新颖性医药组合物及其于修复视网膜损伤与治疗视觉病变的用途的制作方法

1.本发明关于修复视网膜损伤、改善视网膜功能或治疗视觉病变的组合物。


背景技术：

2.视网膜病变为由于视网膜部分细胞退化或坏死而导致视力减退或全盲。视网膜位于眼球底部，可将视觉影像传到脑部。视网膜由多层细胞组成，包含有感光细胞、视网膜色素上皮层细胞(retinal pigment epithelium，rpe)等。视网膜色素上皮层细胞为一层紧贴于视网膜感觉神经外的色素细胞。视网膜色素上皮层细胞含有色素小颗粒，负责提供养分与氧气给感光细胞，以维持感光细胞所需的营养。视网膜色素上皮细胞也负责调节离子浓度、排除代谢废弃物等，借以维持感光细胞、视神经细胞等的正常运作。
3.然而，随着老化或环境伤害，会造成视网膜色素上皮层细胞失去功能，甚至造成细胞死亡，进而导致多种视网膜病变产生，例如：视网膜色素病变、黄斑部病变、糖尿病视网膜病变等。因此，如何修复视网膜损伤或是恢复视网膜功能以治疗或减缓眼部疾病，成为目前研究的目标。


技术实现要素：

4.本发明实施例提供的包含粒线体的组合物，可修复视网膜损伤、改善视网膜功能或治疗视觉病变。
5.本发明实施例提供一种粒线体用于制备修复视网膜损伤的组合物的用途。
6.本发明实施例提供一种粒线体用于制备治疗视觉病变的组合物的用途。
7.本发明实施例提供一种改善视网膜功能或治疗视觉病变的组合物，包含从自体细胞中取出的粒线体与外源性的粒线体至少一者。
8.本发明实施例提供的包含粒线体的组合物，可改善视网膜细胞老化的情况、修复视网膜损伤、改善视网膜功能并治疗视觉病变。
附图说明
9.图1为使用tbhp诱导细胞老化的实验结果。
10.图2为使用本发明实施例的包含粒线体的组合物改善细胞老化的实验结果。
11.图3为细胞中粒线体的atp合成耗氧率。
12.图4为细胞中粒线体的最大耗氧率。
13.图5为细胞中粒线体的媒合效率。
14.图6为sd大鼠的视网膜电流图。
具体实施方式
15.在以下实施方式中详细叙述本发明的详细特征及优点，其内容足以使任何本领域
技术人员了解本发明的技术内容并据以实施，且根据本说明书所揭露的内容、权利要求书及附图，任何本领域技术人员可轻易理解本发明相关的目的及优点。以下实施例进一步详细说明本发明的观点，但非以任何观点限制本发明的范畴。
16.粒线体在细胞内除了提供能量给细胞外，还负责调控细胞内氧化压力、信号传递等功能。近年来已有文献指出老化、紫外光、氧化压力等皆会造成位于视网膜的部分细胞突变程度增加、氧化压力调控失衡、粒线体结构与功能异常等，最终造成视觉病变。视觉病变造成的疾病例如包含视网膜病变、黄斑部病变、青光眼、白内障等。视网膜病变例如包含视网膜色素病变、糖尿病视网膜病变、非增殖性糖尿病视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、高血压性视网膜病变、早产儿视网膜病变、放射性视网膜病变、日光性视网膜病变等。黄斑部病变例如包含糖尿病黄斑部水肿等。因此，通过在视觉病变处施予健康的粒线体，可修复病变细胞的损伤、改善病变细胞功能并治疗视觉病变。
17.本发明一实施例提供改善视网膜功能或治疗视觉病变的组合物，包含从自体细胞中取出的粒线体与外源性的粒线体至少一者。粒线体可取自哺乳动物的单核球细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、造血干细胞、cd34 干细胞、骨髓干细胞等具有粒线体的细胞。在部分实施例中，粒线体较佳为取自与被施用组合物者同种的细胞，例如被施用组合物者为人类则使用人类的细胞，被施用组合物者为狗则使用狗的细胞。在部分实施例中，粒线体也可为取自与被施用组合物者同种或不同种的细胞，经体外保存或体外培养后获得的外源性粒线体。在本发明部分实施例中，本组合物可还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包含用于任何标准医疗产品或美容产品的载体，依据组成物的形式载体可为半固体或液体。举例而言，载体包含但不限于玻尿酸、明胶、乳化剂、水、生理食盐水、缓冲盐水或乙醇等可维持粒线体活性的物质。
18.在本发明部分实施例的组合物中，粒线体的重量可为1微克至1000微克。在本发明部分实施例的组合物中，粒线体的重量可为5微克至1000微克。在本发明部分实施例的组合物中，粒线体的重量可为5微克至200微克。在本发明的组合物中，粒线体的浓度可为每毫升5微克至16000微克(μg/ml)。在本发明一部份实施例中，粒线体的浓度为每毫升1000微克至16000微克。在本发明另一部份实施例中，粒线体的浓度为每毫升3000微克至8000微克。在本发明再一部份实施例中，粒线体的浓度为每毫升5微克至80微克。在本发明又一部份实施例中，粒线体的浓度为每毫升15微克至40微克。
19.本发明的组合物可通过口服、注射等方式给予视网膜。在本发明部份实施例中，较佳为直接对视网膜进行通过注射的方式给予视网膜此组合物，但不以此为限。本发明部分实施例的组合物中粒线体的有效剂量为每平方毫米视网膜面积1微克至1000微克。本发明部分实施例的组合物中粒线体的有效剂量为每平方毫米视网膜面积5微克至200微克。本发明部分实施例的组合物中粒线体的有效剂量为每平方毫米视网膜面积5微克至80微克。本发明部分实施例的组合物中粒线体的有效剂量为每平方毫米视网膜面积25微克至66.7微克。举例而言，在0.6平方毫米的视网膜下腔中，给予的组合物中粒线体有效剂量可为15微克至40微克。
20.在本发明部分实施例中，包含粒线体的组合物可修复视网膜细胞老化导致的损伤。并且，随着粒线体浓度增加，修复的效果更好。
21.在本发明部分实施例中，包含粒线体的组合物可提高atp合成耗氧率，表示粒线体
合成atp的能力提升；可提高最大耗氧率，表示粒线体的极限能力提升；可提高粒线体的媒合效率，表示粒线体的综合能力变佳。因此，对受损伤或老化的视网膜细胞，施以实施例的包含粒线体的组合物，可提升粒线体的能力，以进一步产出能量供细胞进行细胞损伤修复或细胞老化改善。
22.在本发明部分实施例中，包含粒线体的组合物可改善受损的视网膜功能，包含改善视网膜中受损的杆状细胞、锥状细胞、缪勒氏细胞及双极细胞的电流传递能力，表示包含粒线体的组合物可修复视网膜中受损的杆状细胞、锥状细胞、缪勒氏细胞及双极细胞，以达到治疗如上述的视觉病变的效果。
23.以下说明如何制备本发明实施例的组合物。
24.[粒线体萃取]
[0025]
本发明实施例所使用的粒线体取自人类脂肪干细胞(adipose
‑
derived stemcell，adsc)。在培养皿中将人类脂肪干细胞培养至细胞数为1.5
×
108个细胞，以杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)冲洗细胞。接着，移除杜氏磷酸盐缓冲液后，加入细胞剥离用的胰蛋白酶(trypsin)，在37℃下反应3分钟后，再加入干细胞培养液(keratinocyte sfm(1x)液体(gibco)、bovine pituitary extract(bpe，gibco)、10％(重量百分浓度)胎牛血清(hyclone))以终止反应。接着，将细胞冲洗下来后打散，以600g离心10分钟，移除上清液。接着，于细胞中加入80毫升的ibc
‑
1缓冲液(225mm甘露醇、75mm蔗糖、0.1mm edta、30mm tris
‑
hcl ph 7.4)，在均质器中于冰上研磨15次。接着，以1000g离心15分钟，将上清液收集至另一离心管，再以9000g离心10分钟，移除上清液。所获得的沉淀物即为粒线体。在粒线体沉淀物中加入1.5毫升的ibc
‑
2缓冲液(225mm甘露醇、75mm蔗糖、30mm tris
‑
hcl ph 7.4)及蛋白质分解酶抑制剂，并置于4℃下保存。
[0026]
〔实验一〕视网膜细胞的老化
[0027]
本实验使用人类视网膜色素上皮细胞株(a human retinal pigment epithelial cell line，arpe
‑
19)作为评估视网膜损伤的细胞模式。视网膜色素上皮细胞为与视网膜病变有重要关联的细胞，故常被用于探讨视觉病变。本实验使用的arpe
‑
19细胞的代数为4至10代间。arpe
‑
19细胞培养液为dmem/f12培养基，包含2.5mm谷酰氨酸、15mm hepes、0.5mm丙酮酸钠、1200毫克/升(mg/l)碳酸氢钠及10％(重量百分浓度)胎牛血清。
[0028]
过氧化三级丁醇(tert
‑
butyl hydroperoxide，tbhp)为一种有机过氧化物，常用作为诱导细胞氧化压力损伤、老化与细胞凋亡的物质。在体外细胞模式中研究视觉病变时，tbhp也常被用于诱导视网膜色素上皮细胞损伤或老化。本实验即使用tbhp作为诱导arpe
‑
19细胞损伤或老化的物质。
[0029]
在老化的细胞中，老化相关
‑
β
‑
半乳糖苷酶(senescence
‑
associated beta
‑
galactosidase，sa
‑
β
‑
gal)会被过度表达。因此，sa
‑
β
‑
gal可作为细胞衰老的标记之一。本实验使用sa
‑
β
‑
gal套组(senescenceβ
‑
galactosidase staining kit#9860，cell signaling technology)来评估arpe
‑
19细胞的老化状态。
[0030]
在本实验中，使用tbhp诱导arpe
‑
19细胞老化。通过sa
‑
β
‑
gal套组来评估tbhp对视网膜细胞的老化效果。以下说明实验流程。
[0031]
首先，取培养代数为4至10代间的arpe
‑
19细胞进行实验。将arpe
‑
19细胞培养至培养皿的八分满时，移除培养液并使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs)润
洗细胞。接着，加入0.25％的胰蛋白酶在37℃下反应5分钟，再加入arpe
‑
19细胞培养液以终止反应。接者，以每分钟转速1000(revolutions per minute，rpm)离心5分钟，移除上清液，再加入新的arpe
‑
19细胞培养液，进行细胞计数。接着，将arpe
‑
19细胞以每孔3
×
104个细胞的浓度以arpe
‑
19细胞培养液于24孔盘培养16小时。接着，于24孔盘中加入tbhp，使其于孔盘中的浓度分别为25μm、50μm、100μm，再培养24小时。培养完成后，使用磷酸盐缓冲液清洗arpe
‑
19细胞，并使用sa
‑
β
‑
gal套组进行细胞老化的评估。
[0032]
实验结果如表1及图1所示。图1为使用tbhp诱导细胞老化的实验结果。图1中的#代表相较于控制组具有显著差异(p<0.01)。控制组为未经tbhp诱导老化的arpe
‑
19细胞。实验组为经不同浓度的tbhp诱导老化的arpe
‑
19细胞。纵轴为老化程度(％)，老化程度为老化的细胞数占所有的细胞数的百分比。实验结果显示，tbhp确实会使arpe
‑
19细胞的老化程度提高，且随着tbhp的浓度增加，arpe
‑
19细胞的老化程度越大。
[0033]
〔表1〕
[0034][0035]
〔实验二〕修复视网膜细胞老化导致的损伤
[0036]
在本实验中，使用100μm的tbhp诱导arpe
‑
19细胞老化，并给予实施例的包含粒线体的组合物以改善细胞老化。通过sa
‑
β
‑
gal套组来评估包含粒线体的组合物对视网膜细胞的老化的改善效果。以下说明实验流程。
[0037]
实验流程与上述的使用tbhp诱导细胞老化的实验流程大致相同。差异在于将arpe
‑
19细胞以每孔3
×
104个细胞的浓度于24孔盘培养16小时。接着，于24孔盘中加入tbhp，使其于孔盘中的浓度为100μm，再培养4小时。接着，于24孔盘中再加入实施例一与实施例二的包含粒线体的组合物培养20小时。培养完成后，使用磷酸盐缓冲液清洗arpe
‑
19细胞，并使用sa
‑
β
‑
gal套组进行细胞老化的评估。
[0038]
实验结果如表2及图2所示。图2为使用本发明实施例的包含粒线体的组合物改善细胞老化的实验结果。图2中的#代表相较于控制组具有显著差异(p<0.01)。控制组为未经tbhp诱导老化的arpe
‑
19细胞。对照组为仅施以100μm的tbhp且未施以实施例的组合物。纵轴为老化程度(％)，老化程度为老化的细胞数占所有的细胞数的百分比。实验结果显示，施以实施例一的组合物(粒线体浓度为15μg/ml)与实施例二的组合物(粒线体浓度为40μg/ml)皆能改善arpe
‑
19细胞的老化程度。其中，又以粒线体浓度较高的实施例二的改善效果更为显著。
[0039]
〔表2〕
[0040] 粒线体浓度tbhp(μm)老化程度(％)控制组
‑‑
12.33
对照组
‑
10022.70实施例一15μg/ml10015.77实施例二40μg/ml10012.43
[0041]
〔实验三〕修复视网膜损伤
[0042]
细胞受损或老化，细胞内粒线体的状态也会有所改变。由于功能良好的粒线体可提供充足的能量予细胞进行代谢活动，故细胞内粒线体的功能好坏可代表细胞的健康程度。海马生物能量测定仪借由测量细胞周围的环境变化来评估粒线体能量代谢，可在不接触且不伤害细胞的情况下通过侦测细胞周围的耗氧率以反应细胞整体的能量代谢。海马生物能量测定仪的原理与操作流程如下。
[0043]
首先，测定细胞在正常情况下粒线体的基础耗氧率(basal respiration)。此时的耗氧率源自于合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，atp)的需求以及克服质子漏(proton leak)的需求。
[0044]
接着，加入atp合成酶抑制剂以抑制粒线体产生atp。atp合成酶抑制剂可为寡霉素(oligomycin)。此时的耗氧率为克服质子漏所需的耗氧率。基础耗氧率减掉克服质子漏所需的耗氧率即为atp合成耗氧率(atp production)。
[0045]
接着，加入适当浓度的解偶联剂(uncoupler)，在不破坏粒线体内膜的电子传递链的情况下，让粒线体以极限状态空转以评估粒线体的最大耗氧率(maximal respiration)。解偶联剂可为羰基氰
‑4‑
(三氟甲氧)苯腙(carbonyl cyanide
‑4‑
(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，fccp)。
[0046]
最后，加入电子传递链抑制剂完全关闭粒线体的耗氧，以量测背景值。此时的耗氧率为非粒线体的耗氧率。电子传递链抑制剂可为鱼藤酮(rotenone)及抗霉素a(antimycin a)。
[0047]
综上所述，atp合成耗氧率可作为粒线体合成atp能力的评估指标。最大耗氧率可作为粒线体极限能力的评估指标。另外，媒合效率(coupling efficiency)定义为atp合成耗氧率除以粒线体基础耗氧率，可作为粒线体运作效率的评估指标。
[0048]
在本实验中，使用100μm的tbhp诱导arpe
‑
19细胞老化，并给予实施例的包含粒线体的组合物以改善视网膜损伤或老化。通过海马生物能量测定仪测量包含粒线体的组合物对视网膜的损伤或老化的改善效果。以下说明实验流程。
[0049]
实验流程与上述使用100μm的tbhp诱导细胞老化的实验流程大致相同。差异在于将arpe
‑
19细胞以每孔3
×
104个细胞的浓度于24孔盘培养16小时。接着，于24孔盘中加入tbhp，使其于孔盘中的浓度为100μm，再培养4小时。接着，再加入实施例一的包含粒线体的组合物培养20小时。培养完成后，使用磷酸盐缓冲液清洗arpe
‑
19细胞，并使用海马生物能量测定仪进行改善细胞损伤或老化的评估。
[0050]
实验结果如表3及图3至图5所示。图3为细胞中粒线体的atp合成耗氧率。图4为细胞中粒线体的最大耗氧率。图5为细胞中粒线体的媒合效率。表3显示各评估指标的耗氧率，单位为每分钟皮摩尔(pmole/min)。控制组为未经tbhp诱导老化的arpe
‑
19细胞。对照组为仅施以100μm的tbhp且未施以实施例的组合物。实验结果显示，施以100μm的tbhp会降低atp合成的耗氧率。施以实施例一的组合物则可提高atp合成耗氧率。再者，施以100μm的tbhp会降低粒线体的最大耗氧率。施以实施例一的组合物则可提高最大耗氧率，甚至变得较控制
组更佳。最后，媒合效率定义为atp合成耗氧率除以粒线体基础耗氧率，代表粒线体的综合运作效率。施以100μm的tbhp会降低粒线体的媒合效率。施以实施例一的组合物则可提高粒线体的媒合效率。
[0051]
〔表3〕
[0052][0053]
〔实验四〕改善视网膜功能、治疗视觉病变
[0054]
本实验使用8周大的史道二氏大鼠(sprague
‑
dawley rat，sd大鼠)作为评估视网膜损伤的动物模式。sd大鼠单只眼睛的视网膜面积平均为0.6平方毫米(0.6mm2)。
[0055]
正常光照周期：将sd大鼠饲养于正常光的环境中，光照周期为黑暗12小时/光照12小时，光照强度为120勒克斯(lux)，共进行七日。光损伤周期：将sd大鼠饲养于使用强光照射的光损伤的环境中，于sd大鼠的眼睛两侧放置荧光灯管(27瓦)，光照周期为黑暗12小时/光照12小时，光照强度为7000至10000勒克斯，共进行七日。
[0056]
视网膜电流图(electroretinography，erg)表示综合视网膜的不同细胞对光刺激的生物电反应。在临床上，视网膜电流图为诊断视网膜变性、营养不良、炎症、血管疾病、中毒性疾病等有效的评估模式。当视网膜受到光线刺激时，在视网膜电流图中，先出现的负波称为a波，a波由杆状细胞及锥状细胞产生；随后出现的正波称为b波，b波由缪勒氏细胞(muller cell)和双极细胞所产生。借由a波、b波到基准线的振幅以及a波、b波回到基准线所需的时间，可评估视网膜细胞的电流传递能力，电流传递能力可代表视网膜的损伤程度。
[0057]
在本实验中，利用强光照射诱导视网膜损伤，并给予实施例的包含粒线体的组合物，以改善视网膜功能并治疗视觉病变。通过视网膜电流图来评估包含粒线体的组合物对视网膜损伤的改善及治疗效果。以下说明实验流程。
[0058]
将sd大鼠分为五组，并以上述正常光照周期或光损伤周期进行饲养。a组，将sd大鼠以正常光照周期饲养于两周。b组，将sd大鼠先以光损伤周期饲养一周，再以正常光照周期饲养一周。c组，将sd大鼠先以光损伤周期饲养一周，再施以注射液并以正常光照周期饲养一周，注射液为5微升(μl)的生理食盐水。d组，将sd大鼠先以光损伤周期饲养一周，再施以实施例三的组成物并以正常光照周期饲养一周，实施例三的组成物包含15微克粒线体与5微升的生理食盐水，粒线体浓度为每毫升3000微克(μg/ml)。e组，将sd大鼠先以光损伤周期饲养一周，再施以实施例四的组成物并以正常光照周期饲养一周，实施例四的组成物包含40微克粒线体的组成物与5微升的生理食盐水，粒线体浓度为每毫升8000微克(μg/ml)。施以注射液或实施例的组成物时，使用30g
×
1/2针头在大鼠的角膜上滴加0.5％的丙美卡因盐酸盐(proparacaine hydrochloride)以进行局部麻醉，再于大鼠的视网膜下腔注射上述注射液。
[0059]
接下来，进行视网膜电流图量测。量测前，sd大鼠先经过大于8小时的黑暗适应，再以50(50；50mg/kg)麻醉sd大鼠。sd大鼠于测量全程皆处于麻醉状态。使用短效睫状肌麻痹剂1％托吡卡胺(tropicamide)与2.5％的苯肾上腺素(phenylephrine)使大鼠的瞳孔扩大。测量时，于sd大鼠的眼睛前2公分处放置一闪光灯(strobe)以发出闪光来刺激大鼠的视网膜。在闪光的频率为10khz时，以每2秒的时间间隔连续记录15次反应，并将这些反应放大并平均，以绘制视网膜电流图。
[0060]
实验结果如图6及表4所示。图6为sd大鼠的视网膜电流图。在图6中，光损伤大鼠(b组)相较于正常大鼠(a组)，a波及b波的振幅大幅减小，表示神经电流传导能力明显受损，代表杆状细胞、锥状细胞、缪勒氏细胞及双极细胞受损，也即是大鼠的视力受到损害。在施以注射液的c组、d组、e组的比较中，施以实施例三的d组与施以实施例四的e组相较于施以生理食盐水的c组，a波与b波的振幅明显增加，且粒线体浓度较高的e组的振幅恢复程度较大。表4为b波回到基准线(n)所需的时间(毫秒)。受损伤的b组的b波振幅最低，故回到基准线(n)的时间最短。施以包含粒线体的组成物的d组与e组的b波的振幅恢复，故回到基准线的时间增加。
[0061]
〔表4〕
[0062][0063]
综上所述，本发明实施例提供的包含粒线体的组合物，可改善视网膜细胞老化的情况、修复视网膜损伤、改善视网膜功能并治疗视觉病变。