二硫键稳定的多肽组合物和使用方法与流程

二硫键稳定的多肽组合物和使用方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2018年10月10日提交的美国临时申请号62/744,069的权益，将所述申请通过引用以其整体特此并入本文。


背景技术：

2.遗传疾病可以通过使用重组多肽的酶替代疗法或使用编码重组蛋白的核酸的基因疗法来治疗。例如，法布里病(fabry disease)可以使用重组α
‑
半乳糖苷酶a或小分子分子伴侣如1
‑
脱氧半乳糖野尻霉素(米加司他(migalastat))治疗。然而，重组野生型多肽通常在中性ph下稳定性较差，并且在血清中迅速降解。这大大限制了治疗性酶的半衰期，因为它是通过静脉内输注递送的。


技术实现要素：

3.在某些方面，提供了包含核酸构建体的基因疗法载体，所述核酸构建体包含：编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸。在一些实施例中，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白(ceroid lipofuscinoses neuronal)1、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白2、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白3、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白5、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白6、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白7、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白8、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白9、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白12、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白16以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10(组织蛋白酶d)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11(颗粒蛋白前体)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13(组织蛋白酶f)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14(kctd7)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15(tbck)以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述稳定
的蛋白质包含溶酶体酶。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的α
‑
半乳糖苷酶(α
‑
gal)蛋白。在一些实施例中，所述稳定的α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)蛋白包含选自下组的一个或多个非天然半胱氨酸残基，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的棕榈酰蛋白硫酯酶1(ppt1)。在一些实施例中，所述稳定的ppt1蛋白包含非天然半胱氨酸残基a171c和a183c。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 7.4下具有更长的半衰期。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以替代所述遗传障碍中有缺陷或不足的蛋白质。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以减轻或减缓与所述遗传障碍相关的一种或多种症状。在一些实施例中，与不稳定的蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在减轻或减缓所述遗传障碍的一种或多种症状方面更有效。在一些实施例中，所述遗传障碍是神经障碍。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，所述遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病(batten disease)、胱氨酸病、法布里病、i型戈谢病(gaucher disease)、ii型戈谢病、iii型戈谢病、庞贝病(pompe disease)、泰
‑
萨克斯病(tay sachs disease)、桑德霍夫病(sandhoff disease)、异染性脑白质营养不良、i型粘脂贮积病、ii型粘脂贮积病、iii型粘脂贮积病、iv型粘脂贮积病、贺勒病(hurler disease)、亨特病(hunter disease)、a型圣菲利波病(sanfilippo disease)、b型圣菲利波病、c型圣菲利波病、d型圣菲利波病、a型莫奎欧病(morquio disease)、b型莫奎欧病、马罗托
‑
拉米病(maroteau
‑
lamy disease)、斯莱病(sly disease)、a型尼曼
‑
皮克病(niemann
‑
pick disease)、b型尼曼
‑
皮克病、c1型尼曼
‑
皮克病、c2型尼曼
‑
皮克病、i型辛德勒病(schindler disease)、ii型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada
‑
scid)、慢性肉芽肿病(cgd)、婴儿期、幼年期和成年期形式的神经元蜡样质脂褐质沉积症以及cdkl5缺乏症。在一些实施例中，所述基因疗法载体是选自下组的病毒载体，该组由以下各项组成：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。在一些实施例中，所述腺相关病毒是选自下组的血清型，该组由以下各项组成：aav
‑
1、aav
‑
2、aav
‑
3、aav
‑
4、aav
‑
5、aav
‑
6、aav
‑
7、aav
‑
8、aav
‑
9、aav
‑
10、aav
‑
11、aav
‑
12、aav
‑
13、aav rh.74、aav
‑
b1和aav
‑
hu68。在一些实施例中，所述核酸构建体包含在病毒载体基因组中。在一些实施例中，所述病毒载体基因组包含重组aav(raav)基因组。在一些实施例中，所述raav基因组包含自互补基因组。在一些实施例中，所述raav基因组包含单链基因组。在一些实施例中，所述raav基因组包含第一反向末端重复序列和第二反向末端重复序列。在一些实施例中，所述aav反向末端重复序列是aav2反向末端重复序列。在一些实施例中，所述raav基因组进一步包含sv40内含子。在一些实施例中，所述raav基因组进一步包含聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与seq id no:7
‑
12之一至少85％相同。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述α
‑
gal蛋白包含与seq id no:1
‑
6之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含seq id no:8
‑
12之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述α
‑
gal蛋白包含seq id no:2
‑
6之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与seq id no:15
‑
16之一至少85％相同。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述
ppt1蛋白包含与seq id no:13
‑
14之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含seq id no:16的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述ppt1蛋白包含seq id no:14的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含启动子序列。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述构建体进一步包含选自下组的一个或多个核酸序列，该组由以下各项组成：kozak序列、crpv ires、编码接头的核酸序列、编码信号序列的核酸序列和编码igf2肽的核酸序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含免疫球蛋白结合蛋白(bip)信号序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含所述bip信号序列，其包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:29
‑
33组成。在一些实施例中，所述构建体进一步包含内部核糖体进入序列(ires)。在一些实施例中，所述ires包含蟋蟀麻痹病毒(crpv)ires。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码变体igf2(vigf2)肽的核酸序列。在一些实施例中，所述vigf2肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:17
‑
27组成。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的5'。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的3'。在一些实施例中，所述构建体被包装在病毒衣壳内。
4.在另外的方面，提供了药物组合物，其包含基因疗法载体和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，所述基因疗法载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸。在一些实施例中，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白1、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白2、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白3、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白5、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白6、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白7、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白8、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白9、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白12、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白16以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10(组织蛋白酶d)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11(颗粒蛋白前体)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13(组织蛋白酶f)、神经元蜡样质脂褐质
no:16的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述ppt1蛋白包含seq id no:14的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含启动子序列。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述构建体进一步包含选自下组的一个或多个核酸序列，该组由以下各项组成：kozak序列、crpv ires、编码接头的核酸序列、编码信号序列的核酸序列和编码igf2肽的核酸序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含免疫球蛋白结合蛋白(bip)信号序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含所述bip信号序列，其包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:29
‑
33组成。在一些实施例中，所述构建体进一步包含内部核糖体进入序列(ires)。在一些实施例中，所述ires包含蟋蟀麻痹病毒(crpv)ires。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码变体igf2(vigf2)肽的核酸序列。在一些实施例中，所述vigf2肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:17
‑
27组成。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的5'。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的3'。在一些实施例中，所述构建体被包装在病毒衣壳内。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。
5.在进一步的方面，提供了用于治疗受试者的遗传障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的基因疗法载体或其药物组合物，所述基因疗法载体包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸。在一些实施例中，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白1、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白2、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白3、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白5、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白6、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白7、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白8、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白9、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白12、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白16以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述蛋白质选自下组，该组由以下各项组成：α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫
酯酶(ppt)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10(组织蛋白酶d)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11(颗粒蛋白前体)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13(组织蛋白酶f)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14(kctd7)、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15(tbck)以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含溶酶体酶。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的α
‑
半乳糖苷酶(α
‑
gal)蛋白。在一些实施例中，所述稳定的α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)蛋白包含一个或多个非天然半胱氨酸残基d233c和i359c。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质包含稳定的棕榈酰蛋白硫酯酶1(ppt1)。在一些实施例中，所述稳定的ppt1蛋白包含非天然半胱氨酸残基a171c和a183c。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 7.4下具有更长的半衰期。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以替代所述遗传障碍中有缺陷或不足的蛋白质。在一些实施例中，所述稳定的蛋白质可以减轻或减缓与所述遗传障碍相关的一种或多种症状。在一些实施例中，与不稳定的蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在减轻或减缓所述遗传障碍的一种或多种症状方面更有效。在一些实施例中，所述遗传障碍是神经障碍。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，所述遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病、胱氨酸病、法布里病、i型戈谢病、ii型戈谢病、iii型戈谢病、庞贝病、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、异染性脑白质营养不良、i型粘脂贮积病、ii型粘脂贮积病、iii型粘脂贮积病、iv型粘脂贮积病、贺勒病、亨特病、a型圣菲利波病、b型圣菲利波病、c型圣菲利波病、d型圣菲利波病、a型莫奎欧病、b型莫奎欧病、马罗托
‑
拉米病、斯莱病、a型尼曼
‑
皮克病、b型尼曼
‑
皮克病、c1型尼曼
‑
皮克病、c2型尼曼
‑
皮克病、i型辛德勒病、ii型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada
‑
scid)、慢性肉芽肿病(cgd)、婴儿期、幼年期和成年期形式的神经元蜡样质脂褐质沉积症以及cdkl5缺乏症。在一些实施例中，所述基因疗法载体是选自下组的病毒载体，该组由以下各项组成：腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。在一些实施例中，所述腺相关病毒是选自下组的血清型，该组由以下各项组成：aav
‑
1、aav
‑
2、aav
‑
3、aav
‑
4、aav
‑
5、aav
‑
6、aav
‑
7、aav
‑
8、aav
‑
9、aav
‑
10、aav
‑
11、aav
‑
12、aav
‑
13、aav rh.74、aav
‑
b1和aav
‑
hu68。在一些实施例中，所述核酸构建体包含在病毒载体基因组中。在一些实施例中，所述病毒载体基因组包含重组aav(raav)基因组。在一些实施例中，在一些实施例中，在一些实施例中，在一些实施例中，在一些实施例中，所述raav基因组包含自互补基因组。在一些实施例中，所述raav基因组包含单链基因组。在一些实施例中，所述raav基因组包含第一反向末端重复序列和第二反向末端重复序列。在一些实施例中，所述aav反向末端重复序列是aav2反向末端重复序列。在一些实施例中，所述raav基因组进一步包含sv40内含子。在一些实施例中，所述raav基因组进一步包含聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与seq id no:7
‑
12之一至少85％相同。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述α
‑
gal蛋白包含与seq id no:1
‑
6之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含seq id no:8
‑
12之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码α
‑
gal蛋白的核酸序列，其中所述α
‑
gal蛋白包含seq id no:2
‑
6之一的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与seq id no:15
‑
16之一至少85％相同。
在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述ppt1蛋白包含与seq id no:13
‑
14之一至少85％相同的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列包含seq id no:16的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码ppt1蛋白的核酸序列，其中所述ppt1蛋白包含seq id no:14的序列。在一些实施例中，所述构建体进一步包含启动子序列。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述构建体进一步包含选自下组的一个或多个核酸序列，该组由以下各项组成：kozak序列、crpv ires、编码接头的核酸序列、编码信号序列的核酸序列和编码igf2肽的核酸序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含免疫球蛋白结合蛋白(bip)信号序列。在一些实施例中，所述信号肽序列包含所述bip信号序列，其包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:29
‑
33组成。在一些实施例中，所述构建体进一步包含内部核糖体进入序列(ires)。在一些实施例中，所述ires包含蟋蟀麻痹病毒(crpv)ires。在一些实施例中，所述构建体进一步包含编码变体igf2(vigf2)肽的核酸序列。在一些实施例中，所述vigf2肽包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:17
‑
27组成。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的5'。在一些实施例中，编码所述vigf2肽的核酸序列在编码所述蛋白质的稳定形式的核酸序列的3'。在一些实施例中，所述构建体被包装在病毒衣壳内。在一些实施例中，所述基因疗法载体或所述药物组合物通过鞘内、脑室内、实质内或静脉内注射或其组合来递送。在一些实施例中，所述基因疗法载体或所述药物组合物减轻或减缓所述受试者的遗传障碍的一种或多种症状。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，所述遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病、胱氨酸病、法布里病、i型戈谢病、ii型戈谢病、iii型戈谢病、庞贝病、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、异染性脑白质营养不良、i型粘脂贮积病、ii型粘脂贮积病、iii型粘脂贮积病、iv型粘脂贮积病、贺勒病、亨特病、a型圣菲利波病、b型圣菲利波病、c型圣菲利波病、d型圣菲利波病、a型莫奎欧病、b型莫奎欧病、马罗托
‑
拉米病、斯莱病、a型尼曼
‑
皮克病、b型尼曼
‑
皮克病、c1型尼曼
‑
皮克病、c2型尼曼
‑
皮克病、i型辛德勒病、ii型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada
‑
scid)、慢性肉芽肿病(cgd)、神经元蜡样质脂褐质沉积症以及cdkl5缺乏症。
6.在另外的方面，提供了稳定的人α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)二聚体。在一些实施例中，稳定的α
‑
gal二聚体包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基形成至少一个连接所述α
‑
gal二聚体的第一亚基和第二亚基的分子间二硫键。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基选自下组，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含d233c和i359c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:1
‑
6之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:7
‑
12之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。
7.在进一步的方面，提供了药物组合物，其包含稳定的人α
‑
gal二聚体和药学上可接
受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施例中，稳定的α
‑
gal二聚体包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基形成至少一个连接所述α
‑
gal二聚体的第一亚基和第二亚基的分子间二硫键。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基选自下组，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含d233c和i359c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:1
‑
6之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:7
‑
12之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。
8.在另外的方面，提供了用于治疗受试者的法布里病的方法，所述方法包括向所述受试者向有需要的受试者施用治疗有效量的稳定的人α
‑
gal二聚体或其药物组合物。在一些实施例中，稳定的α
‑
gal二聚体包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基形成至少一个连接所述α
‑
gal二聚体的第一亚基和第二亚基的分子间二硫键。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基选自下组，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含d233c和i359c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含m51c和g360c。在一些实施例中，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基包含i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:1
‑
6之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:7
‑
12之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施例中，所述稳定的人α
‑
gal二聚体或所述药物组合物通过鞘内、脑室内、实质内、皮下、肌内、眼睛、静脉内注射或其组合来递送。在一些实施例中，所述稳定的人α
‑
gal二聚体或所述药物组合物减轻或减缓所述受试者的法布里病的一种或多种症状。
9.在另外的方面，提供了稳定的人棕榈酰蛋白硫酯酶1(ppt1)分子。在一些实施例中，所述稳定的ppt1分子包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述ppt1分子内形成至少一个分子内二硫键。在一些实施例中，所述稳定的ppt1包含非天然半胱氨酸残基a171c和a183c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:13
‑
14之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:15
‑
16之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野
生型ppt1多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。
10.在进一步的方面，提供了药物组合物，其包含稳定的ppt1和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施例中，所述稳定的ppt1分子包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述ppt1分子内形成至少一个分子内二硫键。在一些实施例中，所述稳定的ppt1包含非天然半胱氨酸残基a171c和a183c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:13
‑
14之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:15
‑
16之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野生型ppt1多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。
11.在另外的方面，提供了用于治疗受试者的cln1病的方法，所述方法包括向所述受试者向有需要的受试者施用治疗有效量的稳定的ppt1或其药物组合物。在一些实施例中，所述稳定的ppt1分子包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，其中所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述ppt1分子内形成至少一个分子内二硫键。在一些实施例中，所述稳定的ppt1包含非天然半胱氨酸残基a171c和a183c。在一些实施例中，所述多肽具有与seq id no:13
‑
14之一至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述多肽由与seq id no:15
‑
16之一至少85％相同的核酸编码。在一些实施例中，与野生型ppt1多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述多肽进一步包含变体igf2(vigf2)肽。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施例中，所述经修饰的ppt1或所述药物组合物通过鞘内、脑室内、实质内、皮下、肌内、眼睛、静脉内注射或其组合来递送。
12.在另外的方面，提供了经修饰的人α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)多肽，其包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
13.在进一步的方面，提供了核酸分子，其包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
14.在进一步的方面，提供了包含核酸分子的基因疗法载体，所述核酸分子包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
15.在另外的方面，提供了经修饰的人α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)多肽，其包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代促进两个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
16.在进一步的方面，提供了核酸分子，其包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代促进两个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
17.在另外的方面，提供了包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸的基因疗法载体。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代促进两个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
18.在进一步的方面，提供了包含两个经修饰的人α
‑
gal多肽的同源二聚体，其中每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal同源二聚体相比，所述同源二聚体在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
19.在另外的方面，提供了包含两个经修饰的人α
‑
gal多肽的同源二聚体，其中每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代促进两
个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，每个经修饰的人α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal同源二聚体相比，所述同源二聚体在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
20.在进一步的方面，提供了核酸分子，其包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸，其中所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代的多肽，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸是基因疗法构建体。在一些实施例中，所述核酸进一步包含启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
21.在另外的方面，提供了核酸分子，其包含编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸，其中所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代的多肽，其中所述半胱氨酸取代促进两个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸是基因疗法构建体。在一些实施例中，所述核酸进一步包含启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
22.在另外的方面，提供了核酸构建体，其包含至少一个启动子和编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸，其中所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸构建体包含来自下组的一种或多种核酸，该组由以下各项组成：crpv ires、kozak序列、编码接头的核酸、编码前导序列的核酸序列和编码igf2肽的核酸。在一些实施例中，所述核酸构建体包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述
病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述核酸构建体适用于基因疗法。
23.在进一步的方面，提供了核酸构建体，其包含至少一个启动子和编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸，其中所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，其中所述半胱氨酸取代促进两个α
‑
gal多肽之间的二硫键形成以形成同源二聚体。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸构建体包含来自下组的一种或多种核酸，该组由以下各项组成：crpv ires、kozak序列、编码接头的核酸、编码前导序列的核酸序列和编码igf2肽的核酸。在一些实施例中，所述核酸构建体包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述核酸构建体适用于基因疗法。
24.在进一步的方面，提供了药物组合物，其包含(a)经修饰的人α
‑
gal多肽，其中所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；和(ii)m51c和g360c；以及(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述经修饰的人α
‑
gal多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：盐水、马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、n
‑
甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚以及表面活性剂聚氧乙烯
‑
脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施例中，所述组合物适用于酶替代疗法。
25.在另外的方面，提供了在有需要的受试者中改善法布里病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含基因疗法核酸构建体，所述基因疗法核酸构建体包含至少一个启动子和编码经修饰的人α
‑
gal多肽的核酸，其中所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码形成同源二聚体的多肽。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，所述
核酸编码与野生型α
‑
gal多肽相比在ph 7.4下具有增加的半衰期的经修饰的人α
‑
gal多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的一种或多种。在一些实施例中，通过单次施用所述基因疗法核酸构建体减轻至少一种症状。在一些实施例中，所述方法进一步包括在治疗后测量从所述受试者获得的组织中的α
‑
gal活性。
26.在进一步的方面，提供了在有需要的受试者中改善法布里病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含经修饰的人α
‑
gal多肽，其中所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的人α
‑
gal多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述经修饰的人α
‑
gal多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的一种或多种。通过引用并入
27.将本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地通过引用并入一般。
附图说明
28.将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施例的以下具体实施方式和附图获得对本发明的特征和优点的理解，在所述附图中：
29.图1a和图1b示出了α
‑
半乳糖苷酶a(α
‑
gal)的结构和氨基酸取代的建议位点。
30.图2a示出了经修饰的α
‑
gal二聚体形成。
31.图2b示出了经修饰的α
‑
gal酶活性。
32.图3a示出了α
‑
gal在ph 4.6和ph 7.4下在24小时内的稳定性。
33.图3b示出了α
‑
gal在ph 4.6和ph 7.4下在7天内的稳定性。
34.图4a示出了法布里患者成纤维细胞的经修饰的α
‑
gal的摄取和酶活性。
35.图4b示出了法布里患者成纤维细胞中球形三酰鞘氨醇(globotriaosylsphingosine，lyso
‑
gb3)的减少。
36.图5示出了法布里病细胞中两种α
‑
gal二硫键二聚体的增强的半衰期的活性。
37.图6示出了接受和未接受用经修饰的α
‑
gal基因疗法治疗的野生型小鼠和gla敲除小鼠中的gb3底物组织学。
38.图7示出了接受和未接受用经修饰的α
‑
gal基因疗法治疗的野生型小鼠和gla敲除
小鼠中的gla酶活性。
39.图8示出了在接受和未接受用经修饰的α
‑
gal基因疗法治疗的野生型小鼠和gla敲除小鼠的肾组织裂解物中测量到的gb3底物。
40.图9示出了随时间推移的棕榈酰蛋白硫酯酶1(ppt
‑
1)野生型相比于构建体ppt
‑
1突变体的酶活性的winnonlin分析。
具体实施方式
41.本文提供了用于治疗的多肽的变体，包括用于基因疗法的具有半胱氨酸取代的构建体，所述半胱氨酸取代使得由于在分子内形成二硫键或在所述多肽中的两个亚基之间形成二硫键以形成二聚体而能够实现稳定。这些二硫键产生在中性ph(如血液的ph)下更稳定的重组酶。因此，提供了具有更长半衰期的更稳定的多肽，其可用于治疗由突变引起的疾病，包括由α
‑
gal突变引起的疾病，如法布里病；或由ppt
‑
1突变引起的疾病，如cln1病。本文的多肽变体(也称为“经修饰的多肽”)包括但不限于α
‑
gal和ppt
‑
1的变体。经修饰的α
‑
gal多肽
42.本文提供了经修饰的α
‑
gal多肽，其包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代。本文提供的预期取代包括：(i)r49c和g361c；(ii)r49c和g360c；(iii)d233c和i359c；(iv)m51c和g360c；以及(v)s276c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。所述经修饰的α
‑
gal多肽可以形成同源二聚体，其通过至少一个、更优选两个分子间二硫键稳定。与野生型α
‑
gal多肽相比，所述经修饰的α
‑
gal多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
43.野生型和示例性的经修饰的α
‑
gal序列提供于表1中
44.本文还提供了经修饰的α
‑
gal多肽，其包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少90％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少95％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少96％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少97％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少98％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有至少99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置51和360处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:4所示的序列具有多于99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有如seq id no:4所示的序列的多肽。
45.本文还提供了经修饰的α
‑
gal多肽，其包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少90％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少95％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少
96％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少97％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少98％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有至少99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有在位置233和359处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:5所示的序列具有多于99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽包含具有如seq id no:5所示的序列的多肽。
46.本文还提供了包含两个经修饰的α
‑
gal多肽的同源二聚体，其中每个经修饰的α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)r49c和g361c；(ii)r49c和g360c；(iii)d233c和i359c；(iv)m51c和g360c；以及(v)s276c。在一些实施例中，每个经修饰的α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，每个经修饰的α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，每个经修饰的α
‑
gal多肽均包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal同源二聚体相比，所述同源二聚体在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
47.在一些实施例中，经修饰的α
‑
gal多肽在ph 4.6下具有增加的半衰期。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少50％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少150％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少200％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少250％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少300％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少350％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少400％。
48.在一些实施例中，所述经修饰的α
‑
gal二聚体在ph 4.6下具有与野生型α
‑
gal在ph 4.6下的半衰期相比增加至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的半衰期。更优选地，所述经修饰的α
‑
gal二聚体在ph 4.6下具有与野生型α
‑
gal多肽在ph 4.6下的半衰期相比增加至少约3、3.5或4倍的半衰期。
49.在一些实施例中，所述经修饰的α
‑
gal二聚体具有与野生型人α
‑
gal的细胞内半衰期相比增加至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的细胞内半衰期。更优选地，所述经修饰的α
‑
gal二聚体具有与野生型α
‑
gal多肽的细胞内半衰期相比增加至少约3、3.5、或4、4.5或5倍的细胞内半衰期。
50.与野生型人α
‑
gal相比，所述经修饰的α
‑
gal二聚体在ph 7.4下具有显著增加的半衰期。编码经修饰的α
‑
gal多肽的核酸
51.本文还提供了核酸分子，其包含编码经修饰的α
‑
gal多肽的核酸。预期的核酸包括编码包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代的多肽的那些，所述取代包括：(i)r49c和g361c；(ii)r49c和g360c；(iii)d233c和i359c；(iv)m51c和g360c；以及(v)s276c。在一些实施例
中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代的多肽，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸是基因疗法构建体。在一些实施例中，所述核酸进一步包含启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
52.本文还提供了核酸构建体，其包含至少一个启动子和编码经修饰的α
‑
gal多肽的核酸。预期经修饰的α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代包括：(i)r49c和g361c；(ii)r49c和g360c；(iii)d233c和i359c；(iv)m51c和g360c；以及(v)s276c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代的多肽，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸构建体包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述核酸构建体适用于基因疗法。
53.在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，编码本文经修饰的α
‑
gal多肽的核酸具有增加的半衰期。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少50％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少150％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少200％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少250％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少300％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少350％。经修饰的ppt
‑
1多肽
54.本文提供了经修饰的ppt
‑
1多肽，其包含ppt
‑
1多肽序列的半胱氨酸取代。本文提
供的预期取代包括a171c和a183c。在一些实施例中，所述多肽包含ppt
‑
1多肽序列的a171c和a183c的半胱氨酸取代。所述经修饰的ppt
‑
1多肽通过至少一个、更优选两个分子内二硫键稳定。与野生型ppt
‑
1多肽相比，所述经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。
55.野生型和示例性的经修饰的ppt
‑
1提供于表3中。
56.本文还提供了经修饰的ppt
‑
1多肽，其包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少90％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少95％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少96％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少97％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少98％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有至少99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有在位置171和183处含有半胱氨酸残基并且与如seq id no:14所示的序列具有多于99％同一性的序列的多肽。在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽包含具有如seq id no:14所示的序列的多肽。
57.在一些实施例中，经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 4.6下具有增加的半衰期。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少50％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少150％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少200％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少250％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少300％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少350％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少400％。
58.在一些实施例中，所述经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 4.6下具有与野生型ppt
‑
1在ph 4.6下的半衰期相比增加至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的半衰期。更优选地，所述经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 4.6下具有与野生型ppt
‑
1多肽在ph 4.6下的半衰期相比增加至少约3、3.5或4倍的半衰期。
59.在一些实施例中，所述经修饰的ppt
‑
1多肽具有与野生型人α
‑
gal的细胞内半衰期相比增加至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的细胞内半衰期。更优选地，所述经修饰的ppt
‑
1多肽具有与野生型ppt
‑
1多肽的细胞内半衰期相比增加至少约3、3.5、或4、4.5或5倍的细胞内半衰期。
60.与野生型人α
‑
gal相比，所述经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 7.4下具有显著增加的半衰期。编码经修饰的ppt
‑
1多肽的核酸
61.本文还提供了核酸分子，其包含编码经修饰的ppt
‑
1多肽的核酸。预期的核酸包括编码包含ppt
‑
1多肽序列的半胱氨酸取代的多肽的那些，所述取代包括：a171c和a183c。在一些实施例中，所述核酸编码包含a171c和a183c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述多肽通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型ppt
‑
1多肽相比，所述多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述核酸是基因疗法构建体。在一些实施例中，所述核酸进一步包含启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒核酸序列的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。
62.在一些实施例中，与野生型ppt
‑
1多肽相比，编码本文经修饰的ppt
‑
1多肽的核酸具有增加的半衰期。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少50％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少150％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少200％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少250％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少300％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少350％。igf2肽
63.在一些情况下，本文经修饰的多肽(如本文经修饰的α
‑
gal或经修饰的ppt
‑
1多肽)与胰岛素样生长因子2(igf2)肽融合，用于将经修饰的多肽靶向需要它们的溶酶体。igf2肽
序列的变体保持与igf2/ci
‑
mpr的高亲和力结合，并且消除与igf1、胰岛素受体和igf结合蛋白(igfbp)的结合。与常规igf2融合蛋白相比，变体igf2肽的选择性明显更高，并且具有降低的安全风险。本文的igf2肽包括具有ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdla lletycatpakse(seq id no:17)的氨基酸序列的那些。另外的igf2肽具有针对改进靶向而优化的变体氨基酸序列。变体igf2肽包括在野生型igf2序列的位置26、27、43、48、49、50、54、55或65处的变体氨基酸。这些包括在seq id no:17的f26、y27、v43、f48、r49、s50、a54、l55或k65处的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有来自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：f26s、y27l、v43l、f48t、r49s、s50i、a54r、l55r和k65r。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有f26s的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有y27l的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有v43l的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有f48t的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有r49s的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有s50i的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有a54r的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有l55r的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有k65r的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有f26s、y27l、v43l、f48t、r49s、s50i、a54r和l55r的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有一个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有两个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有三个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有三个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有四个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有五个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有六个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有七个氨基酸的n末端缺失。在一些实施例中，所述igf2肽具有七个氨基酸的n末端缺失以及y27l和k65r的取代。
64.考虑了另外的取代以降低不稳定性，同时保持ci
‑
mpr结合亲和力。预期将这些取代与本文所述的任何其他取代组合。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有l17n的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有p31g的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有r38g的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有e45w的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有s50g的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有r38g和e45w的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有r38g、e45w和s50g的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有p31g、r38g、e45w和s50g的取代。在一些实施例中，所述igf2肽具有如下序列，所述序列具有l17n、p31g、r38g、e45w和s50g的取代。示例性肽序列由seq id no:17
‑
27表示。
内部核糖体进入序列
65.在一些实施例中，编码本文经修饰的多肽的核酸(如编码经修饰的α
‑
gal和pp
‑
1多肽的核酸)进一步包含内部核糖体进入序列(ires)，用于通过绕过翻译起始的瓶颈来增加基因表达。用于优化表达用于基因疗法的合适的内部核糖体进入序列包括但不限于蟋蟀麻痹病毒(crpv)ires、细小核糖核酸病毒ires、口蹄疫病毒ires、卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)相关疱疹病毒ires、甲型肝炎ires、丙型肝炎ires、瘟病毒属(pestivirus)ires、蟋蟀麻痹病毒属(cripavirus)ires、禾谷缢管蚜(rhopalosiphum padi)病毒ires、默克病(merek’s disease)病毒ires以及其他合适的ires序列。在一些实施例中，所述基因疗法构建体包含crpv ires。在一些实施例中，所述crpv ires具有cggugucgaaguagaauuucuaucucgacacgcggccuuccaagcaguuagggaaaccgacuucuuugaagaagaaagcugacuaugugaucuuauuaaaauuagguuaaauuucgagguuaaaaauaguuuuaauauugcuauagucuuagaggucuuguauauuuauacuuaccacacaagauggaccggagcagcccuccaauaucuaguguacccucgugcucgcucaaacauuaagugguguugugcgaaaagaaucucacuucaagaa(seq id no:28)的核酸序列信号序列
66.本文提供了核酸分子，其包含编码经修饰的多肽(如经修饰的α
‑
gal多肽或经修饰的ppt
‑
1多肽)的核酸，其中所述核酸分子进一步包含信号肽，其改善从用基因疗法构建体转导的细胞分泌治疗性蛋白。在一些实施例中，所述信号肽改善治疗性蛋白的蛋白质加工，
并且促进新生多肽
‑
核糖体复合物向er的易位，并且确保正确的共翻译和翻译后修饰。在一些实施例中，所述信号肽位于(i)信号翻译起始序列的上游位置，(ii)翻译起始序列与治疗性蛋白之间，或(iii)治疗性蛋白的下游位置。在基因疗法构建体中有用的信号肽包括但不限于来自hsp70蛋白家族(例如，hspa5，热休克蛋白家族a成员5)的免疫球蛋白结合蛋白(bip)信号肽及其变体。这些信号肽对信号识别颗粒具有超高的亲和力。bip氨基酸序列的实例提供于下表6中。在一些实施例中，所述信号肽具有与选自下组的序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由seq id no:29
‑
33组成。在一些实施例中，所述信号肽与选自下组的序列相差5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸，该组由seq id no:29
‑
33组成。kozak序列
67.本文提供了核酸分子，其包含编码经修饰的多肽(如经修饰的α
‑
gal多肽或经修饰的ppt
‑
1多肽)的核酸，其中所述核酸分子进一步包含具有kozak序列的核酸，所述序列有助于mrna翻译的起始。本文考虑的kozak序列具有gccrccaugg(seq id no:34)的共有序列，其中小写字母表示所述位置处最常见的碱基，并且所述碱基变化，大写字母表示仅变化很少的高度保守的碱基。r表示在所述位置处总是观察到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。括号中的序列(gcc)具有不确定的意义。治疗性蛋白
68.本文提供的基因疗法构建体包含编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸。从基因疗法构建体表达的治疗性蛋白替代缺失或有缺陷的蛋白。因此，基于个体中需要治疗的遗传缺陷来选择治疗性蛋白。本文的稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。
69.在一些实施例中，本文的基因疗法构建体编码酶，如患有溶酶体贮积症的个体中具有遗传缺陷的酶。在一些实施例中，由本文提供的基因疗法构建体编码的酶包括但不限于α
‑
半乳糖苷酶a、β
‑
葡糖脑苷脂酶、葡糖脑苷脂酶、溶酶体酸性脂肪酶、糖胺聚糖α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶、n
‑
磺基葡糖胺磺基水解酶(sgsh)、n
‑
乙酰基
‑
α
‑
氨基葡糖苷酶(naglu)、艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶、n
‑
乙酰半乳糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、糖胺聚糖n
‑
乙酰半乳糖胺4
‑
硫酸酯酶、α
‑
葡糖苷酶、三肽基肽酶1(tpp1)、棕榈酰蛋白硫酯酶、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白1、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白2、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白3、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白4、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白5、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白6、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白7、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白8、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白9、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白10、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白11、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白12、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白13、神经
元蜡样质脂褐质沉积症蛋白14、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白15、神经元蜡样质脂褐质沉积症蛋白16以及细胞周期蛋白依赖性激酶样5。基因疗法载体和组合物
70.本文提供了包含核酸构建体的基因疗法载体，所述核酸构建体包含：编码用于治疗神经或遗传障碍的蛋白质的稳定形式的核酸，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述稳定形式包含经修饰的α
‑
gal多肽或经修饰的ppt
‑
1多肽。
71.在一些实施例中，将编码经修饰多肽的核酸克隆到多种类型的载体中。例如，在一些实施例中，将所述核酸克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
72.此外，将编码经修饰多肽的表达载体以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术描述于例如sambrook等人,2012,molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第1
‑
4卷,纽约冷泉港出版社)以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点以及一种或多种可选择标记(例如，wo01/96584；wo 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0073]
本文还提供了用于基因转移的组合物和系统。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。在一些实施例中，将选定的基因插入载体中并使用合适的技术包装在逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒，并且将其在体内或离体递送到受试者的细胞。许多逆转录病毒系统适用于基因疗法。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体适用于基因疗法。在一些实施例中，使用腺相关病毒载体。许多腺相关病毒适用于基因疗法。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
[0074]
本文提供的基因疗法构建体包含如下载体(或基因疗法表达载体)，目标基因被克隆到其中，或以其他方式其以使得所述载体的核苷酸序列允许目标基因表达(组成型或以其他方式以某种方式调控)的方式包括目标基因。本文提供的载体构建体包括任何合适的基因表达载体，其能够被递送到目标组织并且将提供目标基因在选定目标组织中的表达。
[0075]
在一些实施例中，所述载体是腺相关病毒(aav)载体，因为aav载体具有穿过血脑屏障的能力并转导神经元组织。在本文提供的方法中，预期使用任何血清型的aav。在某些实施例中使用的病毒载体的血清型选自下组，该组由以下各项组成：aav1载体、aav2载体、aav3载体、aav4载体、aav5载体、aav6载体、aav7载体、aav8载体、aav9载体、aavrhs载体、aavrh10载体、aavrh33载体、aavrh34载体、aavrh74载体、aav anc80载体、aavphp.b载体、aavhu68载体、aav
‑
dj载体以及适用于基因疗法的其他载体。
[0076]
aav载体是对哺乳动物无致病性的dna细小病毒。简而言之，基于aav的载体移除了占病毒基因组96％的rep和cap病毒基因，留下了用于启动病毒dna复制、包装和整合的两个145个碱基对的侧翼反向末端重复序列(itr)。
[0077]
进一步的实施例包括使用其他血清型衣壳来产生aav1载体、aav2载体、aav3载体、
aav4载体、aav5载体、aav6载体、aav7载体、aav8载体、aav9载体、aavrhs载体、aavrh10载体、aavrh33载体、aavrh34载体、aavrh74载体、aav anc80载体、aavphp.b载体、aav
‑
dj载体以及适用于基因疗法的其他载体。任选地，所述aav病毒衣壳是aav2/9、aav9、aavrhs、aavrh10、aavanc80或aav php.b。
[0078]
另外的启动子元件(例如，增强子)调控转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30
‑
110bp的区域中，尽管许多启动子已经被证明也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反向或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距通常在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，单独元件似乎协同或独立地发挥作用以激活转录。
[0079]
能够在哺乳动物t细胞中表达稳定的蛋白质(如经修饰的α
‑
gal多肽或经修饰的ppt
‑
1多肽转基因)的启动子的实例是ef1a启动子。天然ef1a启动子驱动延伸因子
‑
1复合物的α亚基的表达，所述复合物负责将氨酰trna酶促递送到核糖体。ef1a启动子已经广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已经被证明可有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因的表达(参见例如，milone等人,mol.ther.[分子疗法]17(8):1453
‑
1464(2009))。启动子的另一个实例是即刻早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。这种启动子序列是一种强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，有时也使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、eb病毒(epstein
‑
barr virus)即刻早期启动子、劳斯肉瘤(rous sarcoma)病毒启动子以及人基因启动子(如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子
‑
1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子)。此外，不考虑基因疗法载体仅限于使用组成型启动子。这里还考虑了诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够在期望这种表达时开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭所述表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调控启动子。在一些实施例中，所述启动子是α
‑
gal启动子。
[0080]
为了评估经修饰多肽的表达，待引入细胞中的表达载体通常含有可选择标记基因或报告基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择标记通常携带在单独的dna片段上，并且用于共转染程序。可选择标记和报告基因两者有时均侧接适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。可用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
[0081]
将基因引入细胞中并使其在细胞中表达的方法适用于本文的方法。在表达载体的背景下，通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞)中。例如，通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移到宿主细胞中。
[0082]
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法适用于本文的方法(参见例如，sambrook等人,2012,molecular cloning:alaboratory manual[分子克隆：实验室手册],第1
‑
4卷,纽约冷泉港出版社)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的一种方法是磷酸钙转染
[0083]
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，如大分子复合
物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，如用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
[0084]
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。预期使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一个方面，所述核酸与脂质相关联。在一些实施例中，将与脂质相关联的核酸封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者相关联的连接分子附着到脂质体、包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、用胶束包含或复合、或以其他方式与脂质相关联。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，在一些实施例中，脂质体以双层结构存在、作为胶束或具有“塌陷”结构。可替代地，脂质体简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，在一些实施例中，其是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物(如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛)的化合物类别。
[0085]
适合使用的脂质从商业来源获得。例如，在一些实施例中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“dmpc”)从密苏里州圣路易斯的西格玛公司(sigma)获得；在一些实施例中，磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)从k&k实验室(k&k laboratories)(纽约州普莱恩维尤)获得；在一些实施例中，胆固醇(“choi”)从卡尔生化
‑
贝林公司(calbiochem
‑
behring)获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质通常从阿凡提极性脂质制品公司(avanti polar lipids,inc.)(阿拉巴马州伯明翰)获得。通常将脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液储存在约
‑
20℃下。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体通常被表征为具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排，并且捕获脂质双层之间的水和溶解的溶质(ghosh等人,1991glycobiology[糖生物学]5:505
‑
10)。然而，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，在一些实施例中，脂质采取胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂转胺(lipofectamine)
‑
核酸复合物。
[0086]
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式使细胞暴露于经修饰的α
‑
gal多肽，为了证实重组dna序列在宿主细胞中的存在，预期进行多种测定。此类测定包括例如适用于本文方法的“分子生物学”测定，如dna印迹法和rna印迹法、rt
‑
pcr和pcr；“生物化学”测定，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(elisa和免疫印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本文范围内的药剂。
[0087]
本披露进一步提供了载体，其包含编码经修饰多肽的核酸分子。在一个方面，治疗性融合蛋白载体能够被直接转导到细胞中。在一个方面，所述载体是克隆或表达载体，例如包括但不限于一个或多个质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，所述载体能够在哺乳动物细胞中表达经修饰的多肽构建体。在一个方面，所述哺乳动物细胞是人细胞。
多肽大至少350％。在一些实施例中，ph 4.6下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少400％。
[0094]
在一些实施例中，本文的药物组合物包含在ph 7.4下具有增加的半衰期的经修饰的α
‑
gal多肽。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少50％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少150％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少200％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少250％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少300％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少350％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少400％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少500％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少600％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少700％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少800％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少900％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少1000％。
[0095]
在一些实施例中，本文的药物组合物包含在ph 7.4下具有增加的半衰期的经修饰的ppt
‑
1多肽。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少50％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少150％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少200％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少250％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少300％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少350％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少400％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少500％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少600％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少700％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少800％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少900％。在一些实施例中，ph 7.4下的半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少1000％。治疗方法基因疗法方法
[0096]
本文还提供了在有需要的受试者中改善遗传疾病的至少一种症状的方法。一些此类方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含编码用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式的基因疗法核酸，所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述核酸编码形成同源二聚体的多肽。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，所述核酸编码与野生型多肽相比在ph 7.4下具有增加的半衰期的多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的
一种或多种。在一些实施例中，通过单次施用所述基因疗法核酸构建体减轻至少一种症状。在一些实施例中，所述方法进一步包括在治疗后测量从所述受试者获得的组织中的活性。
[0097]
在一些实施例中，将所述基因疗法载体或所述药物组合物施用至脑脊液。在一些实施例中，所述基因疗法载体或所述药物组合物通过鞘内、脑室内、实质内或静脉内注射或其组合来递送。在一些实施例中，所述基因疗法载体或所述药物组合物通过鞘内注射来施用。在一些实施例中，所述基因疗法载体或所述药物组合物经由静脉注射来施用。
[0098]
在一些实施例中，所述遗传障碍是神经障碍。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病、胱氨酸病、法布里病、i型戈谢病、ii型戈谢病、iii型戈谢病、庞贝病、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、异染性脑白质营养不良、i型粘脂贮积病、ii型粘脂贮积病、iii型粘脂贮积病、iv型粘脂贮积病、贺勒病、亨特病、a型圣菲利波病、b型圣菲利波病、c型圣菲利波病、d型圣菲利波病、a型莫奎欧病、b型莫奎欧病、马罗托
‑
拉米病、斯莱病、a型尼曼
‑
皮克病、b型尼曼
‑
皮克病、c1型尼曼
‑
皮克病、c2型尼曼
‑
皮克病、i型辛德勒病、ii型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada
‑
scid)、慢性肉芽肿病(cgd)、婴儿期、幼年期和成年期形式的神经元蜡样质脂褐质沉积症以及cdkl5缺乏症。
[0099]
本文还提供了在有需要的受试者中改善法布里病的至少一种症状的方法。一些此类方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含基因疗法核酸构建体，所述基因疗法核酸构建体包含至少一个启动子和编码经修饰的α
‑
gal多肽的核酸，所述多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代。预期经修饰的α
‑
gal多肽包含半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代包括：(i)r49c和g361c；(ii)r49c和g360c；(iii)d233c和i359c；(iv)m51c和g360c；以及(v)s276c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的选自下组的半胱氨酸取代的多肽，该组由以下各项组成：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代的多肽。在一些实施例中，所述核酸编码形成同源二聚体的多肽。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，所述核酸编码与野生型α
‑
gal多肽相比在ph7.4下具有增加的半衰期的经修饰的α
‑
gal多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的一种或多种。在一些实施例中，通过单次施用所述基因疗法核酸构建体减轻至少一种症状。在一些实施例中，所述方法进一步包括在治疗后测量从所述受试者获得的组织中的α
‑
gal活性。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用分子伴侣。在一些实施例中，所述分子伴侣包含米加司他。
[0100]
本文还提供了在有需要的受试者中改善cln1病的至少一种症状的方法。一些此类方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含基因疗法核酸构建体，所述基因疗法核酸构建体包含至少一个启动子和编码经修饰的ppt
‑
1多肽的核酸，所述多肽包含ppt
‑
1多肽序列的半胱氨酸取代。预期经修饰的ppt
‑
1多肽包含半胱氨酸取代，所述半胱氨酸取代
包括a171c和a183c。在一些实施例中，所述核酸编码形成同源二聚体的多肽。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，所述核酸编码与野生型ppt
‑
1多肽相比在ph 7.4下具有增加的半衰期的经修饰的ppt
‑
1多肽。在一些实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施例中，所述核酸包含病毒的至少一部分。在一些实施例中，所述病毒选自其中所述病毒包含逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些实施例中，所述核酸被包装在病毒衣壳蛋白内。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的一种或多种。在一些实施例中，通过单次施用所述基因疗法核酸构建体减轻至少一种症状。在一些实施例中，所述方法进一步包括在治疗后测量从所述受试者获得的组织中的ppt
‑
1活性。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用分子伴侣。在一些实施例中，所述分子伴侣包含米加司他。
[0101]
在一些实施例中，经由本文所述方法进行的治疗将编码治疗性蛋白的基因递送到需要所述治疗性蛋白的细胞。在一些实施例中，所述治疗将基因递送到个体中的所有体细胞。在一些实施例中，所述治疗替代靶向细胞中的有缺陷的基因。在一些实施例中，将经离体处理以表达治疗性蛋白的细胞递送到个体。
[0102]
在一些实施例中，本文的基因疗法治疗包括施用编码本文经修饰的α
‑
gal多肽的核酸，所述多肽具有与野生型人α
‑
gal的半衰期相比增加至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍的细胞内半衰期。酶替代疗法方法
[0103]
还提供了在有需要的受试者中改善遗传疾病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含用于治疗遗传障碍的蛋白质的稳定形式，其中所述稳定形式包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。在一些实施例中，所述经修饰的多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型多肽相比，所述经修饰的多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述至少一种症状选自精神损害、癫痫、丧失言语能力和丧失运动技能中的一种或多种。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用分子伴侣。在一些实施例中，所述分子伴侣包含米加司他。
[0104]
在一些实施例中，所述组合物经由鞘内、脑室内、实质内、皮下、肌内、眼睛、静脉内注射或其组合来施用
[0105]
在一些实施例中，所述遗传障碍是神经障碍。在一些实施例中，所述遗传障碍是溶酶体贮积症。在一些实施例中，遗传障碍选自下组，该组由以下各项组成：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、贝敦病、胱氨酸病、法布里病、i型戈谢病、ii型戈谢病、iii型戈谢病、庞贝病、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、异染性脑白质营养不良、i型粘脂贮积病、ii型粘脂贮积病、iii型粘脂贮积病、iv型粘脂贮积病、贺勒病、亨特病、a型圣菲利波病、b型圣菲利波病、c型圣菲利波病、d型圣菲利波病、a型莫奎欧病、b型莫奎欧病、马罗托
‑
拉米病、斯莱病、a型尼曼
‑
皮克病、b型尼曼
‑
皮克病、c1型尼曼
‑
皮克病、c2型尼曼
‑
皮克病、i型辛德勒病、ii型辛德勒病、腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ada
‑
scid)、慢性肉芽肿病(cgd)、婴儿期、幼年期和成年期形式
的神经元蜡样质脂褐质沉积症以及cdkl5缺乏症。
[0106]
还提供了在有需要的受试者中改善法布里病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含经修饰的α
‑
gal多肽，其中所述经修饰的α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的半胱氨酸取代。预期的半胱氨酸取代包括：(i)d233c和i359c；以及(ii)m51c和g360c。在一些实施例中，所述经修饰的α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的d233c和i359c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的α
‑
gal多肽包含α
‑
gal多肽序列的m51c和g360c的半胱氨酸取代。在一些实施例中，所述经修饰的α
‑
gal多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型α
‑
gal多肽相比，所述经修饰的α
‑
gal多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述至少一种症状选自疼痛、皮肤变色、不能出汗、眼睛浑浊、胃肠功能障碍、耳鸣、听力损失、二尖瓣脱垂、心脏病、关节痛、肾衰竭和肾功能障碍中的一种或多种。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用分子伴侣。在一些实施例中，所述分子伴侣包含米加司他。
[0107]
还提供了在有需要的受试者中改善cln
‑
1病的至少一种症状的方法，所述方法包括施用至少一个剂量的组合物，所述组合物包含经修饰的ppt
‑
1多肽，其中所述ppt
‑
1多肽包含一个或多个非天然半胱氨酸残基，所述一个或多个非天然半胱氨酸残基在所述蛋白质内的非天然半胱氨酸之间或在所述蛋白质的两个单体的非天然半胱氨酸之间形成二硫桥。预期的半胱氨酸取代包括：a171c和a183c。在一些实施例中，所述经修饰的ppt
‑
1多肽形成同源二聚体。在一些实施例中，所述同源二聚体通过二硫键稳定。在一些实施例中，与野生型ppt
‑
1多肽相比，所述经修饰的ppt
‑
1多肽在ph 7.4下显示出增加的半衰期。在一些实施例中，所述至少一种症状选自精神损害、癫痫、丧失言语能力和丧失运动技能中的一种或多种。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用分子伴侣。在一些实施例中，所述分子伴侣包含米加司他。
[0108]
在一些实施例中，本文的方法包括施用与野生型多肽相比具有增加的半衰期的本文经修饰的多肽。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少50％。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少150％。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少200％。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少250％。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少300％。在一些实施例中，半衰期比野生型多肽大至少350％。
[0109]
在一些实施例中，本文的方法包括施用与野生型α
‑
gal多肽相比具有增加的半衰期的本文经修饰的α
‑
gal多肽。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少50％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少150％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少200％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少250％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少300％。在一些实施例中，半衰期比野生型α
‑
gal多肽大至少350％。
[0110]
在一些实施例中，本文的方法包括施用与野生型ppt
‑
1多肽相比具有增加的半衰期的本文经修饰的ppt
‑
1多肽。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少50％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少150％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少200％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少250％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少300％。在一些实施例中，半衰期比野生型ppt
‑
1多肽大至少350％。
定义
[0111]
如本文关于蛋白质使用的“稳定的”是指经修饰的蛋白质(例如，经修饰以含有非天然半胱氨酸残基)，其在比没有所述修饰的相应蛋白质更长的时间段内维持其生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，稳定的蛋白质维持生物活性的时间比没有所述修饰的相应蛋白质长约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。在一些实施例中，稳定的蛋白质维持生物活性的时间比没有所述修饰的相应蛋白质长至少10％、长至少20％、长至少30％、长至少40％、长至少50％、长至少60％、长至少70％、长至少80％、长至少90％、长至少100％、长至少150％、长至少200％、长至少250％、长至少300％、长至少350％、长至少400％、长至少450％或长至少500％。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质具有更长的半衰期。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 4.0至ph 8.0、或ph 4.0至6.0、或ph 6.0至8.0下具有更长的半衰期。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 4.5至5.0或7.0至7.5下具有更长的半衰期。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 7.4下具有更长的半衰期。在一些实施例中，与没有所述非天然半胱氨酸的相应蛋白质相比，所述稳定的蛋白质在ph 4.6下具有更长的半衰期。
[0112]
如本文所用的“离体基因疗法”是指在受试者外部对患者细胞进行遗传修饰，例如以表达治疗性基因的方法。然后，将具有新遗传信息的细胞返回到其源自的受试者。
[0113]
如本文所用的“体内基因疗法”是指将携带一个或多个治疗性基因的载体直接施用至受试者的方法。
[0114]
如本文所用的“融合蛋白”和“治疗性融合蛋白”在本文中可互换使用，并且是指具有与其连接的至少一种另外的蛋白质、肽或多肽的治疗性蛋白。在一些情形中，融合蛋白是含有两个或更多个蛋白质或其片段的单个蛋白质分子，它们经由在其各自的肽链内的肽键共价连接，而没有化学接头。在一些实施例中，所述融合蛋白包含治疗性蛋白以及信号肽、增加所述融合蛋白的内吞作用的肽或两者。在一些实施例中，增加内吞作用的肽是结合ci
‑
mpr的肽。
[0115]
如本文所用的“质粒”是指在细胞内独立于染色体dna而复制的环状双链dna单元。
[0116]
如本文所用的“启动子”是指dna上的位点，酶rna聚合酶与其结合并启动dna转录成rna。
[0117]
如本文所用的“体细胞疗法”是指在细胞中操纵基因表达的方法，所述细胞将对患者进行纠正，但不会被下一代遗传。体细胞包括人体内所有的非生殖细胞。
[0118]
如本文所用的“体细胞”是指除了生殖细胞之外的所有身体细胞。
[0119]
如本文所用的“趋向性”是指载体(如病毒)对于某种细胞或组织类型的偏好。多种因素决定了载体感染特定细胞的能力。例如，病毒必须与特定的细胞表面受体结合才能进入细胞。如果病毒不表达必要的受体，则它们典型地不能感染细胞。
[0120]
如本文所用的“载体”或“基因疗法载体”在本文中可互换使用，是指将治疗性基因递送到细胞的基因疗法递送媒介物或载体。基因疗法载体是适于在基因疗法中使用的任何载体，例如适用于将核酸聚合物(编码多肽或其变体)治疗性递送到患者靶细胞(例如，感觉
神经元)中的任何载体。在一些实施例中，所述基因疗法载体将编码治疗性蛋白或治疗性融合蛋白的核酸递送到细胞，其中所述治疗性蛋白或融合蛋白从所述细胞表达和分泌。所述载体可以是任何类型的，例如它可以是质粒载体或微环dna。典型地，所述载体是病毒载体。这些包括遗传致残的病毒(如腺病毒)和非病毒载体(如脂质体)两者。病毒载体可以例如源自腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒或腺病毒。aav源载体。所述载体可以包含aav基因组或其衍生物。
[0121]
如本文所用的“构建体”是指编码治疗性蛋白或融合蛋白的核酸分子或序列，并且任选地包含另外的序列，如翻译起始序列或ires序列。
[0122]
术语“转导”用于指经由本披露的复制缺陷型raav在体内或体外向靶细胞施用/递送编码治疗性蛋白的核酸，从而导致由受者细胞表达功能性多肽。用基因疗法载体(如本披露的raav)转导细胞导致由raav编码的多肽或rna的持续表达。因此，本披露提供了通过鞘内、视网膜内、眼内、玻璃体内、脑室内、实质内或静脉内途径或其任何组合向受试者施用/递送基因疗法载体(如编码治疗性蛋白的raav)的方法。“鞘内”递送是指递送到脑或脊髓蛛网膜下的空间中。在一些实施例中，鞘内施用是经由脑池内施用。
[0123]
术语“受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且在一些情况下，是指期望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。出于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物、以及实验室、动物园、体育运动或宠物动物，如狗、马、猫、乳牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。在一些实施例中，所述哺乳动物是人。
[0124]
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“改善症状”等在一些情况下是指出于获得治疗效果的目的而施用药剂或实施程序，所述治疗效果包括以统计学显著的方式或以临床显著的方式抑制、减弱、减轻、预防或改变障碍的至少一个方面或标记。术语“改善”或“治疗”并不陈述或暗示潜在病状的治愈。如本文所用的“治疗”或“改善”(等)可以包括治疗哺乳动物，特别是在人中，并且包括：(a)防止障碍或障碍的症状在可能易患障碍但尚未被诊断为患有障碍(例如，包括可能与原发障碍相关或由原发障碍引起的障碍)的受试者中发生；(b)抑制障碍，即遏制其发展；(c)缓解障碍，即导致障碍消退；以及(d)改善障碍的至少一种症状。治疗可以指治疗或改善或预防障碍的任何成功标志，包括任何客观或主观参数，如消除；缓解；减轻症状或使障碍状况对患者更可耐受；减慢退化或衰退的速率；或者使退化的终点不那么虚弱。症状的治疗或改善是基于一个或多个客观或主观参数；包括医生的检查结果。因此，术语“治疗”包括施用本发明的化合物或药剂以预防或延迟、缓解或阻止或抑制与障碍相关的症状或病状的发展。术语“治疗效果”是指减轻、消除或预防受试者的障碍、障碍的症状或障碍的副作用。
[0125]
术语“亲和力”是指分子与其结合配偶体或受体之间的结合强度。
[0126]
如本文所用，短语“高亲和力”是指例如含有这种结合ci
‑
mpr的肽的治疗性融合体，其对ci
‑
mpr的亲和力是没有所述肽的治疗性蛋白的亲和力的约100至1,000倍或500至1,000倍。在一些实施例中，亲和力是没有所述肽时的至少100倍、至少500倍或至少1000倍。例如，当治疗性蛋白和ci
‑
mpr以相对相等的浓度组合时，高亲和力的肽将与可用的ci
‑
mpr结合，以便使平衡向高浓度的所得复合物转移。
[0127]
如本文所用的“分泌”是指将蛋白质从细胞释放到例如待携带到目标组织或治疗
性蛋白的作用部位的血流中。当基因疗法产物分泌到器官的胞间隙中时，分泌可以允许对邻近细胞进行交叉校正。
[0128]
如本文所用的“递送”意指药物递送。在一些实施例中，递送过程意指将药物物质(例如，从基因疗法载体产生的治疗性蛋白或融合蛋白)从细胞外部(例如，血液、组织或胞间隙)运输到靶细胞中，用于药物物质的治疗活性。
[0129]
如这里所用的“工程化”或“蛋白质工程化”是指通过提供适当的核酸序列来操纵蛋白质的结构，所述核酸序列编码蛋白质以产生所期望的特性，或合成具有特定结构的蛋白质。
[0130]
在一些情况下，“治疗有效量”意指在施用至受试者用于治疗疾病时足以实现对所述疾病的治疗的量。
[0131]
如本文所用，术语“约”某个数字是指从小于所述数字10％到大于所述数字10％的范围，并且包括所述范围内的值，如数字本身。
[0132]
如本文所用，术语“包含”权利要求的一个或多个要素是指那些要素，但不排除包括另外的一个或多个要素。实例
[0133]
给出以下实例是出于说明本发明的各种实施例的目的，并不意味着以任何方式限制本发明。本发明实例连同本文所述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到包含在如权利要求的范围所限定的本发明精神内的其中的变化和其他用途。实例1：鉴定用于野生型α
‑
gal的半胱氨酸取代的氨基酸残基
[0134]
检查二聚化α
‑
gal(pdb id 3hg3)的晶体结构中用于取代半胱氨酸残基的潜在位点，从而产生另外的二硫键以增强稳定性(图1a)。使用带有charmm力场的namd用于分析。基于所述分析，使用定向诱变的标准方法制备表8中所示的半胱氨酸突变体。
[0135]
还参见图1b。氨基酸序列提供于表1中。实例2：经修饰的α
‑
gal的二聚化和酶活性
[0136]
在细胞裂解物和培养基中检查经修饰的α
‑
gal的二硫键键合二聚体的形成(图2a)。在293hek细胞中瞬时表达每个α
‑
gal构建体的克隆。在4％
‑
12％梯度sds
‑
page上运行细胞裂解物和培养基，并且将其转移到硝酸纤维素中。通过用兔单克隆抗α
‑
gal 1:2000(abcam ab168341)的蛋白质印迹法检测α
‑
gal。
[0137]
对还原和非还原样品进行电泳和蛋白质印迹。如图2所示，α
‑
gal的m51c
‑
g360c和d233c
‑
i359c版本容易地形成二硫键键合的α
‑
gal二聚体。
[0138]
为了制备样品，收获具有α
‑
gal构建体瞬时表达的1x 10^6个细胞。将细胞在500ul 20mm磷酸钠缓冲液ph 6.5、0.25％tx
‑
100中裂解。以10,000g将细胞裂解物离心2min，并且
将上清液转移到新管中。将40ul细胞裂解物或培养基转移到新管中，并且向16μl lds 4x样品缓冲液中添加6μl 10x还原剂(用于还原条件)。将如下制备的样品混合物在95℃下加热5分钟。使用1x mops sds运行缓冲液进行电泳。
[0139]
为了测试酶活性，将裂解物或培养基与4
‑
甲基伞形酮
‑
α
‑
d
‑
吡喃半乳糖苷(4
‑
mug)底物一起孵育1小时。然后停止酶促反应，并且通过在360nm处的激发和在450nm处的发射的荧光来测量α
‑
gal酶活性。如图2b所示，m51c
‑
g360c和d233c
‑
i359c二硫键α
‑
gal突变体两者均具有酶活性。因为没有量化每个样品中α
‑
gal的比活性和量，因此图2b未提供α
‑
gal的野生型与突变型版本之间活性的定量比较。实例3：经修饰的α
‑
gal在酸性环境中随时间推移的稳定性分析
[0140]
为了测试24h内的ph稳定性，根据标准方法，使用伴刀豆球蛋白a(cona)琼脂糖下拉来捕获瞬时表达的突变体和野生型α
‑
gal。在ph 4.6缓冲液或ph 7.4缓冲液中稀释cona洗脱液。将样品在ph 4.6或7.4下预孵育0、0.5、1、2、4、5和24小时。
[0141]
为了测量酶活性，将ph 4.6缓冲液添加到每个样品中，并且在4
‑
mug底物上测试活性。将反应混合物在37℃下孵育1小时。通过添加125ul终止缓冲液(0.4m甘氨酸
‑
naoh，ph 10.8)来终止反应用spectramax读板机读取荧光：激发：360nm，发射：450nm。结果示于图3a中。
[0142]
为了进行长期稳定性测试，从培养基中分离出瞬时表达的经修饰和野生型α
‑
gal，并且使用如上所述的cona琼脂糖珠进行富集和纯化。将洗脱出的α
‑
gal在ph 4.6或ph 7.4下孵育以进行时程稳定性实验。时间点包括0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、5小时、24小时、2天、5天、6天和7天。图3b示出了在ph 4.6下，m51c
‑
g360cα
‑
gal在7天的跨度内比野生型对照更稳定。两种经修饰的α
‑
gal在7天内在ph 7.4下比野生型对照明显更稳定。实例4：法布里患者成纤维细胞的α
‑
gal摄取和酶法测定细胞摄取方案
[0143]
为了进行摄取测定，在第1天，将300,000个法布里患者成纤维细胞(r301q)接种到6孔板的每个孔中。在第2天，将培养基替换为1.8ml摄取培养基，并且在37c下用5％co2孵育1小时。给予细胞200ul剂量的在步骤2中制备的6孔中的摄取培养基中制备的250nm酶(法布赞(fabrazyme)、m51c
‑
g360c、d233c
‑
i359c和wt)持续16
‑
18小时。在第3天，添加300ul 1m tris，并且在室温下孵育30min。添加400ul 1m nah2so4并混合。用1ml dpbs将细胞板洗涤两次。将500ul水添加到每个孔中，并且从板中收集细胞。添加matric
‑
green，然后在
‑
80℃冰箱中冷冻直至测定。在酶和蛋白质测定之前旋转板。
[0144]
通过向130ul水中添加20ul细胞裂解物来进行蛋白质测定。添加150ul bca工作试剂并在37℃下孵育2小时。然后在spectramax上读取板。
[0145]
通过向15ul测定缓冲液中添加5ul细胞裂解物，然后添加50ul4
‑
mug底物来进行酶测定。将其在37℃下孵育1小时。添加125ul终止缓冲液并在spectramax上读取。
[0146]
作为对照，将冷冻细胞裂解物在室温下解冻并超声处理5min。将50μl转移到13ml硅烷化玻璃管中。添加25μl葡萄糖鞘氨醇半乳糖苷(is)(浓度125ng/ml)。添加1ml甲醇，并且将混合物超声处理大约10min。添加500μl 1n hcl，涡旋，然后超声处理大约10分钟。然后将混合物在室温下振荡大约30分钟。以4,000rpm将样品在室温下离心10min。将上清液转移到预调节的spe筒上。
[0147]
通过用1ml甲醇和1ml millipore水调节spe筒来制备固体样品。将样品装载到spe筒上。用2ml 0.1n hcl然后用2ml meoh洗涤筒。将样品用2ml 5％氢氧化铵甲醇溶液洗脱到干净的硅烷化玻璃中。将样品在氮气下于40℃下蒸发至干燥。将25μl dmso添加到每种提取物中并涡旋。添加125μl(175μl用于运行03)的流动相b并涡旋。将样品转移到玻璃小瓶中。将10μl注入到分析柱上。
[0148]
在6孔板中培养和接种来自法布里病患者的成纤维细胞。将用野生型α
‑
gal处理的细胞用作摄取和后续酶研究的阳性对照。将成纤维细胞与野生型α
‑
gal、m51c
‑
g360cα
‑
gal或d233c
‑
i359cα
‑
gal一起孵育16至18小时。然后将细胞裂解以用于如通过荧光输出所确定的α
‑
gal酶促测定。图4a显示，m51c
‑
g360c和d233c
‑
i359cα
‑
gal两者均能够恢复α
‑
gal酶活性，至少与野生型α
‑
gal一样。参见图4b。球形三酰鞘氨醇(lyso
‑
gb3)是法布里病的生物标记。如通过lc
‑
ms/ms所确定的，法布里病的成功治疗导致lyso
‑
gb3的显著减少。实例5：fb
‑
14(r301q)法布里患者成纤维细胞中的变体同源二聚体摄取
[0149]
将法布里患者成纤维细胞接种在6孔板中，以进行法布赞和α
‑
gal细胞摄取研究。将细胞在含有7nm法布赞、野生型α
‑
gal、m51c
‑
g360cα
‑
gal或d233c
‑
i359cα
‑
gal的摄取培养基中于37c、5％co2培养箱中孵育16h。在第1天，洗涤细胞，并且将其在常规生长培养基中进一步维持另外5天。在图5所示的时间点收获细胞。使用细胞裂解物来测定酶活性。确定α
‑
gal酶活性，并且用细胞裂解物蛋白浓度归一化为nmol/mg蛋白/h。已确定，在细胞摄取后，变体同源二聚体在细胞内的半衰期是野生型的2
‑
3倍，是法布赞的3
‑
4倍(图5)。实例6：小鼠模型中的法布里病基因疗法
[0150]
将aav载体在无菌pbs中稀释。aav载体包括：aavhu68.cb7.hgl anatural.rbg、aavhu68.cb7.hglaco.rbg和aavhu68.cb7.hgla
‑
m51c
‑
g360cco.rbg。
[0151]
载体产生
[0152]
将参考gla序列和在位置51处具有甲硫氨酸至半胱氨酸和在位置360处具有甘氨酸至半胱氨酸的变体进行反翻译，并且对核苷酸序列进行密码子优化，以产生用于在cb7启动子下用表达盒产生aav的顺式
‑
质粒。此外，将天然hgla(参考序列)cdna排序并克隆到相同的aav
‑
顺式主链中，以与密码子优化的序列进行比较。如先前所述地产生并滴定aavhu68载体(lock,alvira等人2010,“rapid,simple,and versatile manufacturing of recombinant adeno
‑
associated viral vectors at scale.”[“重组腺相关病毒载体的快速、简单且通用的大规模制造。”]hum gene ther[人类基因疗法]21(10):1259
‑
1271)。简而言之，对hek293细胞进行三重转染，并且收获培养上清液，将其浓缩并用碘克沙醇梯度纯化。如先前所述地使用靶向兔β
‑
珠蛋白polya序列的引物，用液滴数字pcr滴定经纯化的载体(lock m,r.alvira,s.j.chen和j.m.wilson,“absolute determination of single
‑
stranded and self
‑
complementary adeno
‑
associated viral vector genome titers by droplet digital pcr.”[“通过液滴数字pcr绝对测定单链和自互补腺相关病毒载体基因组滴度。”]hum gene ther methods[人类基因疗法方法]25(2):115
‑
125(2014))。
[0153]
动物
[0154]
小家鼠(mus musculus)(gla敲除的法布里小鼠，在c57bl/6/129背景建立者(founder)中)购自杰克逊实验室(jackson labs)(库存编号003535
‑
也称为“α
‑
gal a ko小鼠”)。在基因疗法程序aaalac认可的屏障小鼠设施中维持繁殖集落，使用杂合子与杂合子
交配，以便在同一窝内产生无效和wt对照。gla敲除小鼠是广泛使用的法布里病模型。
[0155]
所述小鼠在临床上似乎正常，但它们在血浆中表现出gla底物球形三酰鞘氨醇(亦称lyso
‑
gb3)的逐渐积累，并且在肝脏、心脏、肾脏、皮肤、小肠和大肠以及中枢神经系统中表现出球形三酰神经酰胺(亦称gl3、gb3)的逐渐积累。小规模、可重现的表型和有效的育种允许进行快速研究，其对于体内筛选中的临床前候选物而言是最佳的。
[0156]
将动物饲养室维持在64
°
f
‑
79
°
f(18℃
‑
26℃)的温度范围和30％
‑
70％的湿度范围内。将动物与其父母和同窝动物一起饲养，直到断奶，接下来在转化研究实验室(translational research laboratories，trl)gtp动物饲养所的标准笼子中饲养，每笼2至5只动物。将笼子、水瓶和铺垫基材高压灭菌到屏障设施中。维持自动控制的12小时明/暗循环。每个黑暗时期开始于1900小时(
±
30分钟)。随意提供食物(普瑞纳公司(purina)，5053，irradiated，啮齿动物饮食20，25lb)。所有动物均经由单独放置在每个饲养笼中的水瓶随意地取水。
[0157]
体内研究和组织学
[0158]
在载体给药后第7天和第21天对经由侧尾静脉接受0.1ml的5x10
11 gc(大约2.5x10
13 gc/kg)aavhu68.cb7.hgla(各种hgla构建体)的小鼠进行放血以进行血清分离，并且在注射后28天进行最终放血(用于血浆分离)并通过放血实施安乐死。从大脑开始迅速地收集组织。
[0159]
使用标准方法对用于组织学的组织进行福尔马林固定和石蜡包埋。将带有drg的脊髓(在骨中)在zf中固定，在edta中脱钙，并且根据gtp形态学核心(gtp morphology core)的标准程序进行处理。使用锌
‑
福尔马林来获得良好的组织保存，并且将其用于通过ihc染色gb3储存物并用于进行形态学(h&e)。
[0160]
对福尔马林固定的石蜡包埋的样品进行gl3免疫染色。将切片脱蜡，用pbs 0.2％triton中的1％驴血清封闭15min，然后依次与在封闭缓冲液中稀释的一抗(amsbio ams.a2506，抗gb3单克隆抗体)和生物素化二抗一起孵育；使用基于hrp的比色反应来检测信号。由委员会认证的兽医病理学家以盲法方式审查玻片。
[0161]
法布里
‑
/
‑
小鼠媒介物pbs对照显示明显的gl3(ihc染色切片上的暗染色)积累。wt小鼠和所有经载体处理的小鼠均具有gl3储存物的接近完全至完全清除(图6)。
[0162]
gla活性
[0163]
将匀浆组织的血浆或上清液与6mm 4
‑
mu
‑
α
‑
吡喃半乳糖苷ph 4.6、90mm galnac混合，并且在37℃下孵育三小时。用0.4m甘氨酸ph 10.8停止反应。使用victor3荧光计、在355nm处的激发和在460nm处的发射来测量相对荧光单位(rfu)。通过从4
‑
mu的标准曲线进行插值来计算以nmol/ml/h为单位的活性。将单独组织样品中的活性水平相对于匀浆上清液中的总蛋白质含量归一化。将等体积用于血浆样品。
[0164]
法布里
‑
/
‑
小鼠显示完全缺乏α
‑
gal a活性。用aavhu68.cb7.hgla
‑
m51c
‑
g360cco.rbg gtx载体处理法布里小鼠导致肾脏中的gla活性是野生型的>7倍(图7)。
[0165]
通过lc
‑
ms/ms定量球形三酰神经酰胺(亦称gl3、gb3)
[0166]
通过lc
‑
ms/ms测定来量化组织匀浆中的gla底物gl3。简而言之，将内标添加到匀浆样品(50μl)中，并且使用基于c18的固相萃取(spe)处理样品。从含有十二种神经酰胺形式的原液制备gl3的已知浓度(8.83nm至4.41μm)的标准曲线。对所有十二种同种型的经监
测反应进行求和，并且在此测定中生成相对于内标的比率。然后将研究样品的所得比率与所制备的曲线进行比较以用于gl3量化。
[0167]
法布里
‑
/
‑
小鼠显示gla底物球形三酰神经酰胺(gl3)的积累>10倍。用aavhu68.cb7.hgla
‑
m51c
‑
g360cco.rbg gtx载体处理法布里小鼠导致肾脏中gl3完全降低到野生型水平(图8)。
[0168]
通过lc
‑
ms/ms定量球形三酰鞘氨醇(亦称lyso
‑
gb3)
[0169]
通过lc
‑
ms/ms测定来量化血浆中的gla底物lyso
‑
gb3。简而言之，将稳定的c13标记的内标添加到血浆样品(50μl)中，并且使用c18/阳离子交换混合模式固相萃取(spe)处理样品。制备lyso
‑
gb3的已知浓度(0.254nm至254nm)的标准曲线，然后将研究样品的lyso
‑
gb3反应与所制备的曲线进行比较以用于lyso
‑
gb3量化。
[0170]
通过lc/ms得到的gla特征肽
[0171]
将血浆在100％甲醇中沉淀并离心。丢弃上清液。向沉淀中掺入hgla独有的稳定的同位素标记的肽作为内标，并且用胰蛋白酶重新悬浮，并且在37℃下孵育两小时。用10％甲酸停止消化。通过c
‑
18反相色谱法分离肽，并且通过esi
‑
质谱法进行鉴定和量化。由特征肽浓度计算血浆中的总gla浓度。
[0172]
细胞表面受体结合测定
[0173]
将96孔板用受体包被，洗涤，并且用bsa封闭。将含有相等rhgla或工程化gla活性的cho培养条件培养基或血浆连续稀释三倍，以得到一系列九个递减的浓度，并且与共偶联受体一起孵育。在孵育后，洗涤板以除去任何未结合的gla，并且在37℃下添加4
‑
mu
‑
α
‑
吡喃半乳糖苷持续一小时。用1.0m甘氨酸(ph10.5)停止反应，并且通过spectramax荧光计；激发370，发射460读取rfu。将每个样品的rfu通过从4
‑
mu的标准曲线进行插值转换为以nmol/ml/h为单位的活性。使用graphpad prism完成非线性回归。实例7：稳定的ppt
‑
1构建体
[0174]
基于晶体结构(pdb id 3gro)工程化稳定的ppt
‑
1构建体。预测这两个半胱氨酸会形成二硫键，其稳定所述结构，并且发现可延长酶功能的半衰期(参见以下数据)。发现这种构建体在heg 293中的表达水平接近野生型ppt
‑
1的表达水平。
[0175]
提高了ppt
‑
1酶的稳定性和半衰期
[0176]
如通过测量活性酶的半衰期所确定的，将分子内二硫桥工程化到ppt
‑
1中以便稳定所述酶。选择突变的残基a171c/a183c是因为同源蛋白ppt
‑
2中的等效残基形成二硫桥。使用同源蛋白中的这种自然变异来告知ppt
‑
1中的工程化工作。
[0177]
构建体ppt
‑
1的稳定性测试
[0178]
使构建体ppt
‑
1在hek 293t细胞中瞬时表达，并且在转染后五天收获条件培养基。对野生型ppt1进行了相同操作。在48或72小时的过程中，对两组条件培养基进行酶活性测定。确定随时间推移保留的酶活性的量，以便将半胱氨酸双突变体与wt进行比较。(图9)。
[0179]
以代表α和β相的两种方式估计半衰期，因为活性似乎是双相消除(参见以下pk表附近的对数图)。在早期终末或分布阶段期间估计了α半衰期，在终末消除阶段期间估计了β半衰期。对于atb200总gaa蛋白分析，通常报告α相，因为它对于证明at2221在血液中分布到组织中期间对atb200的结合和稳定的作用更有意义。
[0180]
报告了构建体ppt
‑
1的药代动力学，包括c0和auc。auc
无穷
是从用于估计β半衰期的
相同消除速率常数得出的。
[0181]
虽然在本文已经显示和描述了本发明的优选实施例，但对于本领域技术人员而言将明显的是，此类实施例仅通过举例的方式来提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解的是，可以采用本文所述的实施例的各种替代方案。意图在于，以下权利要求限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。