是0、1、或者2)、c(r
13
)(r
14
)(式中，r
13
及r
14
相同或不同，是氢原子或烷基)、或者nr
15
(式中，r
15
是氢原子、烷基、或者氨基的保护基)，
[0387]
r
3c'
～r
3f'
相同或不同，是氢原子、或者氨基的保护基，base、r1、r2、及n与上述的含义相同]。
[0388]
化合物(1)的更适宜的例是下述化合物(1d)～(1i)之任一者：
[0389]
【化33】
[0390][0391]
(式中，base、r1、及r2与上述的含义相同)。
[0392]
上述盐可为药学上容许的盐，也可不是药学上容许的盐。上述盐可为无机盐，也可为有机盐。
[0393]
作为上述盐的例，举碱金属盐(例：钠盐、钾盐、锂盐)、碱土金属盐(例：钙盐、镁盐)、其他金属盐(例：铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐)、铵盐、四甲基铵盐、胺盐(例：t
‑
辛基胺盐、二苄基胺盐、吗啉盐、葡萄糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n
‑
甲基葡萄糖胺盐、胍盐、二乙基胺盐、三乙基胺盐、二环己基胺盐、n,n'
‑
二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n
‑
苄基
‑
苯乙基胺盐、哌嗪盐、三(羟基甲基)氨基甲烷盐)、无机酸盐(例：氟化氢酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、过氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐)、有机酸盐(例：甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、p
‑
甲苯磺酸盐、醋酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐)、氨基酸盐(例：甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐)。
[0394]
【化合物(1)的制造方法】
[0395]
化合物(1)例如，可由以下的反应方案1得到。
[0396]
【化34】方案1
[0397][0398]
(式中，l1、各l2、及l3相同或不同，是脱离基，m是碱金属或铵，r
3a
及r
3b
相同或不同，是氢原子或氨基的保护基(但是，r
3a
及r
3b
不同时是氢原子)、base、a1、a2、x、r1、r2、r3、r
3c
～r
3e
、及r
3g
～r
3i
与上述的含义相同)
[0399]
[反应方案1]
[0400]
＜工序(i)＞
[0401]
工序(i)是使化合物(2a)与式(3a)：l1‑
x
‑
r3所表示的化合物反应而得到化合物(1)的工序。
[0402]
化合物(2a)可由已知的方法、例如美国专利申请公开第2007/167387号说明书中记载的方法得到。
[0403]
在化合物(3a)中，l1所示的脱离基的例是卤素原子(例：氯原子、溴原子、碘原子)、烷基磺酰氧基(例：甲磺酰氧基)、卤代烷基磺酰氧基(例：三氟甲基磺酰氧基)、或者芳基磺酰氧基(例：甲苯磺酰氧基)。
[0404]
化合物(3a)的使用量相对于化合物(2a)1摩尔，通常，1～10摩尔、优选为3～6摩尔。
[0405]
上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0406]
作为溶剂的例，举醚系溶剂(例：四氢呋喃)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香族烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选芳香族烃系溶剂，更优选选自甲苯及二甲苯的至少一种。
[0407]
上述反应适宜地在碱基的存在下进行。
[0408]
作为碱基的例，举无机碱基[例：碱金属的碳酸盐(例：碳酸钠、碳酸铯)、碱金属的碳酸氢盐(例：碳酸氢钠)、碱土金属的碳酸盐(例：碳酸钙)、碱金属的氢氧化物(例：氢氧化钠、氢氧化钾)、碱土金属的氢氧化物(例：氢氧化钙)、金属醇盐(例：钠甲醇盐、钠乙醇盐)]、有机碱基[例：叔胺(例：三烷基胺)、环状胺(例：4
‑
(二甲基氨基)吡啶、二氮杂双环十一碳烯(dbu)、二氮杂双环壬烯(dbn))]、这些的组合。这些中，优选叔胺，更优选三c1‑4烷基胺。
[0409]
碱基的使用量相对于化合物(2a)1摩尔，通常，2～10摩尔、优选为5～8摩尔。
[0410]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限制，例如是30～150℃，优选为50～120℃。
[0411]
上述反应的反应时间不特别限定，例如1～24小时、优选为1～12小时。
[0412]
＜工序(iia)＞
[0413]
工序(iia)是使化合物(2a)与式(3a')：l2‑
x
‑
l2所表示的化合物反应而得到化合物(2b)的工序。
[0414]
在化合物(3a')中，l2所示的脱离基的例与l1同样。
[0415]
化合物(3a')的使用量相对于化合物(2a)1摩尔，通常，1～20摩尔、优选为1～5摩尔。
[0416]
上述反应可与工序(i)同样地，在溶剂及/或碱基的存在下进行。
[0417]
＜工序(iib)＞
[0418]
工序(iib)是使化合物(2b)与式(3b)：r3‑
h所表示的化合物反应而得到化合物(1)的工序。
[0419]
化合物(3b)的使用量相对于化合物(2b)1摩尔，通常，1～20摩尔、优选为1～5摩尔。
[0420]
上述反应可与工序(i)同样地，在溶剂及/或碱基的存在下进行。
[0421]
＜工序(iic)＞
[0422]
工序(iic)是使化合物(2a)与式(3a”)：l3‑
x
‑
oh所表示的化合物反应而得到化合
物(2a')的工序。
[0423]
化合物(3a”)的使用量相对于化合物(2a)1摩尔，通常，1～20摩尔、优选为1～5摩尔。
[0424]
上述反应可与工序(i)同样地，在溶剂及/或碱基的存在下进行。
[0425]
＜工序(iid)＞
[0426]
工序(iid)是将化合物(2a')的羟基变换为脱离基l2而得到化合物(2b)的工序。工序(iid)的典型的例是使化合物(2a')与卤化磺酰(例：链烷磺酸卤化物、卤代链烷磺酸卤化物、芳烃磺酸卤化物)反应的工序。由此工序，可将化合物(2a')的羟基变换为烷基磺酰氧基、卤代烷基磺酰氧基、或者芳基磺酰氧基。
[0427]
卤化磺酰的使用量相对于化合物(2a')1摩尔，通常，0.5～5摩尔、优选为1～2摩尔。
[0428]
上述反应可与工序(i)同样地，在溶剂及/或碱基的存在下进行。
[0429]
＜工序(iiia)＞
[0430]
工序(iiia)是使化合物(2b)与式：m

n3‑
所表示的叠氮化物盐反应而得到化合物(1j)的工序。
[0431]
作为叠氮化物盐的例，举叠氮化钠、叠氮化钾、叠氮化铵。
[0432]
叠氮化物盐的使用量相对于化合物(2b)1摩尔，通常，1～5摩尔、优选为1～2摩尔。上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0433]
作为溶剂的例，举腈系溶剂(例：乙腈)、醚系溶剂(例：四氢呋喃)、酰胺系溶剂(例：n,n
‑
二甲基甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、n
‑
甲基吡咯烷酮)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选酰胺系溶剂，更优选n,n
‑
二甲基甲酰胺。
[0434]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限制，例如是30～150℃、优选为50～120℃。
[0435]
＜工序(iiib)＞
[0436]
工序(iiib)使化合物(1j)与下述式(3c)所表示的化合物反应之后：
[0437]
【化35】
[0438][0439]
由水解得到化合物(1l)的工序。
[0440]
在化合物(3c)中，r
3g
～r
3i
优选为芳基，更优选为c6‑
10
芳基。
[0441]
化合物(3c)的使用量相对于化合物(1j)1摩尔，通常，1～10摩尔、优选为1～3摩尔。
[0442]
上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0443]
作为溶剂的例，举腈系溶剂(例：乙腈)、醚系溶剂(例：四氢呋喃、二噁烷等的环状醚)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选醚系溶剂，更优选环状醚，优选选自四氢呋喃及二噁烷的至少一种。
[0444]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限制，例如是15～30℃。
[0445]
再者，工序(iiib)也可为替代性地，将化合物(1j)用还原剂(例：氢化铝锂)还原而得到化合物(1l)的工序。
[0446]
＜工序(iiic)＞
[0447]
工序(iiic)是将化合物(1l)的氨基用氨基的保护基保护而得到化合物(1m)的工序。
[0448]
将上述氨基用氨基的保护基保护的方法可采用公知或惯用的方法。例如，作为化合物(1l)的氨基的保护基，导入三氟甲基羰基的工序是使化合物(1l)与三氟醋酸或其衍生物(例：无水三氟醋酸)反应的工序。上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。溶剂的适宜的例是环状胺(例：吡啶)。
[0449]
＜工序(iv)＞
[0450]
工序(iv)是得到化合物(1)之中r3是氨基的化合物(1l)的工序。
[0451]
工序(iv)是化合物(1)之中，使r3是下述式所表示的邻苯二甲酰亚胺残基的化合物与肼化合物(例：肼一水合物)反应的工序：
[0452]
【化36】
[0453][0454]
肼化合物的使用量相对于化合物(1)之中r3是邻苯二甲酰亚胺残基的化合物1摩尔，通常，1～10摩尔、优选为1.1～3.5摩尔。
[0455]
上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0456]
作为溶剂的例，举水、醇系溶剂(例：甲醇、乙醇)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选醇系溶剂。
[0457]
再者，工序(iv)也可为替代性地，水解化合物(1)之中r3是邻苯二甲酰亚胺残基的化合物的工序。
[0458]
＜工序(v)＞
[0459]
工序(v)是使化合物(1l)胍基化，根据需要将氨基用保护基保护而得到化合物(1n)的工序。
[0460]
胍基化通常，由与胍基化剂的反应进行。作为胍基化剂的例，举氮系胍基化剂、硫系胍基化剂。
[0461]
作为氮系胍基化剂的例，举下述式所表示的化合物：
[0462]
【化37】
[0463][0464]
(式中，l4是脱离基，r
3c
～r
3e
与上述的含义相同)。
[0465]
l4所示的脱离基的例与l1同样。
[0466]
氮系胍基化剂优选为1
‑
脒吡唑盐酸盐、1
‑
氨甲酰亚氨酰
‑
1,2,4
‑
三唑盐酸盐、1
‑
(n
‑
t
‑
丁氧基
‑
脒)吡唑、1
‑
(n
‑
苄基氧基
‑
脒)吡唑、1
‑
[n,n'
‑
(二
‑
t
‑
丁氧基)脒]吡唑、1
‑
[n,n'
‑
(二
‑
苄基氧基)脒]吡唑、1,2,3
‑
三(t
‑
丁氧基羰基)胍、或者goodman试剂。
[0467]
作为硫系胍基化剂的例，举下述式所表示的化合物：
[0468]
【化38】
[0469][0470]
(式中，r
3c
～r
3e
与上述的含义相同)。
[0471]
硫系胍基化剂优选为n,n'
‑
二
‑
t
‑
丁氧基
‑
s
‑
甲基异硫代脲、或者1,3
‑
二
‑
t
‑
丁氧基硫代脲。
[0472]
胍基化剂的使用量相对于化合物(1l)1摩尔，通常，0.5～10摩尔、优选为0.8～2.0摩尔。
[0473]
化合物(1l)和胍基化剂的反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0474]
作为溶剂的例，举卤化烃系溶剂(例：二氯甲烷)、酰胺系溶剂(例：n,n
‑
二甲基甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、n
‑
甲基吡咯烷酮)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选酰胺系溶剂，更优选n,n
‑
二甲基甲酰胺。
[0475]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限制，例如是15～30℃。
[0476]
再者，制造化合物(1n)之中r
3c
～r
3e
是氢原子的化合物或其盐的方法也可为包括下列工序的方法：
[0477]
使化合物(1l)与下述式所表示的2
‑
卤
‑
4,6
‑
二烷氧基嘧啶反应：
[0478]
【化39】
[0479][0480]
(式中，l是卤素原子，r
3j
及r
3k
相同或不同，是烷基)，
[0481]
从而得到下述式(1l')所表示的化合物的工序：
[0482]
【化40】
[0483][0484]
(式中，r
3j
及r
3k
与上述的含义相同)、及
[0485]
使化合物(1l')的嘧啶环断裂(或者水解)工序。
[0486]
此方法的详细可参照例如，tetrahedron letters,56,2015,4990～4992页。
[0487]
另外，制造化合物(1n)之中r
3c
～r
3e
是氢原子的化合物或其盐的方法也可为包括使化合物(1l)与o
‑
甲基异脲反应的工序的方法。
[0488]
此方法的详细可参照例如，anal chem.,85(18),2013,1～17页。
[0489]
再者，化合物(1n)之中，r
3c
及r
3d
是氢原子，r
3e
是苄基氧基羰基的化合物或其盐的制造方法也可为包括使化合物(1l)与下述式所表示的化合物及三烷基甲硅烷基氯化物(例：三甲基甲硅烷基氯化物等的三c1‑4烷基甲硅烷基氯化物)反应的工序的方法：
[0490]
【化41】
[0491][0492]
(式中，m'是碱金属)。
[0493]
此方法的详细可参照例如，j.org.chem.,76,2011,6967～6971页。
[0494]
再者，可从由此方法得到的r
3e
是苄基氧基羰基的化合物，由常规方法脱保护苄基氧基羰基，得到r
3e
是氢原子的化合物。
[0495]
化合物(1)、(1j)、(1l)、(1m)、(1n)、(2a)、(2a')、及(2b)的base例如，可由以下的反应方案2变换。
[0496]
【化42】方案2
[0497][0498]
(式中，q1是氢原子或取代基，q2及q3相同或不同，是氢原子或氨基的保护基(但是，q2及q3不同时是氢原子)、q4～q7相同或不同，是氢原子或氨基的保护基，环g是5元或6元的含氮杂环，a1、a2、r1、及r2与上述的含义相同)
[0499]
[反应方案2]
[0500]
＜工序(vi)＞
[0501]
工序(vi)是在化合物(1)、(1j)、(1l)、(1m)、(1n)、(2a)、(2a')、及(2b)中，将base从“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”变换为“任选有取代基的2
‑
氧代
‑
1,2
‑
二氢嘧啶
‑1‑
基”的工序，包括工序(via)～工序(vic)。
[0502]
＜工序(via)＞
[0503]
工序(via)是使base是“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”的化合物(1o)与式(3d)所表示的化合物及磷酸卤化物反应而得到化合物(1p)的工序。
[0504]
在化合物(1o)中，q1优选为氢原子或烷基，再优选为氢原子或c1‑4烷基。
[0505]
化合物(3d)优选为5元的含氮杂环化合物，更优选为三唑。
[0506]
化合物(3d)的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，5～20摩尔、优选为7～9摩尔。
[0507]
磷酸卤化物优选为磷酸三氯化物。
[0508]
磷酸卤化物的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，1～5摩尔、优选为1～3摩尔。上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0509]
作为溶剂的例，举腈系溶剂(例：乙腈)、醚系溶剂(例：四氢呋喃)、卤素系溶剂(例：卤代链烷)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选腈系溶剂(例：乙腈)。上述反应适宜地在碱基的存在下进行。
[0510]
作为碱基的例，举无机碱基[例：碱金属的碳酸盐(例：碳酸钠、碳酸铯)、碱金属的碳酸氢盐(例：碳酸氢钠)、碱土金属的碳酸盐(例：碳酸钙)、碱金属的氢氧化物(例：氢氧化钠、氢氧化钾)、碱土金属的氢氧化物(例：氢氧化钙)、金属醇盐(例：钠甲醇盐、钠乙醇盐)]、有机碱基[例：叔胺(例：三烷基胺)、环状胺(例：4
‑
(二甲基氨基)吡啶、二氮杂双环十一碳烯
(dbu)、二氮杂双环壬烯(dbn))]、这些的组合。这些中，优选叔胺，更优选三c1‑4烷基胺。
[0511]
碱基的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，5～20摩尔、优选为10～15摩尔。上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限定，例如是
‑
5℃～10℃。
[0512]
上述反应也可采用例如，美国专利第5359067号说明书中记载的方法。
[0513]
＜工序(vib)＞
[0514]
工序(vib)是使化合物(1p)与氨反应而得到化合物(1k)的工序。
[0515]
氨的使用量相对于化合物(1p)1摩尔，通常，5～100摩尔、优选为20～50摩尔。
[0516]
上述反应适宜地在溶剂的存在下进行。
[0517]
作为溶剂的例，举酰胺系溶剂(例：n,n
‑
二甲基甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、n
‑
甲基吡咯烷酮)、醚系溶剂(例：四氢呋喃、二噁烷等的环状醚)、这些两种以上的混合溶剂。这些中，优选醚系溶剂，更优选环状醚，还优选选自四氢呋喃及二噁烷的至少一种。
[0518]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限定，例如是15～30℃。
[0519]
＜工序(vic)＞
[0520]
工序(vic)是将化合物(1k)的氨基用保护基保护而得到化合物(1q)的工序。将上述氨基用保护基保护的方法可采用公知(例如，美国专利申请公开第2007/167387号说明书)或惯用的方法。
[0521]
＜工序(vii)＞
[0522]
工序(vii)是在化合物(1)、(1j)、(1l)、(1m)、(1n)、(2a)、(2a')、及(2b)中，将base从“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”变换为“任选有取代基的嘌呤
‑9‑
基”的工序。
[0523]
工序(vii)，具体而言，是使base是“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”的化合物(1o)与式(3e)所表示的化合物反应而得到化合物(1r)的工序。
[0524]
化合物(3e)的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，1～5摩尔、优选为1～3摩尔。
[0525]
上述反应适宜地在lewis酸的存在下进行。
[0526]
作为lewis酸的例，举三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基。
[0527]
lewis酸的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，0.5～5摩尔、优选为1～3摩尔。
[0528]
上述反应适宜地在甲硅烷基化剂的存在下进行。
[0529]
作为甲硅烷基化剂的例，举n,o
‑
双
‑
三甲基甲硅烷基乙酰胺(bsa)、n,o
‑
双
‑
甲硅烷基三氟乙酰胺(bstfa)、六甲基二硅氮烷(hmd)、n,o
‑
双
‑
叔丁基二甲基甲硅烷基乙酰胺、n
‑
(三甲基甲硅烷基)二乙基胺、n
‑
(三甲基甲硅烷基)二甲基胺、n
‑
甲氧基
‑
n,o
‑
双(三甲基甲硅烷基)氨基甲酸酯、n
‑
甲基
‑
n
‑
三甲基甲硅烷基乙酰胺、n
‑
甲基
‑
n
‑
三甲基甲硅烷基七氟丁基酰胺、n
‑
甲基
‑
n
‑
三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺、n
‑
三甲基甲硅烷基乙酰胺、这些两种以上的组合。这些中，优选n,o
‑
双
‑
三甲基甲硅烷基乙酰胺(bsa)。
[0530]
甲硅烷基化剂的使用量相对于化合物(1o)1摩尔，通常，1～20摩尔、优选为3～8摩尔。
[0531]
上述反应的反应温度只要是反应进行，就不特别限制，例如30～150℃、优选为50～120℃。
[0532]
上述反应也可采用例如美国专利申请公开第2012/071646号说明书中记载的方法。
[0533]
＜工序(viii)＞
[0534]
工序(viii)是在化合物(1)、(1j)、(1l)、(1m)、(1n)、(2a)、(2a')、及(2b)中，将base从“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”变换为“任选有取代基的6
‑
氧代
‑
1,6
‑
二氢
‑
9h
‑
嘌呤
‑9‑
基”的工序。
[0535]
工序(viii)，具体而言，是使base是“任选有取代基的2,4
‑
二氧代
‑
1,2,3,4
‑
四氢嘧啶
‑1‑
基”的化合物与式(3f)所表示的化合物反应而得到化合物(1s)的工序。上述反应可与工序(vii)在同样的条件下进行。
[0536]
化合物(1)的制造方法也可还根据需要，包括将中间生成物及最终生成物由常规方法、例如，浓缩、再结晶、硅胶柱层析等纯化的工序。
[0537]
【含化合物(1)的组合物】
[0538]
本发明的组合物含有上述的化合物(1)。
[0539]
组合物可为仅含有1种化合物(1)，也可为含有2种以上。例如，组合物也可含有选自下述的1种、2种、3种、或者4种化合物
[0540]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基的化合物(1)；
[0541]
base是5
‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、n
‑
乙酰基
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、n
‑
异丁酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基、或者n
‑
苯甲酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基的化合物(1)；
[0542]
base是腺嘌呤
‑9‑
基、n
‑
乙酰基
‑
腺嘌呤
‑9‑
基、n
‑
异丁酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基、或者n
‑
苯甲酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基的化合物(1)；及
[0543]
base是鸟嘌呤
‑9‑
基、n
‑
乙酰基
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、n
‑
异丁酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、n
‑
苯甲酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基、或者n
‑
(n,n
‑
二甲基甲酰胺基)
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基的化合物(1)。
[0544]
作为组合物的形态，举液体。
[0545]
在组合物的形态是液体时，组合物通常，含溶剂。作为溶剂，可使用公知的溶剂，优选可举出卤化烃系溶剂(例：二氯甲烷)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香族烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、水、te缓冲液等。这些中，更优选二氯甲烷、甲苯、乙腈。组合物通常收容在容器而提供于使用者。
[0546]
组合物可在后述的寡核苷酸或其盐的合成中使用。另外，组合物可作为医药组合物使用。
[0547]
【寡核苷酸或其盐】
[0548]
本发明的寡核苷酸或其盐具有下述式(4)所表示的单元：
[0549]
【化43】
[0550][0551]
(式中，base、a1、a2、x、及r3与上述的含义相同)。
[0552]
上述单元优选是下述式(4a)所表示的单元：
[0553]
【化44】
[0554][0555]
(式中，a3是oh或sh，base、a1、a2、x、及r3与上述的含义相同)。
[0556]
以下，将具有式(4)或(4a)所表示的单元的寡核苷酸或其盐称为“寡核苷酸(4)”。在寡核苷酸(4)有2个以上式(4)或(4a)所表示的单元时，各单元的结构可相同，也可不同。
[0557]
寡核苷酸(4)除了式(4)或(4a)所表示的单元之外，也可含其他单元。作为其他单元的例，可举出选自下述式(5)～(8)所表示的单元的至少一种：
[0558]
【化45】
[0559][0560]
(式中，a6相同或不同，是单键或任选有取代基的亚烷基，r
a
是氢原子或羟基，r
b
是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、或者氨基的保护基，base与上述的含义相同)。
[0561]
上述其他单元优选可举出选自下述式(5a)～(8a)所表示的单元的至少一种：
[0562]
【化46】
[0563]
[0564]
(式中，a7～a
10
相同或不同，是oh或sh，base及a6与上述的含义相同。)。
[0565]
再者，其他单元也可为例如，来源于美国专利申请公开第2003/105309号说明书、美国专利申请公开第2017/044528号说明书、美国专利申请公开第2006/166908号说明书、美国专利申请公开第2012/208991号说明书、美国专利申请公开第2015/266917号说明书、美国专利申请公开第2003/207841号说明书中记载的核苷酸的单元。
[0566]
寡核苷酸(4)的碱基序列只要是对于目标dna或目标rna的碱基序列(全长或其一部分)互补的，就不特别限制。
[0567]
寡核苷酸(4)的长度不特别限定，可对应于目标的碱基序列的长度而选择。寡核苷酸(4)的长度的下限例如5mer、优选10mer、再优选为15mer，寡核苷酸(4)的长度的上限例如200mer、优选100mer、更优选为50mer、再优选30mer。寡核苷酸(4)的长度例如，5～200mer、优选5～50mer、更优选为10～40mer、再优选15～30mer。寡核苷酸(4)的长度越长，对目标碱基序列的结合力越强。
[0568]
在寡核苷酸(4)中，相对于核苷酸单元的总数，式(4)所表示的单元的数的比例不特别限定，可对应于使用目的(引物、探针、夹核酸、医药等)而适宜设计。
[0569]
寡核苷酸(4)也可为盐的形态。即，构成寡核苷酸(4)的核苷酸单元之中，至少1个核苷酸单元也可为盐的形态。上述盐可为药学上容许的盐，也可为不是药学上容许的盐。上述盐可为无机盐，也可为有机盐。作为上述盐的例，举与化合物(1)所例示的盐同样、碱金属盐、碱土金属盐、其他金属盐、铵盐、四甲基铵盐、胺盐、无机酸盐、有机酸盐、氨基酸盐。
[0570]
寡核苷酸(4)也可由标记物质修饰。作为标记物质，不特别限定，作为荧光物质、半抗原(例如，生物素、地高辛配基、dnp等)、放射性同位素等，赋予核酸的标记，可为本领域公知的物质。
[0571]
寡核苷酸(4)序列特异性高。
[0572]
表示寡核苷酸(4)对于单链rna的双链形成能的tm值与相同的base的dna(式(5)r
a
＝h)相比高。
[0573]
表示寡核苷酸(4)对于单链dna的双链形成能的tm值，也与相同的base的dna(式(5)r
a
＝h)相比高。
[0574]
寡核苷酸(4)不仅是对于单链rna，对于单链dna也可具有高的双链形成能，在涉及的点比以往的寡核苷酸优良。寡核苷酸(4)可作为检查单链rna或单链dna的碱基序列，或序列高选择性地检测的探针适宜地利用。
[0575]
寡核苷酸(4)难以被核酸酶分解，向生物体施用后，可长期存在于生物体内。寡核苷酸(4)可例如，与正义rna形成双链而抑制成为病因的生物体内成分(蛋白质)的mrna的转录。另外，寡核苷酸(4)也可抑制感染的病毒的增殖。
[0576]
寡核苷酸(4)作为抗肿瘤剂、抗病毒剂等的抑制基因的活动而治疗疾病的医药有用。另外，寡核苷酸(4)具有稳定而优良的反义或反义基因或作为适体的活性，或作为用于特定基因的检测药或扩增开始的引物具有优良的活性。
[0577]
寡核苷酸(4)作为各种生理－生物活性物质、药品的材料、rna干涉法或诱饵法用等的双链寡核苷酸的功能性材料、以cdna等的单链核酸作为目标的dna芯片、分子信标(molecular beacon)等的功能性原料、向各种各样的反义法(含核酶、dna酶)、反义基因法或基因同源重组法用途的功能性原料、由与荧光或发光物质的组合的生物体微量成分的高
灵敏度分析用材料或基因功能解明等的研究用试剂的开发原料有用。
[0578]
【寡核苷酸(4)的制造方法】
[0579]
寡核苷酸(4)可根据惯用的方法、例如，磷酸亚磷酰胺流程而合成。
[0580]
例如，寡核苷酸(4)的制造方法包括：
[0581]
(i)使下述式(4a)所表示的化合物或其盐与选自下述式(4b)～(8b)所表示的化合物或其盐的至少一种反应的工序：
[0582]
【化47】
[0583][0584]
(式中，r
2'
是任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基、或者任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，base、a1、a2、x、及r3与上述的含义相同)
[0585]
【化48】
[0586][0587]
(式中，
[0588]
r
1'
是氢原子、任选有取代基的烷基、任选有取代基的烯基、任选有取代基的环烷基、任选有取代基的环烯基、任选有取代基的芳基、羟基的保护基、具有取代基的膦基、任选有取代基的二羟基亚膦酰基、或者任选有取代基的羟基巯基亚膦酰基，
[0589]
r
a
及r
b
相同或不同，是氢原子或烷基，
[0590]
r
c
是氢原子、烷基、卤代烷基、或者氰基烷基，
[0591]
base、a1、a2、a6、x、r3、r
a
、及r
b
与上述的含义相同)、及/或，
[0592]
(ii)使下述式(4b)所表示的化合物或其盐与选自下述式(4a)～(8a)所表示的化合物或其盐的至少一种反应的工序：
[0593]
【化49】
[0594][0595]
(式中，base、a1、a2、x、r
1'
、r3、r
a
、r
b
、及r
c
与上述的含义相同)
[0596]
【化50】
[0597][0598]
(式中，base、a1、a2、a6、x、r
2'
、r3、r
a
、及r
b
与上述的含义相同)、以及(iii)使在工序(i)及/或工序(ii)中得到的化合物氧化(特别是，使磷原子氧化)工序。
[0599]
寡核苷酸(4)的制造方法还根据需要，包括将中间生成物及最终生成物由常规方法、例如，浓缩、再结晶、硅胶柱层析、凝胶过滤、乙醇沉淀、分钟取hplc等纯化的工序。
[0600]
【含寡核苷酸(4)的组合物】
[0601]
本发明的组合物含有上述的寡核苷酸(4)。
[0602]
组合物可仅含有1种寡核苷酸(4)，也可含有2种以上。
[0603]
作为组合物的形态，举液体、固体。
[0604]
在组合物的形态是液体时，组合物通常，含溶剂。作为溶剂，可使用公知的溶剂，优选可举出卤化烃系溶剂(例：二氯甲烷)、腈系溶剂(例：乙腈)、芳香族烃系溶剂(例：甲苯、二甲苯)、水。这些中，更优选水，更优选含有缓冲液的水(缓冲液)。作为缓冲液的例，举三羟基甲基氨基甲烷(tris缓冲液)、三羟基甲基氨基甲烷
‑
盐酸(tris
‑
hcl缓冲液)、三羟基甲基氨基甲烷
‑
edta(te缓冲液)、磷酸钠、2
‑
吗啉代乙磺酸(mes)、n
‑
(2
‑
乙酰胺)亚胺基二醋酸(ada)、哌嗪
‑
1,4
‑
双(2
‑
乙磺酸)、n
‑
(2
‑
乙酰胺)
‑2‑
氨基乙磺酸(aces)、胆胺盐酸、n,n
‑
双(2
‑
羟基乙基)
‑2‑
氨基乙磺酸(bes)、n
‑
三(羟基甲基)甲基
‑2‑
甲磺酸(tes)、2
‑
[4
‑
(2
‑
羟基乙基)
‑1‑
哌嗪基]乙磺酸(hepes)、乙酰胺甘氨酸、n
‑
[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、甘氨酸酰胺、二羟乙基甘氨酸。
[0605]
组合物也可还含有盐。盐包含金属氯化物，作为其例，举nacl、mgcl2、kcl。
[0606]
组合物也可还含有添加物及共溶剂。作为其例，也可含有二甲基亚砜(dmso)、甘油、甲酰胺、牛血清白蛋白、硫酸铵、聚乙二醇(peg)、明胶、非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂的例，举tween20(注册商标)、triton x
‑
100(注册商标)。在组合物的形态是固体时，组合物也可为例如，向固相载体负载寡核苷酸(4)。在固相载体上，可举出可负载生物体高分子的无机材料或有机材料。优选可举出玻璃(例：多孔质玻璃(cpg))、硅胶、树脂
(例：交联的非膨润性的聚苯乙烯树脂(hps))。这些中，更优选hps或cpg。
[0607]
组合物通常收容在容器而提供于使用者。
[0608]
组合物可在后述的目标核酸的检测、链侵入等中使用。另外，组合物可作为医药组合物使用。
[0609]
【检测检查试样中的目标核酸的方法】
[0610]
本发明包括在检查试样中检测目标核酸的方法。此方法包括：
[0611]
(i)将含上述目标核酸的目标部位的碱基序列(含目标核酸的全长的碱基序列)由使用夹核酸的核酸扩增法，选择性地扩增的工序，其中上述夹核酸是寡核苷酸(4)、及(ii)检测上述被扩增的碱基序列的工序。
[0612]
检查试样只要是含核酸，就不特别限定。检查试样，典型而言，是从生物体采集的试样。通常使用由从自生物体采集的试样除去混杂物、核酸的提取－纯化、预扩增等的预处理得到的试样。具体而言，可使用血液、血浆、血清、胸水、支气管清洗液、骨髓液、淋巴液、尿、粪便、肠道清洗液、切除组织等。另外，这些中也可使用进行上述的预处理的试样。本发明的方法由于可以非常高灵敏度检测核酸的变异，例如，能使用从病变部位直接采集试样的固体试样(例：癌)，也能使用仅含微量检查对象试样的液体试样(例：血液)。检查试样优选为含目标核酸的溶液。在检测血液或切除组织中所含的细胞内的目标核酸时也可由公知的方法进行细胞的可溶化。
[0613]
目标核酸可为dna，也可为rna优选为dna。目标核酸可为基因、基因的启动子区域等基因组dna上的特定的区域。本发明的检测方法可在目标部位的变异、多态性等的检测中使用。另外，本发明的检测方法可在等位基因的决定中使用。可检测检查试样中是否含哪种型的等位基因。另外，本发明的检测方法还可在甲基化的检测中使用。在对目标核酸进行亚硫酸氢盐处理之后，通过适用本发明的检测方法，可检测目标核酸中的甲基化胞嘧啶的存在与否。
[0614]
含变异的基因(以下，变异型基因)具有与野生型基因的碱基序列的相异、即变异。所述相异是起因于选自取代、插入、缺失、逆位、重复、及转座的1个以上的变异或它们的组合。
[0615]
所述相异通常有与特定的疾病的发病及/或治疗感受性关联的情况。其中，“发病”不仅是疾病的实际的发病，也含发病风险等。另外，“治疗感受性”不仅是由药物等的治疗的奏效率，也含副作用的强弱等。作为上述疾病，举例如，癌、骨髓发育异常综合征、感染症等，但不限于这些。上述疾病的适宜的例是癌。
[0616]
上述基因的适宜的例是abl/bcr融合基因、her2基因、egfr基因、c
‑
kit基因、kras基因、braf基因、pik3ca基因、flt3基因、myc基因、mycn基因、met基因、bcl2基因、或者eml4/alk融合基因。
[0617]
夹核酸，通常与目标核酸(例：变异型基因)相比，更强地夹检查试样中的非目标核酸(例：野生型基因)。夹核酸与非目标核酸强结合，通过抑制非目标核酸的扩增而可对目标核酸选择性地进行扩增。例如，在检测特定的基因的变异时，通过在具有与野生型的基因序列完全地互补的碱基序列的夹核酸的存在下进行核酸扩增，抑制野生型的核酸的扩增，选择性地扩增变异型的核酸。
[0618]
具体而言，例如，以目标核酸的目标部位作为变异型基因的变异位置，以含此变异
位置(目标核酸的目标部位)的碱基序列作为“序列a”之时，夹核酸对于相应于作为非目标核酸的野生型基因中的序列a的碱基序列完全地互补。
[0619]
寡核苷酸(4)具有序列高选择性。从而，夹核酸对于哪怕是1碱基相异的碱基序列的结合能极其弱，可与完全地互补的碱基序列特异性地结合。另外，寡核苷酸(4)的tm值高，形成稳定的双链。即，夹核酸与非目标核酸特异性地强结合，发挥高的夹能力。夹核酸的长度不特别限定，例如是5～30mer。
[0620]
作为核酸扩增法，只要是可对目标部位进行扩增，并且可由夹核酸的结合选择性地抑制上述扩增，就不特别限制。作为核酸扩增法的例，可举出pcr法(含热启动pcr法、多重pcr法、巢式pcr法、rt
‑
pcr法、实时pcr法、数字pcr法等)、nasba法(参照美国专利第5130238号说明书)、tma法(参照美国专利第5399491号说明书)、trc法(参照美国专利申请公开第2001/0053518号说明书)、lamp法(参照美国专利第6410278号说明书)、ican法(参照美国专利申请公开第2003/073081号说明书)、lcr法(参照欧州专利申请号320328号)、sda法(参照美国专利第5455166号说明书)。
[0621]
作为检测被扩增的目标核酸的方法，可使用任意的方法。
[0622]
检测方法的适宜的例是使用作为具有与含目标核酸的目标部位(例如，变异型基因的变异位置)的碱基序列互补的碱基序列的单链核酸的检测用探针的方法。作为具体性的方法，举例如southern杂交法、taqman
tm
探针法、循环探针法。
[0623]
检测用探针的适宜的例是将一方的末端(通常，5'末端)用荧光基(报告子)标记，将另一方的末端(通常，3'末端)用消光基标记的水解探针。当使用此探针时，在pcr中由dna聚合酶的延伸反应进行时，由其外切核酸酶活性水解荧光探针，报告子染料游离，发荧光。通过监测此荧光强度，可对核酸进行定量。
[0624]
另外，作为检测被扩增的目标核酸的方法，例示碱基序列解析法。通过将被扩增的目标核酸的碱基序列使用公知的序列解析装置(测序仪)解析，可检测目标核酸。
[0625]
再者，检测检查试样中的目标核酸的方法也可采用例如美国专利申请公开第2015/240299号说明书中记载的方法。
[0626]
这样，通过使用寡核苷酸(4)，能在检查试样中序列高选择性地检测目标核酸。
[0627]
【用于检测检查试样中的目标核酸，或对检查试样中的含目标核酸的目标部位的碱基序列选择性地进行扩增的组合物及试剂盒】
[0628]
用于检测检查试样中的目标核酸，或对检查试样中的含目标核酸的目标部位的碱基序列选择性地进行扩增的组合物(以下，称为“检查用组合物”)含寡核苷酸(4)。寡核苷酸(4)通常，以组合物的形态含在试剂盒中。
[0629]
在检查用组合物中，寡核苷酸(4)如上所述，可作为目标核酸检测中的引物、探针、及/或夹核酸使用。引物、探针、及/或夹核酸可对应于目标核酸或非目标核酸的碱基序列而适宜设计。
[0630]
一实施方式的检查用组合物含引物及探针。这些中至少任一方是寡核苷酸(4)。引物及探针可收容在相同的容器，也可收容在分别的容器。
[0631]
图11(a)是作为检查用组合物的引物及探针收容在相同的容器的试剂盒的一例的模式图。试剂盒11含外装箱12，设在外装箱12内、在表面形成凹部的容器支持体，安装到凹部，收容有引物及探针的容器13和附带文书14。在附带文书14中，可记载试剂盒11的对待方
法、储存条件、使用期限等。
[0632]
图11(b)是作为检查用组合物的引物及探针收容在分别的容器的试剂盒的一例的模式图。试剂盒21含外装箱22，设在外装箱22内，在表面沿长边方向以一定间隔而形成第1凹部及第2凹部的容器支持体，安装到第1凹部，收容有引物的容器23a，安装到第2凹部，收容有探针的容器23b和附带文书24。
[0633]
别的实施方式的检查用组合物含正向引物、反向引物及探针。这些中至少任一方是寡核苷酸(4)。正向引物、反向引物及探针可为如3种全部收容在相同的容器(例：图11(a)所示的试剂盒)，也可为、如任何2种收容在相同的容器(例：图11(b)所示的试剂盒)、也可3种全部收容在分别的容器。
[0634]
图11(c)是正向引物、反向引物及探针的全部收容在分别的容器的试剂盒的一例的模式图。试剂盒31含外装箱32，设在外装箱32内、在表面沿长边方向以一定间隔而形成第1～第3凹部的容器支持体，安装到第1凹部，收容有正向引物的容器33a，安装到第2凹部，收容有反向引物的容器33b，安装到第3凹部，收容有探针的容器33c和附带文书34。
[0635]
另外别的实施方式的检查用组合物含夹核酸及引物。这些中至少任一方是寡核苷酸(4)。此检查用组合物可为用于仅对目标核酸进行扩增的检查用组合物。夹核酸及引物可如收容在相同的容器(例：图11(a)所示的试剂盒)，也可如收容在分别的容器(例：图11(b)所示的试剂盒)。
[0636]
再者别的实施方式的检查用组合物含夹核酸、引物及探针。这些中至少任一方是寡核苷酸(4)。夹核酸、引物及探针可如3种全部收容在相同的容器(例：图11(a)所示的试剂盒)，也可如任何2种收容在相同的容器(例：图11(b)所示的试剂盒)、也可如3种全部收容在分别的容器(例：图11(c)所示的试剂盒)。
[0637]
在试剂盒中，也可含dna聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dntps)、反应缓冲液、盐、限制性内切酶等。
[0638]
本发明含寡核苷酸(4)用于检测检查试样中的目标核酸，或对检查试样中的含目标核酸的目标部位的碱基序列选择性地进行扩增的用途。其中使用的寡核苷酸(4)例如，具有与含在检查用组合物的寡核苷酸(4)相同的特征。
[0639]
【用于向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的组合物】
[0640]
本发明含用于向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的组合物(以下，称为“链侵入用组合物”)。
[0641]
链侵入用组合物含有具有对于上述目标部位的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸(4)。
[0642]
链侵入用组合物可仅含有1种寡核苷酸(4)，也可含有2种以上。在一实施方式中，2种以上的寡核苷酸(4)均与双链dna的一方的链杂交。在别的实施方式中，2种以上的寡核苷酸(4)含与双链dna的一方的链杂交的寡核苷酸和与双链dna的另一方的链杂交的寡核苷酸。通过使用2种以上寡核苷酸(4)，可进一步更加增强链侵入。
[0643]
链侵入用组合物也可还含有单链dna结合蛋白质。但是发现，当使用本发明的寡核苷酸(4)时，即使不含有单链dna结合蛋白质，也引起链侵入由后述的实验开始。从而，链侵入用组合物也优选不含有单链dna结合蛋白质的实施方式。
[0644]
链侵入用组合物也可含有选自含有缓冲液的水(或者缓冲液)、盐、添加物、及共溶
剂的至少一种。这些各成分可使用“含寡核苷酸(4)的组合物”中所例示的。
[0645]
在链侵入用组合物中，寡核苷酸(4)的浓度可考虑寡核苷酸(4)或目标的双链dna的序列或核苷酸长，由本领域技术人员适宜调整。再者，在体外进行链侵入反应时可考虑样品中的目标双链dna的浓度等。在体内进行链侵入反应时可考虑生物体内中的寡核苷酸(4)的动态(具体而言，血中浓度、血中半衰期等)。在链侵入用组合物中的寡核苷酸(4)的浓度的下限例如是50nm、优选为100nm，寡核苷酸(4)的浓度的上限例如是3000nm、优选2500nm、更优选为2000nm、再优选1500nm、特别优选1000nm。寡核苷酸(4)的浓度是例如50～2000nm，优选为100～1000nm。
[0646]
寡核苷酸(4)具有序列高选择性。从而，链侵入用组合物可仅与具有互补的碱基序列的目标部位的碱基序列特异性地结合。另外，寡核苷酸(4)的tm值高，与目标部位的碱基序列强结合而形成稳定的链侵入。再者，寡核苷酸(4)难以被核酸酶分解。从而，寡核苷酸(4)可适宜地利用于链侵入用组合物。
[0647]
本发明含寡核苷酸(4)用于向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的用途。其中使用的寡核苷酸(4)例如，具有与含在上述链侵入用组合物的寡核苷酸(4)相同的特征。
[0648]
【向双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的方法】
[0649]
本发明含向单离的双链dna的目标部位链侵入寡核苷酸的方法(以下，称为“链侵入法”)。
[0650]
链侵入法包括将对于双链dna的目标部位的碱基序列具有互补的碱基序列的寡核苷酸(4)和双链dna混合的工序。
[0651]
上述混合工序是在一实施方式中，将寡核苷酸(4)和双链dna在单链dna结合蛋白质的存在下混合的工序。
[0652]
此工序也可在缓冲液及/或盐的存在下进行。上述缓冲液及盐可选自例如，在“含寡核苷酸(4)的组合物”中记载的。
[0653]
上述混合工序也可在单链dna结合蛋白质的非存在下实施。即，链侵入法在其他实施方式中，包括将寡核苷酸(4)和双链dna在单链dna结合蛋白质的非存在下混合而调制混合物的工序、及对上述混合物进行加热的工序。
[0654]
在单链dna结合蛋白质的非存在下的混合工序也可在缓冲液及/或盐的存在下进行。上述缓冲液及盐可选自例如，在链侵入用组合物中记载的。
[0655]
在混合物的加热工序中，加热温度可例如，选自超75℃的范围。加热温度的下限优选80℃、更优选为85℃、再优选90℃，加热温度的上限优选为100℃。加热温度优选80～100℃、再优选85～100℃、特别优选为90～100℃。加热时间不特别限定。加热时间的下限例如7分钟、优选8分钟、再优选9分钟、特别优选为10分钟，加热时间的上限例如12小时、优选6小时、更优选为3小时、再优选1小时、特别优选30分钟。加热温度例如7分钟～12小时、优选8分钟～6小时、再优选9分钟～1小时、特别优选为10分钟～30分钟。
[0656]
此方法也可还包括对加热的混合物进行冷却的工序。在上述冷却中，冷却到达温度的下限例如30℃、优选35℃、更优选为40℃、再优选45℃，冷却到达温度的上限优选为60℃。冷却到达温度例如，30～60℃、优选40～60℃、再优选为45～60℃。冷却速度不特别限定。冷却速度的下限例如1℃/分钟、优选为2℃/分钟，冷却速度的上限例如10℃/分钟、优选9℃/分钟、再优选为8℃/分钟。冷却速度例如1～10℃/分钟、优选为2～8℃/分钟。
[0657]
链侵入法在别的实施方式中，包括将寡核苷酸(4)和双链dna在单链dna结合蛋白质的非存在下混合而调制混合物的工序、及将上述混合物维持在25～75℃的工序。在单链dna结合蛋白质的非存在下的混合工序也可与上述同样、在缓冲液及/或盐的存在下进行。上述缓冲液及盐可选自例如，链侵入用组合物中记载的。
[0658]
在将混合物维持在指定的温度范围的工序中，维持时间不特别限定。维持时间的下限例如2小时、优选4小时、再优选为6小时，维持时间的上限例如60小时、优选48小时、再优选为24小时。维持时间例如2～60小时、优选4～48小时、再优选为6～24小时。
[0659]
这样，当使用寡核苷酸(4)时，能无论存在单链dna结合蛋白质与否，在广泛的温度范围中发生链侵入。
[0660]
＜医药组合物(或者制剂)＞
[0661]
本发明的医药组合物(或者制剂)含化合物(1)或寡核苷酸(4)。作为含化合物(1)的医药组合物(或者制剂)，举例如，作为核酸系逆转录酶抑制剂(nucleoside analogue reversetranscriptaseinhibitor：nrti)的azt(azidothymidine)等的低分子药品。作为含寡核苷酸(4)的医药组合物(或者制剂)，举例如，反义、sirna(small interfering rna)、适体、诱饵核酸、cpg寡等的中分子、或者高分子的核酸药品。
[0662]
医药组合物可为液状制剂(例：注射剂、点眼剂、点鼻剂、悬浮剂)、固体制剂(例：锭剂、颗粒剂、散剂)、半固体制剂(例：软膏剂、栓剂)、此外也可为本领域技术人员公知的制剂形态之任一者。
[0663]
医药组合物的适宜的例是非经口施用制剂(例：皮下施用剂、静脉内施用剂、经鼻腔施用剂、髓腔内施用剂、脑室内施用剂、玻璃体施用剂)。
[0664]
医药组合物的其他适宜的例是局部用制剂。
[0665]
医药组合物通常还含药学上容许的载体或添加剂。
[0666]
载体包含固体载体及液体载体。作为固体载体的例，举淀粉、乳糖、硫酸钙二水合物、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸。作为液体载体的例，举水(含生理盐水)。
[0667]
添加剂包含稳定剂，作为其例，可举出甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯等的对羟基安息香酸酯类；苄基醇等的醇类；氯化苯扎铵；苯酚、甲酚等的苯酚类)。寡核苷酸(4)具有序列高选择性，tm值高，难以被核酸酶分解。从而，含化合物(1)或寡核苷酸(4)的医药组合物(或者制剂)可在体内序列高选择性地捕捉靶(例:目标基因)而发挥作用。
[0668]
【实施例】
[0669]
接下来，基于实施例而更详细地说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
[0670]
【化合物(1)的合成例】
[0671]
在合成例中的记号及缩写如下所述。
[0672]
bz：苯甲酰
[0673]
dmtr：二甲氧基三苯甲基
[0674]
ph：苯基
[0675]
i
‑
pr：异丙基
[0676]
ts：甲苯磺酰
[0677]
bsa：n,o
‑
双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺
[0678]
dipea：二异丙基乙基胺
[0679]
dmap：二甲基氨基吡啶
[0680]
dmf：二甲基甲酰胺
[0681]
pph3：三苯基膦
[0682]
et3n：三乙基胺
[0683]
meoh：甲醇
[0684]
tbaf：氟化四
‑
n
‑
丁基铵
[0685]
tfa：三氟甲基羰基
[0686]
tfaa：无水三氟醋酸
[0687]
thf：四氢呋喃
[0688]
tmsotf：三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基
[0689]
rt：室温
[0690]
d：日
[0691]
h：时间
[0692]
min：分
[0693]
[合成例1]
[0694]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是三氟甲基羰基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物ap
‑
t
‑
6”)根据下述反应方案而合成。
[0695]
【化51】
[0696][0697]
(化合物ap
‑
t
‑
1的合成)
[0698]
氮气流下，向甲苯(80ml)溶解化合物t
‑
1(4.72g,8.93mmol)，于室温依次加三乙基胺(7.5ml,53.58mmol)、3
‑
溴
‑1‑
丙醇(3.5ml,40.19mmol)，于100℃搅拌12小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，各自分级分离为有机层和水层。水层用醋酸乙酯进行逆提取。使在最初的分级分离中得到的有机层和通过逆提取得到的有机层合并，用饱和生理盐水清洗之后，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝1:1～1:3)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
1(4.15g,收率
76％)作为白色固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.94
‑
1.12(28h,m),1.79
‑
1.87,1.96
‑
2.03(2h,m),1.92(3h,d,j＝1hz),2.37(1h,t,j＝5hz),2.65,2.97(2h,abq,j＝11hz),2.86
‑
2.93,3.05
‑
3.12(2h,m),3.67,4.04(2h,abq,j＝13hz),3.76
‑
3.83(2h,m),3.97(1h,d,j＝3hz),4.35(1h,d,j＝3hz),6.21(1h,s),7.70(1h,d,j＝2hz),8.70(1h,s)。
[0699]
(化合物ap
‑
t
‑
2的合成)
[0700]
氮气流下，向二氯甲烷(43ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
1(4.13g,7.05mmol)，在冰冷下依次加p
‑
甲苯磺酰氯化物(1.59g,8.36mmol)、三乙基胺(1.7ml,12.36mmol)、4
‑
二甲基氨基吡啶(0.177g,1.45mmol)，于室温搅拌4小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用二氯甲烷、水进行稀释，各自分级分离为有机层和水层。水层用醋酸乙酯进行逆提取。在最初的分级分离中得到的有机层、将通过逆提取得到的有机层各自用饱和生理盐水清洗之后，使有机层合并，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝1:1～1:2)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
2(4.65g,88％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.94
‑
1.12(28h,m),1.92(3h,d,j＝1hz),1.95
‑
1.99,2.06
‑
2.15(2h,m),2.42(3h,s),2.48,2.93(2h,abq,j＝11hz),2.77
‑
2.84,2.86
‑
2.91(2h,m),3.65,4.02(2h,abq,j＝13hz),3.93(1h,d,j＝3hz),4.10
‑
4.15,4.18
‑
4.24(2h,m),4.25(1h,d,j＝3hz),5.97(1h,s),7.32
‑
7.34(2h,m),7.78
‑
7.80(2h,m),7.70(1h,d,j＝1hz),8.30(1h,s)。
[0701]
(化合物ap
‑
t
‑
3的合成)
[0702]
氮气流下，向n,n
‑
二甲基甲酰胺(49ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
2(4.65g,6.28mmol)，于室温加叠氮化钠(0.52g,7.94mmol)，于90℃搅拌2小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝3:1～2:1)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
3(3.38g,83％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.91
‑
1.12(28h,m),1.80
‑
1.93,1.99
‑
2.09(2h,m),1.89(3h,d,j＝2hz),2.59,2.97(2h,abq,j＝11hz),2.76
‑
2.83,2.92
‑
2.99(2h,m),3.35
‑
3.49(2h,m),3.64,4.02(2h,abq,j＝13hz),3.96(1h,d,j＝3hz),4.32(1h,d,j＝3hz),6.20(1h,s),7.68(1h,d,j＝1hz),8.33(1h,s)。
[0703]
(化合物ap
‑
t
‑
4的合成)
[0704]
氮气流下，向四氢呋喃(48ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
3(3.40g,5.57mmol)，加三苯基膦(3.74g,14.26mmol)，于室温进行搅拌14.5小时。接下来，向反应液于室温加水(3ml)，进一步搅拌3小时。通过进行得到的反应液的减压馏去而得到中间体。将得到的中间体用吡啶:甲苯＝1:1的混合溶液、吡啶依次进行共沸脱水之后，氮气流下，溶解于吡啶(48ml)，在冰冷下加无水三氟醋酸(2.1ml,14.90mmol)，于室温搅拌2.5小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对有机层、水层各自进行分级分离。水层用醋酸乙酯进行逆提取，在最初的分级分离中得到的有机层、将通过逆提取得到的有机层各自用饱和生理盐水清洗之后，使有机层合并，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝2:1～3:2)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
4(3.53g,93％)作为淡黄色固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.94
‑
1.12(28h,m),1.83
‑
1.89,2.01
‑
2.12(2h,m),1.92(3h,d,j＝1hz),2.60,2.98(2h,abq,j＝11hz),2.73
‑
2.82,3.02
‑
3.08(2h,m),3.48
‑
3.55(2h,m),3.67,4.04(2h,abq,j＝13hz),3.97(1h,d,j＝3hz),4.33(1h,d,j＝3hz),6.22(1h,
s),7.40(1h,m),7.69(1h,d,j＝1hz),9.24(1h,s)。
[0705]
(化合物ap
‑
t
‑
5的合成)
[0706]
向四氢呋喃(47ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
4(3.53g,5.17mmol)，依次加醋酸(0.49ml,8.54mmol)、氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,12.0ml,12.0mmol)，于室温搅拌20分钟。进行得到的反应液的减压馏去，由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇＝20:1～10:1)去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，氮气流下，溶解于吡啶(30ml)。加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(2.50g,7.40mmol)，于室温搅拌15小时。对反应液进行冷却，用冷水停止反应之后，用醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝1:1～1:3)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
5(3.91g,92％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ1.47(3h,s),1.82
‑
1.91,1.99
‑
2.08(2h,m),2.62(1h,d,j＝8hz),2.70
‑
2.78,2.94
‑
3.02(2h,m),2.76,2.86(2h,abq,j＝12hz),3.33,3.39(2h,abq,j＝11hz),3.46
‑
3.51(2h,m),4.26(1h,d,j＝8hz),4.38(1h,br),6.09(6h,s),6.33(1h,s),6.85(4h,d,j＝8hz),7.22
‑
7.46(10h,m),7.74(1h,s),9.22(1h,s)。
[0707]
(化合物ap
‑
t
‑
6的合成)
[0708]
氮气流下、将化合物ap
‑
t
‑
5(3.90g,5.26mmol)用乙腈进行共沸干燥，溶解于乙腈(47ml)。在冰冷下依次加4,5
‑
二氰基咪唑(0.69g,5.85mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(2.5ml,7.45mmol)，于室温搅拌3.5小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝3:2～1:2)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
6(4.02g,80％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(cdcl3)δ149.4,150.1.hrms(maldi)：calcd for c
46
h
56
f3n6nao
10
p[m na

]963.3640,found 963.3656
[0709]
(化合物ap
‑
t
‑
7的合成)
[0710]
向化合物t
‑
1(6.70g,12.7mmol)的甲苯溶液(80ml)于室温加n
‑
(3
‑
溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(15.3g,57.0mmol)、三乙基胺(12.4ml,89.2mmol)，升温至100℃，搅拌2天。在冰冷下加水之后，用醋酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝4:1～2:1)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
7(7.68g,85％)作为白色固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.95
‑
1.11(28h,m),1.91(3h,s),1.95
‑
2.16(2h,m),2.58(1h,d,j＝11hz),2.68
‑
2.75(1h,m),2.93(1h,d,j＝11hz),2.99
‑
3.05(1h,m),3.65(1h,d,j＝13hz),3.77
‑
3.87(2h,m),3.94(1h,d,j＝3hz),4.03(1h,d,j＝13hz),4.32(1h,d,j＝3hz),6.16(1h,s),7.68
‑
7.71(3h,m),7.81
‑
7.86(2h,m),8.25(1h,brs)。
[0711]
(化合物ap
‑
t
‑
4的合成(化合物ap
‑
t
‑
7经由))
[0712]
向化合物ap
‑
t
‑
7(100mg,0.14mmol)的甲醇溶液(2ml)加肼一水合物(0.016ml,0.33mmol)，于室温一晚搅拌。其后，加肼一水合物(0.008ml,0.16mmol)，于室温搅拌3天。向减压馏去溶剂而得到的残渣加二氯甲烷，对不溶物进行过滤分离。向吡啶(3ml)溶解减压馏去滤液之后的残渣，在冰冷下加三氟醋酸酐(0.045ml,0.32mmol)，于室温1小时搅拌40分钟。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用
饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝2:1～3:2)纯化，以化合物ap
‑
t
‑
4(82.9mg,87％)作为白色固体得到。
[0713]
[合成例2]
[0714]
base是n
‑
苯甲酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是三氟甲基羰基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物ap
‑
c
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0715]
【化52】
[0716][0717]
(化合物ap
‑
c
‑
1的合成)
[0718]
氮气流下，向乙腈(4.3ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
4(0.34g,0.50mmol)，在冰冷下依次加三乙基胺(0.88ml,6.34mmol)、1,2,4
‑
三唑(0.29g,4.22mmol)、氯化磷酰(99μl,1.06mmol)，在冰冷下搅拌2小时。将反应液用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，各自分级分离为有机层和水层。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，通过用无水硫酸钠干燥而减压馏去而得到中间体。向1,4
‑
二噁烷(4.4ml)溶解得到的中间体，加28％氨水(1.1ml)，在室温下搅拌1.5小时。通过进行得到的反应液的减压馏去而得到中间体。将得到的中间体用甲苯进行共沸脱水之后，氮气流下，溶解于二氯甲烷(4.3ml)，在冰冷下依次加三乙基胺(0.14ml,1.06mmol)、苯甲酰氯(0.11ml,0.95mmol)，在室温下进行搅拌11小时。将反应液用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用二氯甲烷、水进行稀释，各自分级分离为有机层和水层。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝7:1～3:3)纯化，以化合物ap
‑
c
‑
1(0.29g,74％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.95
‑
1.12(28h,m),1.84
‑
1.95,2.00
‑
2.09(2h,m),2.13(3h,d,j＝1hz),2.61,2.99(2h,abq,j＝11hz),2.74
‑
2.83,3.00
‑
3.09(2h,m),3.49
‑
3.56(2h,m),3.68,4.07(2h,abq,j＝13hz),3.99(1h,d,j＝3hz),4.39(1h,d,j＝3hz),6.20(1h,s),7.01(1h,m),7.42
‑
7.47(2h,m),7.51
‑
7.57(1h,m),7.90(1h,d,j＝1hz),8.30
‑
8.33(2h,m),13.46(1h,s)。(化合物ap
‑
c
‑
2的合成)
[0719]
向四氢呋喃(20ml)溶解化合物ap
‑
c
‑
1(1.98g,2.47mmol)，依次加醋酸(0.20ml,3.57mmol)、氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,5.4ml,5.4mmol)，于室温搅拌20分钟。进行得到的反应液的减压馏去，将残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇＝80:1～60:1)去除反应
残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，氮气流下，溶解于吡啶(25ml)。加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.21g,3.57mmol)，于室温搅拌15小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝2:1～1:1)纯化，以化合物ap
‑
c
‑
2(1.64g,79％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ1.64(3h,s),1.81
‑
1.91,1.98
‑
2.08(2h,m),2.51(1h,d,j＝9hz),2.70
‑
2.77,2.94
‑
3.02(2h,m),2.77,2.86(2h,abq,j＝12hz),3.34,3.42(2h,abq,j＝11hz),3.47
‑
3.56(2h,m),3.80(6h,d＝1hz),4.28(1h,dd,j＝3,9hz),4.43(1h,d,j＝3hz),6.33(1h,s),6.84
‑
6.88(5h,m),7.23
‑
7.48(11h,m),7.50
‑
7.56(1h,m),7.95(1h,s),8.28
‑
8.30(2h,m),13.45(1h,brs)。
[0720]
(化合物ap
‑
c
‑
3的合成)
[0721]
氮气流下，将化合物ap
‑
c
‑
2(8.49g,5.26mmol)用乙腈进行共沸干燥，溶解于乙腈(95ml)。依次加4,5
‑
二氰基咪唑(1.32g,11.17mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(4.0ml,12.18mmol)，于室温搅拌1.5小时。对反应液进行冷却，用水停止反应之后，用醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析纯化，以化合物ap
‑
c
‑
3(8.31g,86％)作为黄色泡状固体得到。
31
p nmr(cdcl3)δ148.9,149.6.hrms(maldi)：calcd for c
53
h
61
f3n7nao
10
p[m na

]1066.4062,found 1066.4037
[0722]
[合成例3]
[0723]
base是n
‑
苯甲酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是三氟甲基羰基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物ap
‑
a
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0724]
【化53】
[0725][0726]
(化合物ap
‑
a
‑
1的合成)
[0727]
氮气流下，向甲苯(75ml)溶解化合物ap
‑
t
‑
4(4.80g,7.05mmol)，依次加n6‑
苯甲酰腺嘌呤(2.78g,11.63mmol)、n,o
‑
双三甲基甲硅烷基乙酰胺(9.0ml,36.35mmol)，于90℃搅拌0.5小时。接下来，加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(2.0ml,11.63mmol)，于90℃搅拌1小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对反应液
进行硅藻土过滤而回收滤液。将回收的滤液各自分级分离为有机层和水层，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝1:1～1:2)纯化，以化合物ap
‑
a
‑
1(5.06g,87％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ0.99
‑
1.13(28h,m),1.90
‑
1.98,2.05
‑
2.16(2h,m),2.68,3.07(2h,abq,j＝11hz),2.81
‑
2.90,3.05
‑
3.16(2h,m),3.51
‑
3.63(2h,m),3.72,4.04(2h,abq,j＝13hz),4.50(1h,d,j＝3hz),4.82(1h,d,j＝3hz),6.67(1h,s),7.09(1h,m),7.51
‑
7.57(2h,m),7.60(1h,m),8.02
‑
8.05(2h,m),8.36(1h,s),8.81(1h,s),9.10(1h,s)。
[0728]
(化合物ap
‑
a
‑
2的合成)
[0729]
向四氢呋喃(60ml)溶解化合物ap
‑
a
‑
1(5.05g,6.36mmol)，依次加醋酸(0.48ml,8.44mmol)、氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,13.7ml,13.7mmol)，于室温搅拌20分钟。进行得到的反应液的减压馏去，将残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇＝30:1～10:1)去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，氮气流下，溶解于吡啶(40ml)。加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(2.86g,8.44mmol)，于室温搅拌14小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝60:1)纯化，以化合物ap
‑
a
‑
2(5.05g,91％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ1.88
‑
1.97,2.07
‑
2.13(2h,m),2.63(1h,d,j＝9hz),2.79
‑
2.88,3.03
‑
3.09(2h,m),2.94,3.00(2h,abq,j＝12hz),3.38,3.42(2h,abq,j＝11hz),3.50
‑
3.63(2h,m),3.79(6h,s),4.46(1h,dd,j＝3,8hz),4.73(1h,d,j＝3hz),6.75(1h,s),6.81
‑
6.86(4h,m),7.00(1h,m),7.20
‑
7.46(9h,m),7.50
‑
7.55(2h,m),7.59
‑
7.64(1h,m),8.00
‑
8.03(2h,m),8.36(1h,s),8.81(1h,s),9.14(1h,s)。
[0730]
(化合物ap
‑
a
‑
3的合成)
[0731]
氮气流下，将化合物ap
‑
a
‑
2(5.05g,5.91mmol)用乙腈进行共沸干燥，溶解于乙腈(67ml)。依次加4,5
‑
二氰基咪唑(0.77g,6.50mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(2.4ml,7.33mmol)，于室温搅拌2.5小时。用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝45:55～20:80)纯化，以化合物ap
‑
a
‑
3(5.57g,89％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(cdcl3)δ149.1,149.4.hrms(maldi)：calcd for c
53
h
59
f3n9nao9p[m na

]1076.4018,found 1076.4013[合成例4]
[0732]
base是n
‑
异丁酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是三氟甲基羰基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物ap
‑
g
‑
2”)根据下述反应方案而合成。
[0733]
【化54】
[0734][0735]
(化合物ap
‑
g
‑
1的合成)
[0736]
氮气流下，向甲苯(154ml)于60℃溶解化合物ap
‑
t
‑
4(9.31g,13.67mmol)，依次加n2‑
异丁酰鸟嘌呤(4.66g,21.06mmol)、n,o
‑
双三甲基甲硅烷基乙酰胺(22.3ml,90.24mmol)，于100℃搅拌0.5小时。接下来，加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(3.8ml,21.06mmol)，于100℃搅拌1小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对反应液进行硅藻土过滤而回收滤液。将回收的滤液各自分级分离为有机层和水层，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝1:1～1:2)去除反应残渣，得到中间体。向四氢呋喃(150ml)溶解得到的中间体，依次加醋酸(1.1ml,19.89mmol)、氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,27.8ml,27.8mmol)，于室温搅拌30分钟。进行得到的反应液的减压馏去，将残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇＝15:1～7:1)去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，氮气流下，溶解于吡啶(120ml)。加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(6.29g,18.56mmol)，于室温搅拌16.5小时。对反应液进行冷却，用甲醇停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝4:1～醋酸乙酯:甲醇～100:1、氯仿:甲醇＝98:2～96:4)纯化，以化合物ap
‑
g
‑
1(7.69g,61％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(cdcl3)δ1.23(6h,dd,j＝2,7hz),1.76
‑
1.82,2.18
‑
2.22(2h,m),2.69
‑
2.76(1h,m),2.78
‑
2.87,3.03
‑
3.07(2h,m),2.97,3.02(2h,abq,j＝12hz),3.20(1h,d,j＝8hz),3.36
‑
3.48,4.07
‑
4.18(2h,m),3.41,3.46(2h,abq,j＝11hz),3.77(6h,s),4.22(1h,d,j＝3hz),4.36(1h,dd,j＝3,7hz),6.80
‑
6.84(5h,m),6.97(1h,m),7.16
‑
7.50(9h,m),7.83(1h,s),9.82(1h,s),12.14(1h,s)。
[0737]
(化合物ap
‑
g
‑
2的合成)
[0738]
氮气流下，将化合物ap
‑
g
‑
1(7.52g,9.00mmol)用乙腈进行共沸干燥，溶解于乙腈(91ml)。依次加4,5
‑
二氰基咪唑(1.18g,10.0mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(3.5ml,10.91mmol)，于室温搅拌14.5小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢
钠水停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯＝45:55～20:80)纯化，以化合物ap
‑
g
‑
2(7.27g,78％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(cdcl3)δ149.1,149.2.hrms(maldi)：calcd for c
50
h
61
f3n9nao
10
p[m na

]1058.4123,found 1058.4139
[0739]
[合成例5]
[0740]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是二甲基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物dt
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0741]
【化55】
[0742][0743]
(化合物dt
‑
1的合成)
[0744]
氮气流下，向氢化钠(60％in oil,4.58g,11.45mmol)的甲苯悬浮液(200ml)在冰冷下缓慢地滴下3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
丙醇(15.9ml,136.2mmol)，在冰冷下搅拌30分钟。其后，将p
‑
甲苯磺酰氯化物(21.67g,113.7mmol)分3次加之后，解下冰浴，于室温2小时搅拌30分钟。接下来，在冰冷下缓慢地滴下3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
丙醇(3.0ml,25.7mmol)，于室温搅拌35分钟。其后，再次在冰冷下缓慢地滴下3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
丙醇(1.0ml,8.6mmol)，于室温搅拌30分钟。在冰冷下加水，用甲苯提取，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去至滤液略微白浊，直接在以下的反应中使用得到的p
‑
甲苯磺酸3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
丙基的甲苯溶液。向化合物t
‑
1(40g,75.8mmol)的甲苯溶液(240ml)于室温加n,n
‑
二异丙基乙基胺(30ml,175mmol)，将反应溶液加温到100℃。经1小时10分钟滴下首先调制的p
‑
甲苯磺酸3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
丙基的甲苯溶液，在100℃进一步搅拌30分钟。其后将反应溶液设于室温，减压馏去溶剂，将得到的残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:三乙基胺:甲醇＝20:1:0～20:1:2)纯化，以化合物dt
‑
1(23.47g,51％)作为白色泡状固体得到。1hnmr(dmso
‑
d6)δ0.90
‑
1.12(28h,m),1.61
‑
1.83(2h,m),1.74(3h,s),2.11(6h,s),2.19
‑
2.34(2h,m),2.69
‑
2.81(4h,m),3.64(1h,d,j＝13hz),3.92(1h,d,j＝3hz),4.04(1h,d,j＝13hz),4.36(1h,d,j＝3hz),6.11(1h,s),7.49(1h,s),11.40(1h,brs)。
[0745]
(化合物dt
‑
2的合成)
[0746]
氮气流下，向化合物dt
‑
1(3.00g,4.90mmol)的四氢呋喃溶液(60ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,10.3ml,10.3mmol)，于室温搅拌45分钟。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝7:1～6:1)过短柱而去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶，接下来用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸之后，向吡啶(60ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(4.31g,12.72mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。次日朝，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，接下来用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝1:0～10:1)、接下来由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:1:1～20:2:1)纯化，以化合物dt
‑
2(2.92g,89％)作为白色泡状固体(一部分淡黄色泡状固体)得到。1h nmr(cdcl3)δ1.44(3h,s),1.63
‑
1.90(2h,m),2.22(6h,s),2.29
‑
2.46(2h,m),2.78
‑
2.96(2h,m),2.73(1h,d,j＝12hz),2.85(1h,d,j＝12hz),3.33(1h,d,j＝11hz),3.37(1h,d,j＝12hz),3.79(6h,s),4.24(1h,d,j＝3hz),4.36(1h,d,j＝3hz),6.33(1h,s),6.83
‑
6.86(4h,m),7.21
‑
7.46(9h,m),7.76(1h,s)。
[0747]
(化合物dt
‑
3的合成)
[0748]
氮气流下，向化合物dt
‑
2(1.68g,2.50mmol)的乙腈溶液(40ml)在冰冷下加4,5
‑
二氰基咪唑(0.354g,3.00mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(1.20ml,3.78mmol)，于室温3小时搅拌30分钟。在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，接下来用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:0:1～20:2:1)纯化，以化合物dt
‑
3(1.95g,89％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(dmso
‑
d6)δ148.62,147.25.hrms(maldi)：calcd for c
46
h
61
n6nao9p[m na

]895.4130,found 895.4117[合成例6]
[0749]
base是n
‑
苯甲酰
‑5‑
甲基胞嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是二甲基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物dc
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0750]
【化56】
[0751][0752]
(化合物dc
‑
1的合成)
[0753]
氮气流下，向化合物dt
‑
1(4.0g,6.53mmol)的乙腈溶液(60ml)在冰冷下加三乙基胺(10.9ml,78.4mmol)、1,2,4
‑
三唑(3.61g,52.2mmol)之后，缓慢地滴下氯化磷酰(1.25ml,13.41mmol)，在冰冷下搅拌2小时30分钟。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去滤液，得到白色固体(4.94g)。接下来，向1,4
‑
二噁烷(60ml)溶解得的白色固体，加28％氨水(15ml)，在室温下持续搅拌1小时30分钟。减压馏去溶剂，将得到的残渣用吡啶共沸1次、用吡啶:甲苯＝1:1的混合溶剂共沸1次之后溶于二氯甲烷(60ml)，在冰冷下加三乙基胺(1.72ml,12.37mmol)、苯甲酰氯(1.14ml,9.89mmol)，于室温一晚搅拌。在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝100:0:1～80:1:1)纯化，以化合物dc
‑
1(3.42g,73％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ0.92
‑
1.12(28h,m),1.62
‑
1.75(2h,m),1.99(3h,d,j＝1hz),2.11(6h,s),2.19
‑
2.32(2h,m),2.67
‑
2.83(2h,m),2.73(1h,d,j＝11hz),2.81(1h,d,j＝12hz),3.65(1h,d,j＝13hz),3.91(1h,d,j＝3hz),4.07(1h,d,j＝13hz),4.43(1h,d,j＝3hz),6.13(1h,s),7.46
‑
7.51(2h,m),7.56
‑
7.61(1h,m),7.78(1h,d,j＝1hz),8.14
‑
8.17(2h,m),12.8(1h,brs)。
[0754]
(化合物dc
‑
2的合成)
[0755]
氮气流下，向化合物dc
‑
1(1.21g,1.69mmol)的四氢呋喃溶液(25ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,3.55ml,3.55mmol)，于室温搅拌30分钟。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝15:1)过短柱而去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶共沸1次、接下来，用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸1次之后，向吡啶(32ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.26g,3.72mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。次日朝，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(0.23g,0.68mmol)，于室温搅拌3小时。在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋
酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝100:1～30:1)纯化，以化合物dc
‑
2(1.25g,95％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ1.54(3h,s),1.60
‑
1.76(2h,m),2.12(6h,s),2.19
‑
2.34(2h,m),2.63
‑
2.87(4h,m),3.23(1h,d,j＝11hz),3.27(1h,d,j＝11hz),3.75(6h,s),4.08
‑
4.11(1h,m),4.33(1h,d,j＝3hz),5.63(1h,d,j＝5hz),6.16(1h,s),6.91
‑
6.95(4h,m),7.24
‑
7.52(11h,m),7.57
‑
7.62(1h,m),7.93(1h,s),8.13
‑
8.16(2h,m),12.8(1h,brs)。
[0756]
(化合物dc
‑
3的合成)
[0757]
氮气流下，在冰冷下向化合物dc
‑
2(2.28g,2.94mmol)的乙腈溶液(47ml)加4,5
‑
二氰基咪唑(0.417g,3.53mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(1.40ml,4.41mmol)，于室温2小时搅拌30分钟。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:三乙基胺＝30:1～20:1)纯化，以化合物dc
‑
3(2.46g,86％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(dmso
‑
d6)δ148.89,147.22.hrms(maldi)：calcd for c
53
h
66
n7nao9p[m na

]998.4552,found 998.4556
[0758]
[合成例7]
[0759]
base是n
‑
苯甲酰
‑
腺嘌呤
‑9‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是二甲基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物da
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0760]
【化57】
[0761][0762]
(化合物da
‑
1的合成)
[0763]
氮气流下，向化合物dt
‑
1(2.00g,3.26mmol)的甲苯溶液(35ml)依次加n6‑
苯甲酰腺嘌呤(0.820g,3.43mmol)、n,o
‑
双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(3.25ml,13.2mmol)，升温至100℃，直接于100℃搅拌20分钟。其后，在室温下搅拌5分钟之后滴下三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(0.620ml,3.43mmol)，加温至100℃，直接于100℃1小时搅拌20分钟。其后，在冰冷下
加饱和碳酸氢钠水，接下来，用水和醋酸乙酯稀释之后，进行硅藻土过滤。将滤液用醋酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝50:1)纯化，以化合物da
‑
1(1.78g,75％)作为黄色泡状固体得到。1h nmr(dmso)0.93
‑
1.17(28h,m),1.71
‑
1.78(2h,m),2.15(6h,s),2.25
‑
2.38(2h,m),2.77
‑
2.92(4h,m),3.68(1h,d,j＝13hz),4.00(1h,d,j＝13hz),4.62(1h,d,j＝3hz),4.98(1h,d,j＝3hz),6.71(1h,s),7.54
‑
7.57(2h,m),7.63
‑
7.67(1h,m),8.03
‑
8.06(2h,m),8.44(1h,s),8.69(1h,s),11.3(1h,brs)。
[0764]
(化合物da
‑
2的合成)
[0765]
氮气流下，向化合物da
‑
1(1.26g,1.74mmol)的四氢呋喃溶液(32ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,3.65ml,3.65mmol)，于室温搅拌30分钟。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝10:1)过短柱去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶、接下来用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸之后，向吡啶(32ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.18g,3.48mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去滤液，将得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:0:1～20:4:1)纯化，以化合物da
‑
2(1.24g,91％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(dmso)δ1.69
‑
1.79(2h,m),2.15(6h,s),2.24
‑
2.40(2h,m),2.73
‑
2.98(4h,m),3.18(1h,d,j＝11hz),3.27
‑
3.32(1h,m),3.72(6h,s),4.40
‑
4.43(1h,m),4.68(1h,d,j＝3hz),5.52(1h,d,j＝6hz),6.73(1h,s),6.84
‑
6.87(4h,m),7.19
‑
7.41(9h,m),7.52
‑
7.58(2h,m),7.62
‑
7.68(1h,m),8.03
‑
8.06(2h,m),8.52(1h,s),8.78(1h,s),11.2(1h,brs)。
[0766]
(化合物da
‑
3的合成)
[0767]
在氮气流下，在冰冷下向化合物da
‑
2(191.3mg,0.24mmol)的乙腈溶液(5ml)加4,5
‑
二氰基咪唑(34.5mg,0.29mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(0.116ml,0.37mmol)，于室温搅拌4小时。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，接下来，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去滤液，将得到的粗产物由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝80:1)纯化，以化合物da
‑
3(189.8mg,79％)作为淡黄色泡状固体(一部分白色泡状固体)得到。
31
p nmr(dmso
‑
d6)δ148.76,148.06.hrms(maldi)：calcd for c
53
h
64
n9nao8p[m na

]1008.4508,found 1008.4513[合成例8]
[0768]
base是n
‑
异丁酰
‑
鸟嘌呤
‑9‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是二甲基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物dg
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0769]
【化58】
[0770][0771]
(化合物dg
‑
1的合成)
[0772]
氮气流下，向化合物dt
‑
1(113.1mg,0.18mmol)的甲苯溶液(2.0ml)依次加n2‑
异丁酰鸟嘌呤(65.3mg,0.30mmol)、n,o
‑
双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(0.275ml,1.113mmol)，升温至95℃，直接于95℃搅拌50分钟。其后，在室温下搅拌5分钟之后滴下三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(0.052ml,0.29mmol)，于95℃2小时搅拌30分钟。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，接下来，用水和醋酸乙酯稀释之后，进行硅藻土过滤。将得到的滤液用醋酸乙酯提取，将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝30:1～20:1)纯化，以化合物dg
‑
1(88.8mg,68％)作为黄色泡状固体得到。1hnmr(dmso
‑
d6)δ0.93
‑
1.09(28h,m),1.12(6h,d,j＝7hz),1.67
‑
1.71(2h,m),2.13(6h,s),2.20
‑
2.37(2h,m),2.73
‑
2.89(5h,m),3.68(1h,d,j＝13hz),4.03(1h,d,j＝13hz),4.21(1h,d,j＝3hz),4.70(1h,d,j＝3hz),6.40(1h,s),7.91(1h,s),12.2(1h,brs)。
[0773]
(化合物dg
‑
2的合成)
[0774]
氮气流下，向化合物dg
‑
1(2.56g,3.61mmol)的四氢呋喃溶液(58ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,7.6ml,7.6mmol)，于室温搅拌30分钟。其后，通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝8:1～5:1)过短柱而去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶，接下来用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸之后，向吡啶(60ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(3.18g,9.40mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去滤液，将得到的粗产物由硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝50:1～7:1)、接下来由硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝15:1～5:1)纯化，以化合物dg
‑
2(2.47g,89％)作为白色泡状固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ1.12(6h,dd,j＝1.2hz,j＝6.8hz),1.78
‑
1.86(2h,m),2.43(6h,brs),2.67(1h,brs),2.77
‑
2.94(4h,m),3.14
‑
3.22(5h,m),3.73(6h,s),4.25(1h,brs),4.62(1h,d,j＝2.8hz),5.57(1h,brs),6.45(1h,s),6.84
‑
6.88(4h,m),7.20
‑
7.38(9h,m),8.08(1h,s),12.15(1h,brs)。
[0775]
(化合物dg
‑
3的合成)
[0776]
在氮气流下，在冰冷下，向化合物dg
‑
2(1.11g,1.45mmol)的乙腈溶液(50ml)加4,5
‑
二氰基咪唑(0.21g,1.75mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(0.69ml,2.18mmol)，于室温一晚搅拌。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，减压馏去滤液，将得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:0:1～20:2:1)纯化，以化合物dg
‑
3(1.11g,79％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(dmso
‑
d6)δ148.97,147.81.hrms(maldi)：calcd for c
50
h
66
n9nao9p[m na

]990.4613,found 990.4604
[0777]
[合成例9]
[0778]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚己基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是二甲基氨基的化合物(1)(以下，称为“化合物dh
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0779]
【化59】
[0780][0781]
(化合物dh
‑
1的合成)
[0782]
氮气流下，将氢化钠(2.27g,56.82mmol)悬浮于甲苯(86ml)，加6
‑
二甲基氨基
‑1‑
己醇(8.6ml,51.65mmol)，在冰冷下搅拌30分钟。接下来，加p
‑
甲苯磺酰氯化物(10.83g,56.82mmol)之后，在室温下将6
‑
二甲基氨基
‑1‑
己醇(7.38ml,44.44mmol)分3次加而搅拌4小时。对反应液进行冷却，用水停止反应之后，用甲苯进行稀释，各自分级分离为有机层和水层。将有机层用饱和生理盐水清洗之后，通过使有机层合并，使用无水硫酸钠干燥，减压馏去而得到p
‑
甲苯磺酸3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
己基的甲苯溶液90ml。氮气流下，向甲苯(35ml)溶解化合物t
‑
1(5.0g,9.47mmol)，加n,n
‑
二异丙基胺(13.1ml,75.76mmol)之后，于100℃经1.5小时滴下先调制的p
‑
甲苯磺酸3
‑
(二甲基氨基)
‑1‑
己基的甲苯溶液，直接搅拌1小时。将反应液冷却至室温后，过滤而回收滤液。减压馏去回收的滤液，将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯:三乙基胺＝16:4:1～20:1:1)纯化，以化合物dh
‑
1(1.02g,16％)作为淡
黄色泡状固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ0.95
‑
1.14(28h,m),1.29
‑
1.54(8h,m),1.74(3h,d,j＝1hz),2.09(6h,s),2.16(3h,t,j＝7hz),2.70,2.78(2h,abq,j＝11hz),2.61
‑
2.83(2h,m),3.64,4.04(2h,abq,j＝13hz),3.92(1h,d,j＝3hz),4.35(1h,d,j＝3hz),6.10(1h,s),7.49(1h,d,j＝1hz),11.34(1h,s)。
[0783]
(化合物dh
‑
2的合成)
[0784]
向四氢呋喃(10ml)溶解化合物dh
‑
1(1.02g,1.55mmol)，依次加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,3.3ml,3.3mmol)，于室温搅拌30分钟。进行得到的反应液的减压馏去，将残渣由硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝10:1～8:1)去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶进行共沸干燥，氮气流下，溶解于吡啶(20ml)。加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.05g,3.10mmol)，于室温搅拌14.5小时。追加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.05g,3.10mmol)，于室温搅拌9小时之后，追加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(0.54g,1.59mmol)，于室温搅拌15小时。对反应液进行冷却，用甲醇停止反应之后，用水、醋酸乙酯进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用饱和碳酸氢钠水、饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而减压馏去。将得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:1:1～20:3:1)纯化，以化合物dh
‑
2(0.70g,63％)作为淡黄色泡状固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ1.27
‑
1.50(8h,m),1.31(3h,s),2.08(6h,s),2.15(2h,t,j＝7hz),2.57
‑
2.68,2.72
‑
2.84(2h,m),2.72(2h,s),3.20(2h,s),3.74(6h,s),4.04
‑
4.06(1h,m),4.21(2h,d,j＝3hz),5.54(1h,d,j＝5hz),6.11(1h,s),7.22
‑
7.44(9h,m),7.62(1h,d,j＝1hz),11.25(1h,s)。
[0785]
(化合物dh
‑
3的合成)
[0786]
氮气流下，将化合物dh
‑
2(294mg,0.41mmol)用乙腈进行共沸干燥，溶解于乙腈(4.5ml)。依次加4,5
‑
二氰基咪唑(54mg,0.46mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(164μl,0.50mmol)，于室温搅拌2.5小时。对反应液进行冷却，用饱和碳酸氢钠水停止反应之后，用醋酸乙酯、水进行稀释，对有机层进行分级分离。将得到的有机层用水和饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥而浓缩。将得到的粗产物由硅胶柱层析(己烷:醋酸乙酯:三乙基胺＝20:1:1～20:2:1、醋酸乙酯:己烷＝4:1～6:1)纯化，以化合物dh
‑
3(255mg,66％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(cdcl3)δ148.7,148.9.hrms(maldi)：calcd for c
49
h
67
n6nao9p[m na

]937.4599,found 937.4611
[0787]
[合成例10]
[0788]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是4
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基的化合物(1)(以下，称为“化合物pip
‑
t
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0789]
【化60】
[0790][0791]
(化合物pip
‑
t
‑
1的合成)
[0792]
向化合物t
‑
1(4.0g、7.58mmol)的甲苯溶液(100ml)于室温加1,3
‑
二溴丙烷(3.45ml,33.8mmol)、三乙基胺(7.4ml,53.2mmol)，升温至100℃，搅拌3小时。将反应溶液设于室温，加1
‑
甲基哌嗪(3.8ml,34.1mmol)，再升温至100℃，3小时搅拌30分钟。其后，将反应溶液设为室温之后，进行硅藻土过滤，将减压馏去滤液而得到的残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺:二氯甲烷＝22:2:1:75)纯化，以化合物pip
‑
t
‑
1(2.46g,49％)作为白色固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ0.90
‑
1.04(28h,m),1.67
‑
1.80(5h,m),2.20
‑
2.58(13h,m),2.67
‑
2.80(4h,m),3.64(1h,d,j＝14hz),3.92(1h,d,j＝3hz),4.04(1h,d,j＝14hz),4.37(1h,d,j＝3hz),6.11(1h,s),7.49(1h,d,j＝1hz),11.41(1h,s)。
[0793]
(化合物pip
‑
t
‑
2的合成)
[0794]
氮气流下，向化合物pip
‑
t
‑
1(0.894g,1.34mmol)的四氢呋喃溶液(24ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,2.80ml,2.80mmol)，于室温搅拌40分钟。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氧化铝柱层析(氯仿:甲醇＝10:1)过短柱去除反应残渣，得到中间体。接下来，将得的中间体用吡啶、接下来用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸之后，向吡啶(22ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.179g,3.48mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。次日朝，在冰冷下追加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(0.181g,0.534mmol)，于室温2小时搅拌30分钟。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，通过将减压馏去滤液而得到的粗产物用硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:0:1～20:1:1)纯化而以化合物pip
‑
t
‑
2(0.656g,67％)作为白色固体得到。1h nmr(dmso
‑
d6)δ1.31(3h,s),1.60
‑
1.71(2h,m),2.07
‑
2.56(13h,m),2.61
‑
2.83(4h,m),3.16
‑
3.23(2h,m),4.05
‑
4.07(1h,m),4.21
‑
4.22(1h,m),5.54(1h,d,j＝6hz),6.11(1h,s),6.90
‑
6.92(4h,m),7.23
‑
7.44(9h,m),7.62(1h,s),11.36(1h,s)。
[0795]
(化合物pip
‑
t
‑
3的合成)
[0796]
氮气流下，向化合物pip
‑
t
‑
2(0.496g,0.68mmol)的乙腈溶液(25ml)在冰冷下加4,
5
‑
二氰基咪唑(0.121g,1.02mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(0.390ml,1.23mmol)，于室温搅拌5小时。在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，接下来用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，通过将减压馏去滤液而得到的粗产物用硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇:三乙基胺＝20:0:1～20:1:1)纯化而以化合物pip
‑
t
‑
3(0.490g,78％)作为白色泡状固体得到。
31
p nmr(dmso
‑
d6)δ148.62,147.22.hrms(maldi)：calcd for c
49
h
66
n7nao9p[m na

]950.4552,found950.4546
[0797]
[合成例11]
[0798]
base是胸腺嘧啶
‑1‑
基，a1是亚甲基，a2是单键，x是n
‑
亚丙基，r1是dmtr，r2是
‑
p(n(i
‑
pr)2)(oc2h4cn)，r3是nhc(＝ncoc2h4cn)(nhcoc2h4cn)的化合物(1)(以下，称为“化合物gua
‑
t
‑
3”)根据下述反应方案而合成。
[0799]
【化61】
[0800][0801]
(化合物ce
‑
1的合成)
[0802]
向2
‑
氰基乙醇(1.85ml,27.3mmol)的乙腈溶液(160ml)在冰冷下加碳酸n,n'
‑
二琥珀酰亚胺基(8.0g,31.2mmol)、吡啶(2.7ml,33.5mmol)，于室温8小时搅拌30分钟。减压馏去反应溶液，向得到的残渣加二氯甲烷和饱和碳酸氢钠水，用二氯甲烷提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(二氯甲烷:乙腈＝1:0～4:1)纯化，以化合物ce
‑
1(5.58g,96％)作为白色固体得到。1hnmr(cdcl3)δ2.86(2h,t,j＝6hz),2.87(4h,s),4.53(2h,t,j＝7hz)。
[0803]
(化合物ce
‑
2的合成)
[0804]
向化合物ce
‑
1(2.5g,11.8mmol)的二氯甲烷溶液(50ml)加s
‑
甲基异硫脲硫酸盐
(0.78g,5.6mmol)、1.0m碳酸氢钠水溶液(22.4ml,22.4mmol)，于室温7小时30分钟剧烈搅拌。其后，加饱和碳酸氢钠水，用二氯甲烷提取，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(二氯甲烷:醋酸乙酯＝1:0～10:1)纯化，以化合物ce
‑
2(0.60g,38％)作为淡黄色油状物质得到。1hnmr(cdcl3)δ2.46(3h,s),2.80(4h,t,j＝6hz),4.37
‑
4.42(4h,m),11.81(1h,brs)。
[0805]
(化合物gua
‑
t
‑
1的合成)
[0806]
氮气流下，向化合物ap
‑
t
‑
7(1.40g、1.96mmol)的四氢呋喃溶液(30ml)在冰冷下加氟化四
‑
n
‑
丁基铵(1m四氢呋喃溶液,4.1ml,4.1mmol)，于室温搅拌30分钟。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由硅胶柱层析(醋酸乙酯:甲醇＝20:1～6:1)过短柱而去除反应残渣，得到中间体。将得到的中间体用吡啶、接下来用吡啶:甲苯(＝1:1)混合溶液共沸之后，向吡啶(30ml)溶解中间体，在冰冷下加4,4'
‑
二甲氧基三苯甲基氯化物(1.00g,2.95mmol)，解下冰浴，于室温搅拌一晚。次日朝，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(醋酸乙酯:己烷＝1:1～1:0)纯化，以化合物gua
‑
t
‑
1(1.51g,99％)作为白色泡状固体得到。1hnmr(cdcl3)δ1.45(3h,d,j＝1hz),1.95
‑
2.12(2h,m),2.57(1h,d,j＝9hz),2.70
‑
2.83(3h,m),2.90
‑
3.00(1h,m),3.31(1h,d,j＝10hz),3.37(1h,d,j＝10hz),3.76
‑
3.87(8h,m),4.23(1h,dd,j＝3hz,j＝9hz),4.36(1h,d,j＝3hz),6.30(1h,s),6.82
‑
6.87(4h,m),7.22
‑
7.45(9h,m),7.66
‑
7.71(2h,m),7.73(1h,d,j＝1hz),7.80
‑
7.85(2h,m),8.23(1h,s)。
[0807]
(化合物gua
‑
t
‑
2的合成)
[0808]
向化合物gua
‑
t
‑
1(1.01g,1.30mmol)的甲醇溶液(22ml)加肼一水合物(0.19ml,3.91mmol)，于室温8小时搅拌40分钟。其后，追加肼一水合物(0.075ml,1.54mmol)，于室温一晚搅拌。通过使将溶剂减压馏去而得到的残渣由氨基硅胶柱层析(二氯甲烷:甲醇＝5:1～4:1)过短柱而去除反应残渣，得到中间体。接下来，向二甲基甲酰胺(7.5ml)溶解得的中间体，加化合物ce
‑
2(0.38g,1.34mmol)、三乙基胺(0.182ml,1.31mmol)，于室温搅拌4小时。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(二氯甲烷:醋酸乙酯:己烷＝1:2:2～0:1:0)纯化，以化合物gua
‑
t
‑
2(0.79g,69％)作为白色泡状固体得到。1hnmr(cdcl3)δ1.45(3h,s),1.88
‑
2.05(2h,m),2.61(1h,d,j＝9hz),2.72
‑
2.87(7h,m),2.91
‑
2.98(1h,m),3.33(1h,d,j＝10hz),3.38(1h,d,j＝11hz),3.54
‑
3.61(2h,m),3.80(6h,s),4.24
‑
4.31(3h,m),4.35
‑
4.42(3h,m),6.32(1h,s),6.86
‑
6.84(4h,m),7.23
‑
7.45(9h,m),7.75(1h,s),8.36(1h,t,j＝6hz),8.39(1h,s),11.73(1h,s)。
[0809]
(化合物gua
‑
t
‑
3的合成)
[0810]
氮气流下，向化合物gua
‑
t
‑
2(0.50g,0.57mmol)的乙腈溶液(25ml)在冰冷下加4,5
‑
二氰基咪唑(81.2mg,0.69mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(0.275ml,0.87mmol)，于室温5小时搅拌30分钟。再在冰冷下追加4,5
‑
二氰基咪唑(67.6mg、0.57mmol)、2
‑
氰基乙基n,n,n',n'
‑
四异丙基磷酸二亚磷酰胺(0.220ml、0.69mmol)，于室温还搅拌3小时。其后，在冰冷下加饱和碳酸氢钠水，用水稀释之后，用醋酸乙酯提取。将得到
的有机层用饱和生理盐水清洗之后，用无水硫酸钠干燥。滤去无水硫酸钠后，将减压馏去滤液而得到的粗产物由硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝50:1)、接下来由硅胶柱层析(醋酸乙酯:己烷＝4:1～10:1)纯化，以化合物gua
‑
t
‑
3(0.50g,81％)作为白色泡状固体得到。
31
pnmr(cdcl3)δ149.27,148.76.hrms(fab)：calcd for c
53
h
66
n
10
o
13
p[m h

]1081.4548,found 1081.4551
[0811]
【寡核苷酸的合成例】
[0812]
寡核苷酸使用在上述合成例中得到的化合物(ap
‑
t
‑
6、dt
‑
3、dh
‑
3、pip
‑
t
‑
3、gua
‑
t
‑
3)，根据标准的的磷酸亚磷酰胺流程而由核酸自动合成机(expedite(商标)8909/abi公司制)合成。得到的5种寡核苷酸具有式(4)所表示的单元，x及r3各自如以下。
[0813]
x＝(ch2)3、r3＝nh2(以下，称为(ch2)3nh2。)
[0814]
x＝(ch2)3、r3＝nme2(以下，称为(ch2)3nme2。)
[0815]
x＝(ch2)6、r3＝nme2(以下，称为(ch2)6nme2。)
[0816]
x＝(ch2)3、r3＝4
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基(以下，称为(ch2)3pip
‑
me。)
[0817]
x＝(ch2)3、r3＝nhc(＝nh)nh2(以下，称为(ch2)3gua。)
[0818]
5'
‑
末端被二甲氧基三苯甲基保护，对于支持在固相的状态的寡核苷酸，各自，进行由28％氨水的从柱的切出(1.5小时)，将切出的寡核苷酸在28％氨水中于60℃反应16小时，进行全部的保护基的脱保护。再者，关于(ch2)3gua，在50％哌啶水溶液中、进行于室温自柱的切出24小时。
[0819]
进行由nap
‑
10柱的简易纯化，由逆相hplc[wakopak(商标)ws
‑
dna柱、10.0mm
×
250mm)纯化[条件：0.1m三乙基铵醋酸缓冲液(ph7.0)中，以3ml/分钟经30分的8～16％乙腈的梯度、柱温度50℃]。
[0820]
合成的寡核苷酸的纯度由逆相hplc[wakopak(商标)ws
‑
dna柱、4.6mm
×
250mm)确认[条件：0.1m三乙基铵醋酸缓冲液(ph7.0)中，以1ml/分钟经30分的8～16％乙腈的梯度、柱温度50℃、检测波长254nm]。再者，合成的寡核苷酸纯度均是90％以上。
[0821]
另外，合成的寡核苷酸的分子量由maldi
‑
tof
‑
mass测定确定。分子量的计算值及实测值(测定结果)示于下表。再者，式(4)所表示的单元整合到下表中的反义链(seq id no:1～4)的x的位置，base是胸腺嘧啶。x以外的碱基序列全部由dna(式(5)r
a
＝h)构成。另外，作为对照，还显示向x的位置整合2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
me)(式(7)r
b
＝me)的寡核苷酸(以下，表中称为me)及整合2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
h)(式(7)r
b
＝h的寡核苷酸(以下，表中称为h)的分子量的计算值及实测值。
[0822]
【表1】
[0823][0824]
【试验例】
[0825]
[试验例1：寡核苷酸的融解温度(tm)测定(双链形成能评价)]
[0826]
通过对将上述合成例中得到的化合物(ap
‑
t
‑
6、dt
‑
3、dh
‑
3、pip
‑
t
‑
3、gua
‑
t3)整合到seq id no:5所示的序列的一部分而合成的本发明的5种寡核苷酸(4)((ch2)3nh2、(ch2)3nme2、(ch2)6nme2、(ch2)3pip
‑
me、(ch2)3gua)(反义链)和单链dna(5'
‑
d(agcaaaaaacgc)
‑
3'；seq id no:6)或单链rna(5'
‑
r(agcaaaaaacgc)
‑
3'；seq id no:7)(正义链)的融解温度(tm)进行测定，研究反义链的双链形成能。另外，作为对照，以将lna(式(6))、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
me)(式(7)r＝me)及2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
h)(式(7)r＝h)整合到seq id no:5所示的序列的一部分而合成的寡核苷酸作为反义链准备。
[0827]
调制将终浓度各自设为氯化钠100mm、磷酸钠缓冲液(ph7.2)10mm、反义链4μm、正义链4μm的样品溶液(120μl)，以0.5℃/分钟从15℃升温至110℃，以0.5℃间隔将260nm处的吸光度由分光光度计(株式会社岛津制作所制uv
‑
1800)测定。
[0828]
从得到的测定值由微分法算出tm值，以独立的至少2次以上的测定结果的平均值作为tm值。结果示于下表。
[0829]
对于单链dna的双链形成能(tm值)
[0830]
【表2】
[0831][0832]
正义链＝5'
‑
d(agcaaaaaacgc)
‑
3'
[0833]
条件：含100mm nacl、10mm磷酸钠缓冲液(ph7.2)、4μm的各链；扫描速率：0.5℃/分钟(15℃～110℃)。
[0834]
对于单链rna的双链形成能(tm值)
[0835]
【表3】
[0836][0837]
正义链＝5'
‑
d(agcaaaaaacgc)
‑
3'
[0838]
条件：含100mm nacl、10mm磷酸钠缓冲液(ph7.2)、4μm的各链；扫描速率：0.5℃/分钟(15℃～110℃)。
[0839]
对于单链dna或单链rna之任一者的靶，本发明的寡核苷酸(4)均随式(4)或(4a)所表示的单元的增加而tm值升高，表明具有优良的双链形成能。从而，本发明的寡核苷酸(4)适宜于要求优良的双链形成能的以dna或rna作为靶的核酸医药或基因诊断的使用。
[0840]
[试验例2：寡核苷酸的酶抗性能测定]
[0841]
(1)酶抗性能测定用寡核苷酸的调制
[0842]
与上述寡核苷酸的合成例同样地，调制具有修饰seq id no:8所示的序列或其一部分的序列的下表的寡核苷酸。
[0843]
【表4】
[0844][0845][0846]
t＝dna
‑
t
[0847]
t
α
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
t
[0848]
t
β
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nme2)
‑
t
[0849]
t
α
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
h)
‑
t
[0850]
t＝lna
‑
t
[0851]
^＝硫代磷酸结合
[0852]
(2)样品溶液的调制
[0853]
样品溶液如下表调制。
[0854]
【表5】
[0855]
试剂终浓度tris hcl ph8.050mmmgcl210mm寡核苷酸7.5μm
[0856]
(3)酶反应
[0857]
使用装置(major science公司制、md
‑
mini)，于37℃温度进行下述操作。
[0858]
(1)将样品溶液温育(5分钟)。
[0859]
(2)添加酶cavp(crotalus adamanteus venom磷酸二酯酶i)至成为0.625μg/ml，开始反应。
[0860]
(3)在反应时间结束时以反应液的浓度成为5.0mm的方式添加edta，停止反应。
[0861]
(4)反应时间设为0分钟、5分钟、10分钟、40分钟、80分钟。
[0862]
(4)酶抗性能的评价
[0863]
对于酶反应结束的样品溶液，在下述条件下进行hplc分析。
[0864]
(条件)
[0865]
装置：lc
‑
2010a ht(岛津制作所公司制)
[0866]
柱：xbridge oligonucleoties beh c18柱2.5μm,4.6mm
×
50mm移动相
[0867]
·
a液：0.1m三乙基铵醋酸缓冲液(ph7.0)
[0868]
·
b液：0.1m三乙基铵醋酸缓冲液(ph7.0):乙腈＝1:1(v/v)梯度：5～30％((v/v)b液)、15分钟)
[0869]
流速：0.8ml/分钟
[0870]
柱温度：50℃
[0871]
检测波长：268nm
[0872]
注入量：15μl(101.2pmol)
[0873]
从hplc分析结果测定酶未消化寡核苷酸的量，将各反应时间的未消化寡核苷酸的残留率(％)由下式算出。
[0874]
【数1】
[0875][0876]
(5)结果
[0877]
结果示于下表及图2。
[0878]
【表6】
[0879][0880]
如从上述结果明了，本发明的寡核苷酸(4)与天然型及其他非天然型的寡核苷酸比较具有优良的酶抗性。
[0881]
[试验例3：寡核苷酸的夹能]
[0882]
(1)夹能测定用寡核苷酸的调制
[0883]
与上述寡核苷酸的合成例同样地，调制下表的寡核苷酸。再者，夹核酸1(seq id no:12)及夹核酸3相当于以往的2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
me)(式(7)r＝me)，夹核酸2(seq id no:12)及夹核酸4相当于本发明的寡核苷酸(4)。
[0884]
【表7】
[0885]
no.寡核苷酸名序列(5'
→
3')长度(mer)1正向引物actgaatata aacttgtggt ag222反向引物attgttggat catattcgtc203扩增确认用探针j
‑
cttgacgata cagctaattc agaatcat
‑
r284夹核酸1gcct
β
ac
β
gc
β
c
β
a c
β
c
β
agc
β
tcc
‑
p185夹核酸2gcct
α
ac
α
gc
α
c
α
a c
α
c
α
agc
α
tcc
‑
p186夹核酸3c
β
c
β
a
β
c
β
c
β
a
β
g
β
c
β
‑
p87夹核酸4c
α
c
α
a
α
c
α
c
α
a
α
g
α
c
α
‑
p8
[0886]
a、c、g、t＝dna
‑
a、dna
‑
c、dna
‑
g、dna
‑
t
[0887]
a
β
、c
β
、g
β
、t
β
＝2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
a、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
g、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
t
[0888]
a
α
、c
α
、g
α
、t
α
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
a、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
g、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
t
[0889]
g＝2'
‑
ome
‑
rna
‑
g；
[0890]
j＝joe；
[0891]
r＝tamra；
[0892]
p＝单磷酸
[0893]
(2)检查试样的制作
[0894]
作为kras基因的野生型基因试样，以市售的human genomic dna(promega公司)，另外，作为g12v变异型基因试样，以从sw480培养细胞提取的dna(dspharma公司)作为模板使用。
[0895]
各dna量由各试样的uv光谱和通过使用正向引物(seq id no:9)、反向引物(seq id no:10)及扩增确认用探针(seq id no:11)的实时pcr得到的ct值求出。
[0896]
基于所述dna量，制作变异型成为10％、1.0％、0.1％、0.01％、及0％的模型检查试样，将各自的模型检查试样以每实验各50ng的量使用。
[0897]
(3)核酸扩增装置及核酸扩增用试剂
[0898]
将steponeplus(abi公司制)在实时pcr装置中使用，将taqman
tm
fast advanced master mix(abi公司制)在核酸扩增用试剂中使用。本试剂的使用量基于附带手册。
[0899]
(4)引物、扩增确认用探针、夹核酸
[0900]
每实验使用各10pmol正向及反向引物，每实验使用2.5pmol扩增确认用探针。作为夹核酸，将具有kras基因野生型的序列的夹核酸1～4各自每实验使用10pmol或1.0pmol。
[0901]
(5)核酸扩增操作及结果
[0902]
将检查试样、核酸扩增用试剂、引物、扩增确认用探针、及夹核酸的混合液用核酸扩增装置，(i)于50℃经2分钟、(ii)于95℃经20秒钟、(iii)于95℃经10秒钟、(iv)于57℃经60秒钟、其后(v)将(iii)～(iv)的操作重复55次。监测由各自的检查试样、各自的夹核酸的扩增确认用探针的核酸扩增过程(至55个循环)。
[0903]
(6)结果
[0904]
使用10pmol夹核酸时的核酸扩增曲线示于图3
‑
1。ct值数据示于下表。表中，m表示变异型，w表示野生型。再者，ct值是指pcr扩增产物达某一定量之时的循环数，δct值是指变异型是0％的试样和各检查试样之间的ct值的差异。
[0905]
在使用夹核酸1～4的实时pcr中的ct值数据(夹核酸的使用量：10pmol)
[0906]
【表8】
[0907][0908]
不使用夹核酸的情况，使用任何模板的pcr均在扩增中确认不到差异，当使用18mer的夹核酸1及2时，伴随模板中的野生型基因的比例增加而ct值变大的等，在扩增中确认到差异。这些结果表明，夹核酸1及2之任一者的寡核苷酸均具有夹能。在使用8mer的夹核酸3及4时，在夹核酸3(以往技术)中大致确认不到夹能，与此相比，夹核酸4(本发明)即使是8mer的短的夹核酸也发挥夹能。这些结果表明，本发明的寡核苷酸(4)还能作为短的夹核酸使用，即使在以在基因的短的区域变异集中的癌或病毒等的基因区域作为靶时，也可作为夹核酸使用。
[0909]
使用1.0pmol夹核酸时的核酸扩增曲线示于图3
‑
2。ct值数据示于下表。
[0910]
在在夹核酸1及2中利用的实时pcr中的ct值数据(夹核酸的使用量：1.0pmol)
[0911]
【表9】
[0912][0913][0914]
当使夹核酸的使用量从10pmol至1.0pmol减少到1/10时，夹核酸1(以往技术)的夹效果大幅地减少。一方面，夹核酸2(本发明)的夹效果未见到变化。从而表明，在本发明的寡核苷酸(4)即使使得使用量进一步变少时，也能实现高灵敏度的夹pcr。
[0915]
[试验例4：寡核苷酸的链侵入测定]
[0916]
(1)链侵入用寡核苷酸的调制
[0917]
与上述寡核苷酸的合成例同样地，调制下表的寡核苷酸。
[0918]
【表10】
[0919]
no.寡核苷酸名序列(5'
→
3')长度(mer)1pna20h
‑
(lys)ggcatgttca tcatcagtaa(lys)
‑
nh2202lsi
‑
15'
‑
ggcatgttca tcatcagtaa
‑
3'203bsi
‑
45'
‑
c
α
a
β
t
α
gt
α
t
α
ca
β
t
α
c
α
a
β
t
α
c
α
a
β
gt
α
‑
3'16
4bsi
‑
55'
‑
g
α
g
α
c
α
a
α
t
β
gt
β
t
β
c
α
a
α
t
β
c
α
at
β
c
α
a
α
g
α
t
β
a
α
a
‑
3'205bsi
‑
65'
‑
g
β
g
β
c
α
a
β
t
β
gt
β
t
β
c
α
a
β
t
β
c
α
at
β
c
α
a
β
g
β
t
β
a
β
a
‑
3'206bsi
‑
115'
‑
g
α
g
α
c
α
a
α
t
α
gt
α
t
α
c
α
a
α
t
α
c
α
at
α
c
α
a
α
g
α
t
α
a
α
a
‑
3'207bsi
‑
125'
‑
g
β
g
β
c
β
a
β
t
β
gt
β
t
β
c
β
a
β
t
β
c
β
at
β
c
β
a
β
g
β
t
β
a
β
a
‑
3'208bsi
‑
185'
‑
ggc
α
at
α
gt
α
t
α
c
α
a t
α
c
α
at
α
c
α
agt
α
aa
‑
3'209bsi
‑
195'
‑
ggc
β
at
β
gt
β
t
β
c
β
a t
β
c
β
at
β
c
β
agt
β
aa
‑
3'2010bsi
‑
215'
‑
a
β
c
α
ga
β
t
β
a
β
c
α
gg
β
g t
β
t
β
a
β
c
α
t
β
‑
3'1511bsi
‑
225'
‑
c
α
g
α
t
β
g
α
a
β
gc
α
a
α
t
β
c
α
ct
β
c
α
t
β
c
α
t
β
c
α
gt
β
t
α
‑
3'20
[0920]
a、c、g、t＝dna
‑
a、dna
‑
c、dna
‑
g、dna
‑
t
[0921]
a、c、g、t＝pna
‑
a、pna
‑
c、pna
‑
g、pna
‑
t
[0922]
a、c、g、t＝lna
‑
a、lna
‑
m
c、lna
‑
g、lna
‑
t
[0923]
c
α
、t
α
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nh2)
‑
t
[0924]
a
β
、c
β
、t
β
＝2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nme2)
‑
a、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nme2)
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
(n
‑
(ch2)3nme2)
‑
t
[0925]
a
α
、c
α
、g
α
、t
α
＝2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
h]
‑
a、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
h]
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
h]
‑
g、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
h]
‑
t
[0926]
a
β
、c
β
、g
β
、t
β
＝2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
a、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
m
c、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
g、2',4'
‑
bna
nc
[n
‑
me]
‑
t
[0927]
再者，lsi
‑
1及bsi
‑
5、6、11、12、18、19具有seq id no:13所示的序列，bsi
‑
4具有seq id no:14所示的序列，bsi
‑
21具有seq id no:25所示的序列，bsi
‑
22具有seq id no:26所示的序列。
[0928]
(2)目标的双链dna[根据chem.commun.,2009,1225
‑
1227]
[0929]
目标的双链dna如下所述。
[0930]
(dna
‑
1)以pbr322质粒(市售品)作为模板的203bp的pcr产物(seq id no:23及24)
[0931]
(dna
‑
2)以pbr322质粒作为基础的人工基因t1825g(市售品)作为模板的203bp的pcr产物
[0932]
(dna
‑
3)以pbr322质粒作为基础的人工基因t1825c(市售品)作为模板的203bp的pcr产物
[0933]
(dna
‑
4)以pbr322质粒作为基础的人工基因t1825a(市售品)作为模板的203bp的pcr产物
[0934]
【表11】
[0935][0936]
再者，dna
‑
1的目标部位的序列是seq id no:15及16所示的序列，dna
‑
2的目标部位的序列是seq id no:17及18所示的序列，dna
‑
3的目标部位的序列是seq id no:19及20所示的序列，dna
‑
4的目标部位的序列是seq id no:21及22所示的序列。
[0937]
(3)基于chem.commun.,2009,1225
‑
1227的方法
[0938]
(1)样品溶液的调制
[0939]
样品溶液如下表调制。
[0940]
【表12】
[0941]
试剂终浓度比例hepes ph7.0(缓冲液)5mm nacl20mm ssb(single
‑
stranded dna binding protein)6μm200目标的双链dna(dna
‑
1)30nm1链侵入用寡核苷酸(pna20、bsi
‑
4～6)200nm6.7
[0942]
(2)反应
[0943]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液于37℃反应120分钟、60分钟、或者30分钟。
[0944]
(3)凝胶变动测定和染色
[0945]
反应结束后，制作2个应用样品溶液的凝胶，在下述的条件同时进行page(poly
‑
acrylamide gel electrophoresis)。使用电泳装置pagerun ae
‑
6531(atto株式会社制)，电泳条件根据装置的附带手册。
[0946]
(条件)
[0947]
凝胶：15％聚丙烯酰胺凝胶
[0948]
电泳缓冲液：三
‑
甘氨酸缓冲液
[0949]
(25mmtris,0.192m甘氨酸ph 8.4,davis法用)
[0950]
样品应用量：12μl(样品10μl 加样缓冲液2μl)
[0951]
电泳结束后，一方的凝胶是，为了对核酸进行染色而实施荧光染色(gelgreen nucleic acid stain 10,000
×
、biotium公司)，另一方的凝胶是，为了对核酸和蛋白质同时进行染色而实施银染色(ezstain silver,atto公司)。染色方法根据各自的附带手册。
[0952]
(4)结果
[0953]
结果示于图4～图5。
[0954]
在单链dna结合蛋白质(ssb：single
‑
stranded dna binding protein)存在下，确认到对于目标的双链dna的pna寡核苷酸的链侵入。即，在文献条件下结果可再现。对于相当于本发明的寡核苷酸(4)的bsi
‑
4～6，也与pna寡核苷酸同样、在ssb存在下确认链侵入。
[0955]
(4)在ssb非存在下的由寡核苷酸的链侵入
[0956]
(1)样品溶液的调制
[0957]
样品溶液如下表调制。
[0958]
【表13】
[0959]
试剂终浓度比例hepes ph7.0(缓冲液)5mm nacl20mm 目标的双链dna(dna
‑
1)30nm1链侵入用寡核苷酸(pna20、bsi
‑
5、6)100nm3.3
[0960]
(2)反应
[0961]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液在30秒钟内以每次2℃从94℃冷却至54℃，或者于37℃恒定(24小时、48小时)而反应。
[0962]
再者，在30秒钟内以每次2℃从94℃冷却至54℃的条件是在ssb非存在下，由热能将目标的双链dna(此时是203bp的pcr产物)变为单链，通过缓慢地冷却而引起链侵入的条件，推定在基因解析技术中的使用。
[0963]
另外，设为于37℃恒定的条件是推定在体内反应的条件，推定在核酸医药或基因组编集中的使用。
[0964]
(3)凝胶变动测定和染色
[0965]
与(3)同样地实施。再者，染色仅设为gelgreen(荧光染色)。
[0966]
(4)结果
[0967]
结果示于图6。
[0968]
相当于本发明的寡核苷酸(4)的bsi
‑
5及6即使将使用量设为(3)的半量(相对于目标dsdna而3.3当量)，也可在从94℃冷却至54℃或于37℃放置的条件下确认到链侵入。一方面，无法在此条件下确认到pna寡核苷酸导致的链侵入。
[0969]
(5)对于1碱基错配序列的寡核苷酸的链侵入碱基识别能
[0970]
(1)样品溶液
[0971]
样品溶液如下表调制。
[0972]
【表14】
[0973]
试剂终浓度比例hepes ph7.0(缓冲液)5mm nacl20mm 目标的双链dna(dna
‑
1～4)15nm1链侵入用寡核苷酸(pna20、bsi
‑
5、6)200nm13.3
[0974]
(2)反应
[0975]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液在30秒钟内以每次2℃从94℃冷却至54℃，或者于37℃恒定(24小时、48小时)而使反应。
[0976]
(3)凝胶变动测定和染色
[0977]
与(3)同样地实施。再者，染色仅设为gelgreen(荧光染色)。
[0978]
(4)结果
[0979]
结果示于图7。
[0980]
确认到对于bsi
‑
5及6的野生型的序列的链侵入，但对于1碱基错配序列，确认不到链侵入。即，使用本发明的寡核苷酸(4)的链侵入用寡核苷酸确认到序列特异性高。再者，在本条件下，pna寡核苷酸即使对于野生型序列，也不不发生链侵入的(6)寡核苷酸的链侵入功能性比较
[0981]
(1)样品溶液
[0982]
样品溶液如下表调制。
[0983]
【表15】
[0984]
试剂终浓度比例hepes ph7.0(缓冲液)5mm nacl20mm 目标的双链dna(dna
‑
1)30nm1链侵入用寡核苷酸(pna20、lsi
‑
1、bsi
‑
5、6、11、12)100nm3.3
[0985]
(2)反应
[0986]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液在30秒钟内以每次2℃从94℃冷却至54℃，或者于37℃恒定(2小时、24小时)而使反应。
[0987]
(3)凝胶变动测定和染色
[0988]
与(3)同样地实施。再者，染色仅设为gelgreen(荧光染色)。
[0989]
(4)结果
[0990]
结果示于图8。
[0991]
在任何条件下，pna20及lsi
‑
1均无法确认链侵入。对于使用以往发明的寡核苷酸的bsi
‑
11和12，bsi
‑
11虽未到bsi
‑
5及6的程度，也确认到链侵入，bsi
‑
12确认不到。
[0992]
一方面，相当于本发明的寡核苷酸(4)的bsi
‑
5及6即使是在37℃恒定经过2小时后，仍确认到链侵入。
[0993]
即，相当于本发明的寡核苷酸(4)的bsi
‑
5及6的链侵入能最优良。
[0994]
(7)作为bsi
‑
5及6的一部分的碱基而使用lna的寡核苷酸bsi
‑
18及19的链侵入
[0995]
(1)样品溶液
[0996]
样品溶液如下表调制。
[0997]
【表16】
[0998]
试剂终浓度比例hepes ph7.0(缓冲液)5mm nacl20mm 目标的双链dna(dna
‑
1)30nm1链侵入用寡核苷酸(pna20、lsi
‑
1、bsi
‑
5、6、18、19)200nm6.7
[0999]
(2)反应
[1000]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液在30秒钟内
以每次2℃从94℃冷却至54℃，或者于37℃恒定(24小时、48小时)而使反应。
[1001]
(3)凝胶变动测定和染色
[1002]
与(3)同样地实施。再者，染色仅设为gelgreen(荧光染色)。
[1003]
(4)结果
[1004]
结果示于图9。
[1005]
在作为bsi
‑
5及6的一部分的碱基而使用lna的寡核苷酸bsi
‑
18及19中，也确认到链侵入。
[1006]
(8)使用2种以上的寡核苷酸的链侵入
[1007]
(1)样品溶液
[1008]
样品溶液如下表调制。
[1009]
【表17】
[1010][1011]
(2)反应
[1012]
使用热循环仪(steponeplus,applied biosystems公司)，将样品溶液在30秒钟内以每次2℃从94℃冷却至54℃而使反应。
[1013]
(3)凝胶变动测定和染色
[1014]
与(3)同样地实施。再者，染色仅设为gelgreen(荧光染色)。
[1015]
(4)结果
[1016]
结果示于图10。
[1017]
在bsi
‑
22单独使用时，与阴性对照比较，观察到不同的条带图案，还可确认残留一部分模板dna(dna
‑
1)的条带。因此提示，即使bsi
‑
22单独，也发生链侵入。在将bsi
‑
22及bsi
‑
5(与相同的链杂交＝顺式型)组合使用时，或者，在将bsi
‑
22及bsi
‑
21(与不同的链杂交＝反式型)组合使用时，与阴性对照比较，观察到不同的条带图案，另外，确认不到模板dna的条带，可确认到链侵入更有效率地发生。在将bsi
‑
22、bsi
‑
21、及bsi
‑
5组合使用时，也确证增强链侵入。