一种具有可控的催化一氧化氮产生功能的心血管支架高聚物涂层、制备方法及应用与流程

1.本发明属于生物医用高分子材料技术领域，尤其涉及一种具有可控的催化一氧化氮产生功能的心血管支架高聚物涂层、制备方法及应用。


背景技术：

2.血管支架植入后，面临支架内再狭窄和晚期血栓的发生，是临床应用中迫切需要解决的问题。理想的血管支架表面应该能够抑制平滑肌细胞增生，促进正常的内皮细胞层再生，实现内皮化。no是重要的细胞信号因子，是维持心血管系统平衡的关键因素。大量的研究表明，no具有许多重要的生物学效应，包括抑制血小板激活和平滑肌增殖。通过调控机体对病灶区no的刺激作用以及支架材料原位催化no产生，抑制凝血和平滑肌增生以及促进内皮化，是制备新型功能性心血管支架的可行途径。
3.人体血液中含有多种内源性no供体s
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亚硝基硫醇，这些s
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亚硝基硫醇在体内谷胱甘肽过氧化物酶的催化作用下，可以释放no。然而，利用内源性s
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亚硝基硫醇体内自发反应释放no量效率低，无法达到理疗效果。同时，s
‑
亚硝基硫醇类物质半衰期非常短，难以在支架上装载实现稳定的长期持续释放。近年来，研究提出了在支架表面设计催化体系，实现加速no的原位催化释放，实现移植平滑肌增生和加速内皮化。申请号为201410394981.2的发明专利提出了一种具有诱导催化内源性no释放功能的抗凝血材料制备方法，在材料表面构建具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的结构，通过原位催化血液中的no供体持续释放no分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，保护血管内皮层。其具体方法为：将基底材料(包括金属材料和丝素蛋白、壳聚糖等高分子材料)放置于ph＝5
‑
12的tris
‑
buffer缓冲体系，然后向体系中加入具有邻酚结构的化合物和具有二硫键或二硒键的两端含胺基或巯基的化合物，在10
‑
30℃下，反应1
‑
24h。该方法需要含邻酚结构的化合物和具有二硫键或二硒键的化合物的共同作用，反应体系复杂。
4.过渡金属离子(cu
2
、hg
2
、fe
2
、ag

等)能够催化s
‑
亚硝基硫醇供体释放no。cu
2
由于毒性小、具有良好的抗菌性能，备受关注。然而，目前负载铜离子的方法比较复杂，涉及多种化学试剂的使用以及复杂的涂层工艺，且难以精确控制金属离子的负载量和调控涂层的厚度和降解速率。比如：申请号为201510020342.4的发明专利提出了一种具有一氧化氮(no)催化活性的涂层的制备方法。将具有一氧化氮催化活性的含硒化合物、含硫化合物、可溶性铜盐与具有邻酚结构的化合物、黄酮类化合物、黄酮醇类化合物或双氢黄酮化合物共混于缓冲溶液中聚合形成涂层，实现催化no释放。申请号为201410394483.8的发明专利公开了一种具有可控一氧化氮催化释放的含有铜离子与多酚配位物的螯合物材料的制备方法，将可溶性金属盐、可溶性铜盐与具有邻酚结构的化合物组成的混合溶液，在ph＝2
‑
14的缓冲体系下反应，经离心、清洗、透析和冷冻干燥得到具有一氧化氮催化功能的铜离子与多酚配位物的螯合物材料，且其主要通过额外添加可溶性金属盐调控多酚对铜离子的螯合量。申请号为201410393778的发明专利公开了一种具有可控一氧化氮催化释放的铜离子与
多酚配位物的螯合物涂层的制备方法，将改性目标活器械浸泡于可溶性金属盐、可溶性铜盐与具有邻酚结构的化合物组成的混合溶液，在ph＝2
‑
14的缓冲体系下反应沉积一层具有一氧化氮催化功能的铜离子与多酚配位物的螯合物涂层。申请号为201410394955.x的发明专利公开了一种铜离子介导的具有原位催化no释放功能的抗凝血涂层制备方法，将基底材料放置于ph＝4
‑
7的tris
‑
buffer缓冲体系，然后向体系中加入具有邻酚结构的化合物和含有多氨基或巯基的化合物，在10
‑
30℃下，反应0.5
‑
24h。
5.上述方法的基本原理是将多酚类物质与壳聚糖等多氨基或巯基的化合物交联负载铜及其离子，制备负载铜的涂层或者螯合物材料需要含邻酚结构的化合物的共同作用，反应体系复杂。而且，现有制备工艺中，涂层的厚度不可控、难以实现进一步的载药，以及降解速率和力学性能的调控。同时，大部分技术涉及的铜离子结合量不可控，过多的铜离子会造成细胞毒性强。


技术实现要素：

6.鉴于现有技术的以上不足，为了实现构建一种简单有效而且能够精确控制负载cu
2
量的生物相容性涂层，本发明以六氟异丙醇为溶剂制备丝素蛋白和壳聚糖共混溶液，进行喷涂涂层，涂层浸泡于二价铜盐，通过铜离子与生物相容性良好的丝素蛋白和壳聚糖的稳定结合实现铜离子的负载。通过调控丝素蛋白和和壳聚糖的共混比，就可以实现铜离子的负载量精确调控的目的，同时可通过多糖和蛋白质的共混调控涂层的降解速率和力学性能。
7.本发明是这样实现的，一种可调控负载铜离子量的材料，由丝素蛋白和壳聚糖以及铜离子组成，所述材料通过调整丝素蛋白和壳聚糖的比例调控负载铜离子量。
8.调控材料负载铜离子量的方法，所述材料包含丝素蛋白和壳聚糖，通过调整丝素蛋白和壳聚糖的比例调控负载铜离子量。
9.本发明还提供了如上述的材料或方法在制备可调控一氧化氮产生能力的材料中的应用。
10.本发明还提供了一种可调控一氧化氮产生能力的材料，将包含丝素蛋白和壳聚糖的溶液喷涂到基底表面，干燥后形成涂层；涂层或附着有涂层的基底浸泡于铜盐中，得到负载铜离子的可调控一氧化氮产生能力的材料。
11.进一步地，涂层或附着有涂层的基底先浸泡于醇液中，之后再浸泡于铜盐中。
12.进一步地，所述醇液包括甲醇和/或乙醇；所述铜盐为二价可溶性铜盐，包括氯化铜、溴化铜、碘化铜、硫酸铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。
13.进一步地，所述基底包括支架。
14.进一步地，所述支架包括不锈钢、合金以及可降解支架中的任一种。
15.本发明还提供了调控如上述的材料一氧化氮产生能力的方法，包括：通过调整丝素蛋白和壳聚糖的比例调控负载铜离子量，从而调控一氧化氮产生能力。
16.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
17.(1)选用的丝素蛋白和壳聚糖都是生物相容性优异的可降解高聚物，涂层最终能够被机体降解吸收和代谢，通过多糖和蛋白质的共混可调控涂层的降解速率和力学性能，
涂层也可以通过共混的方法实现药物加载：本发明是通过溶剂溶解壳聚糖和丝素蛋白，可以在溶剂里添加多种药物然后进行，这是现有的商业化涂层的方法。
18.(2)通过丝素蛋白和壳聚糖对铜离子的螯合能力，实现铜离子的稳定负载，方法简单可靠。
19.(3)创造性地利用了丝素蛋白和壳聚糖对二价铜离子的螯合能力的差异，通过改变丝素蛋白和壳聚糖的共混比就可以实现负载铜离子量的大范围调控，方法简单可控。
20.(4)通过有效调控负载铜离子的量可以精确调控no释放的产生能力，进而控制no的释放量和释放周期，同时避免涂层的细胞毒性过大。
21.(5)本发明提出的no催化活性涂层的合成步骤简单，无需多酚等化学交联剂，无需复杂的反应和步骤，简单可控，制备成本低。
附图说明
22.图1是制备的不同共混比丝素蛋白(sf)和壳聚糖膜(cs)对cu
2
的结合能力的edx测试结果；
23.图2是制备的不同cu
2
负载量对催化snap供体释放no能力的测试结果。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
26.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
27.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
28.本发明披露了一种具有可控的催化一氧化氮产生功能的心血管支架高聚物涂层、制备方法及应用。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
29.实施例
30.本技术中涉及的材料包括：
31.丝素蛋白溶液：将再生丝素蛋白溶解于六氟异丙醇溶液，搅拌至完全溶解，形成质量分数为0.5～10％的丝素蛋白溶液。本技术中再生丝素蛋白平均分子量一般为10kda以
上，如果过低，材料成膜后力学性能不足且降解过快。
32.壳聚糖溶液：将壳聚糖溶解于六氟异丙醇溶液，搅拌至完全溶解，形成质量分数为0.5～10％的壳聚糖溶液。壳聚糖脱乙酰度为75％以上(太低溶解困难，而且结合铜离子会减少)，本发明本实施例中使用的壳聚糖脱乙酰度为85％。
33.将丝素蛋白溶液与壳聚糖溶液按照一定的比例共混，搅拌形成丝素蛋白/壳聚糖共混溶液。丝素蛋白/壳聚糖共混溶液的浓度为0.5～10％(共混之后的总质量)，本发明本实施例中具体为4％。本发明本实施例中目前进行了丝素蛋白：壳聚糖的比例分别为25：75、50：50、75：25、85：15以及95：5的实验。
34.将丝素蛋白/壳聚糖共混溶液通过超声雾化喷涂装置喷涂到支架内侧表面，干燥之后形成可降解的高分子涂层。支架可以为本领域的所有常规支架，比如不锈钢、合金或者可降解心血管支架，涂层与支架材料具有非常牢固的结合力。
35.将上述涂层支架用50～100％乙醇或者甲醇溶液浸泡(诱导丝素蛋白结晶，增加水稳定性)10～120min后，涂层支架浸泡到铜盐溶液中，与铜离子发生螯合作用。将支架用去离子水漂洗之后干燥，获得负载铜离子的涂层。本发明中铜盐为可溶性铜盐，包括氯化铜、溴化铜、碘化铜、硫酸铜、硝酸铜、碳酸铜、柠檬酸铜、酒石酸铜、丙酸铜和醋酸铜中的至少一种。优选的，可溶性铜盐的浓度为0.01～1.0m，浸泡时间为1min～10h。本发明本实施例中使用的是0.1m的cuso4溶液浸泡1h，其他实施例可根据实际情况进行调整。
36.本发明中使用edx检测表面cu
2
含量。并以snap为供体测试no释放。使用no试剂盒检测no浓度。
37.实验结果如图1和图2，随着壳聚糖比例的增加，铜离子含量显著增加(对照样为纯的丝素蛋白不加壳聚糖的样品，当仅使用壳聚糖时，铜离子含量低于25：75条件下的效果)，铜离子的负载量可以在大范围内调节。将浸泡1h的不同比例的样品浸泡于65μm的s
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亚硝基
‑
n
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乙酰基
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dl
‑
青霉胺(snap)溶液中，然后用no检测试剂盒检测no的释放量。如图2所示，随着壳聚糖的增加，铜离子含量增加，no的释放量显著增加，可以实现no释放在大范围内调节。
38.本发明方法具有操作简单、反应条件温和，制备的涂层结合铜离子量精确可控，催化一氧化氮效率可以实现大范围调节的优势。采用本发明方法制得的涂层具有优异的黏附性，与支架表面结合能力较强，并通过原位催化血液中的no供体持续释放no分子，抑制血小板的激活和聚集，抑制平滑肌细胞增殖，促进内皮化。
39.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。