一种冻干粉及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种冻干粉及其应用。


背景技术：

2.内镜黏膜下剥离术(esd)是近年来常用的一种治疗早期胃癌的方法，其在整块切除率和复发率方面效果较好。然而，由于病变的切除可能深及粘膜下层，术中及术后常发生出血、穿孔等并发症。而壳聚糖温敏水凝胶体系因具有良好的细胞相容性、在酸性环境下对细胞具有明显的保护作用，作为术中生物材料具有良好的性能，已经被证实是一种用于esd手术中减少并发症发生的有效策略。
3.然而，壳聚糖温敏水凝胶的性能易受温度的影响(温度升高容易结成凝胶)，因此必须在冷藏条件下保存。在运输和储存过程中，必须全程监控温度，因此相关成本很高。此外，有研究报道称，壳聚糖温敏水凝胶即使在冷藏条件下(4℃)也缺乏长期稳定性，水凝胶的前体溶液经过一段时间后也会形成凝胶或发生改性。另一方面，在esd手术前临时制备水凝胶，则会给整个手术操作带来复杂性，并给临床医生带来新的问题。这些问题阻碍了这种术中生物材料的大规模生产和应用。


技术实现要素：

4.基于现有技术中，壳聚糖温敏水凝胶存在的上述问题，本发明致力于开发出贮存稳定、使用方便、临床应用有效的术中生物材料。因此，本发明提供了一种冻干粉及其应用，以有效解决现有esd中使用的生物材料存在运输、存储的问题，以及使用时需要临时制备，给整个手术操作带来复杂性的问题。
5.第一方面，本发明提供了一种冻干粉，所述冻干粉为壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉、乳糖酸改性的壳聚糖/壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉或乳糖酸改性的壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉。
6.优选地，所述冻干粉与去离子水混合后形成冻干粉水凝胶前体溶液，所述冻干粉水凝胶前体溶液中，所述去离子水与所述冻干粉的比重为1：20
‑
1： 100。
7.优选地，所述冻干粉水凝胶前体溶液能在37℃条件下形成水凝胶，所述水凝胶具有多孔网络、层状结构。
8.优选地，当所述冻干粉为壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，所述冻干粉的制备方法包括：
9.步骤1：将壳聚糖溶解在质量浓度为1％的乙酸溶液中，室温搅拌至完全溶解，制得质量浓度为3.33％的溶液a，于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
10.步骤2：将上述步骤1制备好的溶液a与溶液b，在冰水浴条件下混合，配置成第一组冻干粉前体溶液；
11.步骤3：对上述步骤2制备得到的第一组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
12.优选地，在所述步骤2中，所述第一组冻干粉前体溶液由15ml溶液a 与10ml溶液b混合制得；所述第一组冻干粉前体溶液中，所述溶液a的质量浓度为2％，所述溶液b的质量浓度为6％；在所述步骤3中，所述预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；所述冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
13.优选地，当所述冻干粉为乳糖酸改性的壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，所述冻干粉的制备方法包括：
14.步骤1’：将乳糖酸改性的壳聚糖溶解在去离子水中，制得质量浓度为 3.33％的溶液c；于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
15.步骤2’：将上述步骤1’制备好的溶液c与溶液b，在冰水浴条件下混合，配置成第二组冻干粉前体溶液；
16.步骤3’：对上述步骤2’制备得到的第二组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
17.优选地，在所述步骤2’中，所述第二组冻干粉前体溶液由15ml溶液c 与10ml溶液b混合制得；所述第二组冻干粉前体溶液中，所述溶液c的质量浓度为2％，所述溶液b的质量浓度为6％；在所述步骤3’中，所述预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；所述冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
18.优选地，当所述冻干粉为乳糖酸改性的壳聚糖/壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，所述冻干粉的制备方法包括：
19.步骤1”：将壳聚糖溶解在质量浓度为乙酸溶液中，室温搅拌至完全溶解，制得质量浓度为3.33％的溶液a，于4℃条件下保存；将乳糖酸改性的壳聚糖溶解在去离子水中，制得质量浓度为3.33％的溶液c。于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml 的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
20.步骤2”：将上述步骤1”制备好的溶液a、溶液b与溶液c，在冰水浴条件下混合，配置成第三组冻干粉前体溶液；
21.步骤3”：对上述步骤2”制备得到的第三组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
22.优选地，在所述步骤2”中，所述第三组冻干粉前体溶液由6ml溶液a、 9ml溶液c和10ml溶液b混合制得；所述第三组冻干粉前体溶液中，所述溶液a/溶液c的质量浓度为2％，所述溶液b的质量浓度为6％；在所述步骤3”中，所述预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；所述冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
23.第二方面，本发明提供了一种冻干粉的应用，具体为：将上述第一方面所述的冻干粉，作为一种生物材料应用于内镜下粘膜剥离术。
24.与现有技术相比，本发明包括以下优点：
25.(1)本发明提供的冻干粉可以为壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉、乳糖酸改性的壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉或乳糖酸改性的壳聚糖/壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉，可在
去离子水的作用下重新构建成可用于esd术中的水凝胶。并且，该水凝胶由本发明提供的冻干粉与去离子水配置的冻干粉水凝胶前体溶液在35～38℃条件下形成的，该水凝胶注射性能良好，具有较好的力学强度和组织粘附性，且该水凝胶具有良好的细胞相容性，在酸性环境中对细胞具有明显的保护作用。因此，由本发明提供的冻干粉制成的冻干粉水凝胶，在作为esd的术中生物材料时，仍具有良好的理化和生物特性。
26.(2)本发明提供的冻干粉，采用的原料包括壳聚糖、乳糖酸改性壳聚糖以及甘油磷酸钠，其中，乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为2％，甘油磷酸钠的浓度为6％，以该浓度制备的冻干粉配置成的冻干粉水凝胶具有无细胞毒性的特点，不抑制细胞增殖，在酸性环境下对细胞有更明显的保护作用。
27.(3)本发明提供的冻干粉，因其为固体粉末，具有较好的长期稳定性，可在常温条件下进行保存。因此，在运输和存储过程中不再需要全程控温，降低了相关运输和保存成本。并且，使用时，只需直接将粉末与去离子水混合即可制备出相应的水凝胶，因此使用非常方便，解决了在esd手术前，医生需要根据原料的不同配比现场配置水凝胶前体溶液的麻烦。
附图说明
28.图1示出了本技术实施例的各组冻干粉水凝胶前体溶液在37℃下的储能模量(g’)和损耗模量(g”)随时间的变化；
29.图2示出了本技术实施例中各组冻干粉的红外光谱图；
30.图3示出了本技术实施例中各组冻干粉的微观结构图；
31.图4示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶的成胶时间；
32.图5示出了本发明实施例中各组冻干粉水凝胶的ph值；
33.图6示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在频率为1hz、2hz、5hz 时的储能模量值；
34.图7示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在含胃蛋白酶的酸性pbs 溶液中的降解率；
35.图8示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶的微观结构；
36.图9示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶前体溶液在4℃时的粘度；
37.图10示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶前体溶液在4℃时的注射力；
38.图11示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在冲洗后粘附于组织表面的水凝胶残留百分比；
39.图12示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在组织表面凝胶化后对组织的粘附力；
40.图13示出了本技术实施例中l929细胞在各组冻干粉水凝胶提取液中培养24h后l929细胞的相对增殖率；
41.图14示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶中的细胞形态；
42.图15示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶表面的增殖；
43.图16示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在酸性条件下在各组冻干粉水凝胶表面的相对增殖率；
44.图17示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶表面的粘附能力。
具体实施方式
45.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
46.实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
47.首先，发明人发现，物体在冻干状态下，化学或物理降解反应会被抑制或充分减速，从而提高了长期稳定性。冻干粉不仅具有较好的稳定性，而且在运输、储存和使用过程中易于操作。然而，将水凝胶的前体溶液冻干变成粉末也可能会带来一些问题：冷冻干燥过程会影响壳聚糖温敏水凝胶的机械强度和注射性等关键性能，而这些性能对esd术非常重要。水凝胶的可注射性与水凝胶前体溶液的均匀性有关。有报道称，将乳糖片段引入壳聚糖分子链可以显著改善中性ph下的水溶性。乳酸(la)具有抗氧化、生物降解、生物相容性和螯合性能，这使得它在潜在的医药应用中具有吸引力。因此，通过引入乳糖，延长壳聚糖分子链，增加h键的数量，形成h键网络，可以提高壳聚糖水凝胶的机械强度。
48.本研究采用冻干法将壳聚糖水凝胶制备为冻干粉，并在冻干粉水凝胶的基础上重新构建了可注射温敏水凝胶。
49.第一方面，本发明实施例提供一种冻干粉，冻干粉可以为壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉、乳糖酸改性的壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉或乳糖酸改性的壳聚糖/壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉。
50.本发明实施例中，优选地，该冻干粉与去离子水混合后形成冻干粉水凝胶前体溶液，冻干粉水凝胶前体溶液中，去离子水与冻干粉的比重为1：20
‑
1： 100。
51.本发明实施例中，优选地，该冻干粉水凝胶前体溶液能在37℃条件下形成冻干粉水凝胶，该冻干粉水凝胶具有多孔网络、层状结构。
52.本发明实施例中，优选地，当该冻干粉为壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，其制备方法包括：
53.步骤1：将壳聚糖溶解在质量浓度为乙酸溶液中，室温搅拌至完全溶解，制得质量浓度为3.33％的溶液a，于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
54.步骤2：将上述步骤1制备好的溶液a与溶液b，在冰水浴条件下混合，配置成第一组冻干粉前体溶液；
55.步骤3：对上述步骤2制备得到的第一组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
56.本发明实施例中，优选地，在步骤2中，第一组冻干粉前体溶液由15ml 溶液a与10ml溶液b混合制得；第一组冻干粉前体溶液中，溶液a的质量浓度为2％，溶液b的质量浓度
为6％；在步骤3中，预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
57.本发明实施例中，优选地，当该冻干粉为乳糖酸改性的壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，冻干粉的制备方法包括：
58.步骤1’：将乳糖酸改性的壳聚糖溶解在去离子水中，制得质量浓度为 3.33％的溶液c；于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
59.具体实施时，获得乳糖酸改性的壳聚糖的过程如下：首先，分别制备了 2％(w/v)壳聚糖溶液和2.22％(w/v)乳糖酸溶液；然后，在2.22％乳糖酸溶液中加入eds和nhs，并将ph调至4
‑
6之间的任意值，进行酰胺反应，实现对乳糖酸中羧基的活化；最后，将活化后的乳糖酸溶液与2％壳聚糖溶液进行混合，并在室温下反应24小时，反应结束后，向该反应体系中加入乙醇，使该反应体系中的物料沉淀，沉淀时间为24h，过滤得到沉淀物，再将沉淀物重新溶解在去离子水中，得到溶解体系，对溶解体系进行透析48h，并对透析后的溶解体系进行冷冻、干燥，则得到类似海绵的乳糖酸改性壳聚糖 (csla)。
60.步骤2’：将上述步骤1’制备好的溶液c与溶液b，在冰水浴条件下混合，配置成第二组冻干粉前体溶液；
61.步骤3’：对上述步骤2’制备得到的第二组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
62.本发明实施例中，优选地，在步骤2’中，第二组冻干粉前体溶液由15ml 溶液c与10ml溶液b混合制得；第二组冻干粉前体溶液中，溶液c的质量浓度为2％，溶液b的质量浓度为6％；在步骤3’中，预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
63.本发明实施例中，优选地，当该冻干粉为乳糖酸改性的壳聚糖/壳聚糖—β
‑
甘油磷酸钠冻干粉时，冻干粉的制备方法包括：
64.步骤1”：将壳聚糖溶解在质量浓度为乙酸溶液中，室温搅拌至完全溶解，制得质量浓度为3.33％的溶液a，于4℃条件下保存；将乳糖酸改性的壳聚糖溶解在去离子水中，制得质量浓度为3.33％的溶液c。于4℃条件下保存；将β
‑
甘油磷酸钠溶解在碳酸氢钠和碳酸钠缓冲溶液中得到0.15g/ml 的溶液b；其中，碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml，于4℃条件下保存；
65.步骤2”：将上述步骤1”制备好的溶液a、溶液b与溶液c，在冰水浴条件下混合，配置成第三组冻干粉前体溶液；
66.步骤3”：对上述步骤2”制备得到的第三组冻干粉前体溶液进行预冷冻后，移至冻干机中冷冻干燥，研磨、筛分得到冻干粉。
67.本发明实施例中，优选地，在步骤2”中，第三组冻干粉前体溶液由6ml 溶液a、9ml溶液c和10ml溶液b混合制得；第三组冻干粉前体溶液中，溶液a/溶液c的质量浓度为2％，溶液b的质量浓度为6％；在步骤3”中，预冷冻的条件包括：温度为
‑
18℃，时间为8
‑
10h；冻干机中冷冻干燥的时间为48h。
68.下面通过实施例对上述冻干粉制备方法进行详细阐述。
69.实施例1：
70.首先，壳聚糖(cs)(分子量为180kda，脱乙酰度84％)，β
‑
甘油磷酸钠(gp)(c3h7na2o6p
·5h2o)、二乙酸荧光素(fda)、碘化丙啶(pi)和胃蛋白酶(来源于猪胃黏膜)购自美国sigma
‑
aldrich公司。乳糖酸(la) (c
12
h
22
o
12
),n
‑
羟基琥珀酰亚胺c4h5no3(nhs)、碳二亚胺c8h
17
n3·
hcl (edc)购自上海阿拉丁生化技术有限公司。dmem高糖培养基和rpmi
‑
1640 培养基购自美国thermo fisher scientific corporation公司。l929细胞(小鼠成纤维细胞)和ges
‑
1细胞(人胃上皮细胞)购自中国科学院昆明细胞库。所有其他使用的化学品都是试剂级的，使用时没有进一步纯化。
71.步骤1：配置三种溶液：
72.溶液a:将壳聚糖(cs)溶解在质量浓度为1％乙酸溶液中，室温搅拌至完全溶解，所得溶液质量浓度为3.33％，于4℃条件下保存；
73.溶液b:配置碳酸氢钠浓度为0.1g/ml，碳酸钠浓度为5mg/ml的缓冲溶液，将β
‑
甘油磷酸钠溶解在缓冲溶液中，得到β
‑
甘油磷酸钠(gp)的质量浓度为0.15g/ml的溶液；于4℃条件下保存；
74.溶液c:将乳糖酸改性的壳聚糖(csla)溶解在去离子水中，制得质量浓度为3.33％的溶液c；于4℃条件下保存；
75.步骤2：配置冻干粉前体溶液
76.将配制好的3.33％(w/v)壳聚糖溶液、3.33％(w/v)乳糖酸改性壳聚糖溶液以及浓度为0.15g/ml的β
‑
甘油磷酸钠溶液，按照下表给出的体积在冰水浴条件下进行混合，配置成不同组分的冻干粉前体溶液。
[0077][0078]
按表1制备得到的3组水凝胶前体溶液中，cs、csla/cs和csla的终浓度各为2％，gp的终浓度为6％。各组在冰浴条件下制备，混合搅拌至完全混合。
[0079]
步骤3：冻干
[0080]
将上述步骤2制备得到的3组冻干粉前体溶液置于培养皿中，放在
‑
20℃冰箱中冷藏8
‑
10过夜，然后移至冻干机中冷冻干燥48小时，最后将冻干的凝胶研磨成冻干粉，用100目的筛子筛一次。将100mg的水凝胶冻干粉加入 5ml的eppendorf(ep)管中，加入2ml去离子水，在冰浴条件下将水和冻干粉混合均匀，4℃保存。以冻干粉为基础的水凝胶定义为冻干粉水凝胶。
[0081]
步骤4：凝胶冻干粉的表征
[0082]
(1)温敏成胶特性
[0083]
基于凝胶冻干粉的水凝胶可在37℃(生理温度)下形成凝胶，这是水凝胶能否作为
esd术中生物材料的关键。将冻干粉水凝胶前体溶液加入ep管，置于37℃培养箱中。一段时间后，可以观察溶液的流动，以确定溶液是否凝结。用旋转流变仪(奥地利anto paar mcr
‑
302)测量制备的水凝胶的流变性能，采用振荡时间扫描，剪切应变为1％，频率为1hz，扫描时间为320s，温度一直保持在37℃。测试几何尺寸为直径40mm，间隙1.0mm。所有的实验都重复了三次。
[0084]
本实施例中，图1示出了本技术实施例的各组冻干粉水凝胶前体溶液在 37℃下的储能模量(g’)和损耗模量(g”)随时间的变化。如图1所示，3组冻干粉水凝胶的储能模量(g’)总是大于其损耗模量(g”)，这也证实了本技术3 组冻干粉水凝胶前体溶液，在37℃下能形成凝胶，即，冻干粉水凝胶保持了原有水凝胶的温敏特性。
[0085]
在此，需要指出的是，本实施步骤中，凝胶温度设置的为37℃，并由该步骤的实验结果可知，该凝胶在37℃下即可自动形成凝胶。而为了进一步证实本实施例制备的冻干粉的温敏成胶特性，发明人继续在35℃、36℃以及 38℃下，分别进行了如上述步骤4(1)的相同实验操作，结果显示，本实例制备的三种冻干粉，当制备成各自的冻干粉水凝胶前体溶液时，也均能分别在35℃、36℃以及38℃下，形成凝胶。由此可知，本实施例制备的三种冻干粉在配置成冻干粉水凝胶前体溶液时，具有良好的温敏成胶特性。
[0086]
(2)傅里叶变换红外光谱(ftir)分析
[0087]
分别称取1mg的cs
‑
gp、csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp冻干粉样品，将其与50mg的kbr混合，再研磨成粉，然后压制成片，在室温范围4000
‑
400cm
‑1范围内，使用ftir光谱仪(nicolet ftir 6700,usa)上的kbr磁盘记录ftir 光谱。
[0088]
图2示出了本技术实施例中各组冻干粉的红外光谱图。如图3所示， 3400cm
‑1处的峰对应于cs和csla中的游离羟基。1660cm
‑1和1290cm
‑1处的峰分别对应于酰胺i和酰胺iii，随着csla浓度的增加，峰值在1290cm
‑1处强度增强。
[0089]
(3)冻干粉的微观形貌
[0090]
用离子溅射法分别在cs
‑
gp、csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp冻干粉样品表面镀上一层超薄的金，然后用扫描电子显微镜(sem，日本日立s
‑
4800)观察冻干粉的微观结构。
[0091]
图3示出了本技术实施例中各组冻干粉的微观结构图。如图3所示，三组冻干粉的微观结构不同。cs
‑
gp冻干水凝胶粉末呈颗粒状，粒径约为 3～6μm。添加了csla的水凝胶冻干粉更加均匀，具有规则的针状结构。 csla
‑
gp水凝胶冻干粉末的针状结构更致密、更薄。
[0092]
步骤5：冻干粉水凝胶的表征
[0093]
(1)成胶时间和ph值
[0094]
冰水浴条件下，分别将cs
‑
gp、csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp冻干粉配置成冻干粉水凝胶前体溶液，同时使用现配水凝胶做对照组，采用倒置试管法测定水凝胶的成胶时间。将2ml冻干粉配置的水凝胶前体溶液加入5ml ep 管中，迅速转移到37℃培养箱中。每隔1分钟观察每组试管，评估试管中溶液的颜色变化，同时倒置试管观察溶液的流动，以确定溶液是否已成胶。记录最终的凝胶时间，所有实验重复5次。
[0095]
使用ph计(bph
‑
303)测量3种冻干粉水凝胶的ph值。实验都重复了三次。
[0096]
图4示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶的成胶时间。如图4所示， 6个实验组的成胶时间都在5min以内，冻干粉水凝胶的凝胶时间比对应的现配水凝胶的成胶时间要长。
[0097]
图5示出了本发明实施例中各组冻干粉水凝胶的ph值。从图5可以看出，6个实验组的ph值均在7左右，接近中性。这说明冷冻干燥过程对ph 值影响不大。其中，cs
‑
gp和csla/cs
‑
gp冻干粉水凝胶的ph略高于现配水凝胶，csla
‑
gp水凝胶冻干前后ph值无显著差异。
[0098]
(2)动态力学分析(dma)
[0099]
采用动态力学分析仪(dma，taq800，usa)在室温下表征了水凝胶采用动态力学分析仪(dma，taq800，usa)在室温下表征了水凝胶的存储模量。水凝胶在磷酸盐缓冲盐水溶液(pbs)中达到膨胀平衡，在振幅为80mm，预应力为1mn，频率为1hz、2hz、5hz的情况下测量存储模量。测量三个平行样本以求得平均值。
[0100]
图6示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在频率为1hz、2hz、5hz 时的储能模量值。结果如图所示。在三个不同的频率下，基于cs
‑
gp、 csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp水凝胶冻干粉的存储模量比相应的现配水凝胶均有所增加，说明冻干粉水凝胶的强度增强。
[0101]
(3)降解率
[0102]
为了表征水凝胶在胃酸环境下的降解性，称重冻干粉水凝胶样品为了表征水凝胶在胃酸环境下的降解性，称重冻干粉水凝胶样品(w
o
)，然后在37℃下，置于ph值为4的含有胃蛋白酶(sigma
‑
aldrich, usa)的5ml pbs溶液中孵育。在预先设定的时间点取出水凝胶并称重。测量三种平行的水凝胶以获得平均值。最后，根据式(1)计算各样品的降解速率:
[0103]
降解率％＝[(w0‑
w
d
)/w0]
×
100％
[0104]
w
d
＝降解后样品的质量。
[0105]
w0＝初始样品的质量。
[0106]
图7示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在含胃蛋白酶的酸性pbs 溶液中的降解率。如图7所示，在前三天，冻干粉水凝胶保持在原始状态的 70％，到第五天，水凝胶的降解率下降了一半左右。一周后，降解率约为80％。冻干粉水凝胶的降解速率高于三种现配水凝胶。
[0107]
(4)冻干粉水凝胶的微观形貌
[0108]
为了了解冷冻干燥过程对壳聚糖水凝胶微观结构的影响，通过扫描电镜观察各组水凝胶的截面微观结构。分别取100μlcs
‑
gp、csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp冻干粉配置成冻干粉水凝胶前体溶液加入到直径为8mm，高度 2mm的硅胶模具中，放置到37℃的恒温箱中30min，使冻干粉水凝胶前体溶液样品完全成胶。取出各组水凝胶样品，利用液氮固定形状后用镊子掰开，然后放入冻干机中冷冻干燥48h，去除样品，喷金制样，用扫描电镜观察水凝胶截面的微观结构。
[0109]
图8示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶微观结构。如图8所示。 6组水凝胶均具有多孔网络、层状结构。cs
‑
gp、csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp 水凝胶经过冻干和研磨后，冻干粉水凝胶基本上保持了原来的结构。
[0110]
(5)低温流动性及注射可行性
[0111]
esd术中生物材料是通过导管注射的。因此，有必要评估其低温流动性和注射的可行性。冻干粉水凝胶前体溶液在4℃时的粘度表明了水凝胶的低温流动性。因此，用旋转流变仪(奥地利anto paar mcr
‑
302)在4℃下测量各组冻干粉配置的冻干粉水凝胶前体溶液的粘度，剪切速率和剪切应力保持在恒定值。每个样品要检测三次。
[0112]
利用成都市第三人民医院提供的内窥镜注射针(25号针头(0.23mm)，通道直径为2.8mm，长度为180cm)和内镜喷洒管(直径1.8mm，通道直径为2.2mm，长度为180cm)研究了水凝胶前体溶液注射的可行性。同时，现配水凝胶样品在4℃冰箱中保存10天为对照。然后，使用机电万能试验机 (shimadzu autograph ags
‑
x，日本)对水凝胶前体溶液的注射推挤力进行评估，推挤速度为30mm/min，最大载荷为500n。直径7毫米，长度146毫米，装有一个内径5毫米，长度75毫米的套管。并用生理盐水作为对照组，每个样品3个重复测定。
[0113]
图9示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶前体溶液在4℃时的粘度。如图9所示，cs
‑
gp、csla/cs
‑
gp、csla
‑
gp冻干粉水凝胶前体溶液在4℃时相对于其现配水凝胶的粘度显著下降。这说明冻干粉水凝胶前体溶液的低温流动性明显提高。
[0114]
图10示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶前体溶液注射力。从图 10可以看出，与相应的现配水凝胶相比，冻干粉水凝胶前体溶液的注射力明显降低。三种冻干粉水凝胶的注射力与生理盐水相近。
[0115]
(6)冻干粉水凝胶的组织粘附性
[0116]
用组织存留法测定制备的水凝胶的组织黏附性。从屠宰场购买3个新鲜猪胃，用0.1mol/l盐酸溶液冲洗。剪取一定面积的猪胃组织(3cm
×
6cm)，用滤纸吸收组织表面水分，固定在一个自制的斜槽上。然后从猪胃组织的上缘缓慢均匀倒入2ml(v1)水凝胶溶液。5min后，用10ml(v2)蒸馏水以1ml/s 的速度冲洗组织，收集液体并测量体积(v3)。最后，计算各组水凝胶样品粘附在胃组织的百分比:
[0117]
粘附率％＝[(v1 v2‑
v3)/(v1 v2)]
×
100％
[0118]
简单地说，剪取一定面积的猪胃组织，用滤纸吸收组织表面水分，然后在猪胃组织上铺上一层高1mm面积为30
×
20mm2的水凝胶前体溶液，另一块组织轻轻压在水凝胶表面，然后置于37℃培养箱中30分钟，确保完全成胶。拉力计从上组织的一端拉开，记录拉开时所需要的最大的力。每组水凝胶测三个平行样。
[0119]
所有动物受试者均按照四川大学《实验动物护理与使用指南》和 iso10993
‑
2:2006标准使用。
[0120]
水凝胶的组织粘附性是通过测定冲洗后粘附组织表面的水凝胶量来表征的。图11示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在冲洗后粘附于组织表面的水凝胶残留百分比。从图11的结果可以看出，六组水凝胶都具有一定的组织粘连性。三种现配的水凝胶在组织粘附性比相应的冻干粉水凝胶略强。
[0121]
图12示出了本技术实施例中各组冻干粉水凝胶在组织表面凝胶化后对组织的粘附力。图12为水凝胶在组织表面的粘附力测试结果。cs
‑
gp水凝胶与cs
‑
gp冻干粉水凝胶的组织粘附力无显著差异。总的来说，csla/cs
‑
gp 和csla
‑
gp水凝胶的组织粘附力略大于其冻干粉水凝胶。
[0122]
步骤6：生物学实验
[0123]
(1)细胞毒性测试
[0124]
cck
‑
8实验评价水凝胶对小鼠成纤维细胞(l929细胞)的细胞毒性。将冻干粉水凝胶在浸出浓度为0.1g/ml的dmem高糖完全培养基中浸出24h，浸提液在完全培养基中稀释至50％和25％。按20000cells/ml的细胞浓度 l929细胞在提取液中培养24小时，然后将培养液取出，用新鲜的无血清培养基(含10％cck
‑
8)孵育3小时(37℃，5％co2)。最后，用酶标仪
(multiskanfc,usa)在450nm处测量吸光度。
[0125]
图13示出了本技术实施例中l929细胞在各组冻干粉水凝胶提取液中培养24h后l929细胞的相对增殖率。如图13所示，六组检测的水凝胶，即使提取液浓度为100％，l929细胞的相对增殖率也在70％以上。根据 gb/t16886.5
‑
2017(医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验)，这几组水凝胶无毒。
[0126]
(2)水凝胶三维包裹细胞的增殖和形态
[0127]
用荧光素二乙酸/碘化丙啶(fda/pi)对水凝胶三维包裹的细胞进行活死染色，用激光共聚焦显微镜(clsm，leica
‑
tcs
‑
sp5，德国)观察。具体来说，将l929细胞以1
×
106cells/ml的浓度包裹在水凝胶中，浸泡在dmem高糖完全培养基中。将包裹细胞的水凝胶在体外培养1、3或5天。在不同时间点取出凝胶，用pbs洗涤3次，然后在含有5μg/ml fda和5μg/ml pi的 pbs溶液中浸泡2min，用激光共聚焦显微镜观察细胞在水凝胶中的活力和分布情况。
[0128]
图14示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶中的细胞形态。用fda/pi染色法研究了水凝胶三维包裹的l929细胞的活性。培养1、3、5天后，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行观察，结果如图5所示。活细胞经fda染色为绿色，死细胞经pi染色为红色。在培养过程中，大多数细胞被染成绿色，只有少数细胞被染成红色。第一天，细胞均匀分布在所有的水凝胶中。随着培养时间的延长，细胞在水凝胶中增殖和聚集，荧光强度不断上升。冻干粉水凝胶及其对应的现配的水凝胶(未冻干)表现出良好的细胞相容性。
[0129]
(3)ges
‑
1细胞在水凝胶表面增殖
[0130]
ges
‑
1细胞(人胃上皮细胞)被用来研究细胞在水凝胶表面的增殖。将细胞以20000cells/ml的细胞浓度接种于冻干粉水凝胶表面，用cck
‑
8测定第1、3、5天细胞生长的增殖。
[0131]
图15示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶表面的增殖情况。可见，随着培养时间的延长，光密度(od)增加，反映了水凝胶表面细胞增殖良好。现配水凝胶表面的细胞生长速率优于冻干粉凝胶表面的细胞生长速率。
[0132]
(4)酸性环境下水凝胶对细胞的保护作用
[0133]
通过transwell培养方式研究冻干粉水凝胶在酸性环境下对ges
‑
1细胞的保护作用。在transwell 12孔板的每个孔的上室中接种10000个细胞，下室加入1ml rpmi
‑
1640完全培养基。细胞贴壁后，在上室加入400ul冻干粉水凝胶前体溶液覆盖细胞表面。冻干粉水凝胶形成后，加入完全培养基，用盐酸将ph值调整到2或4。培养24h后，用cck
‑
8检测细胞增殖率。
[0134]
图16示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在酸性条件下在各组冻干粉水凝胶表面的相对增殖率。从图16可以看出，在酸性条件下，水凝胶对ges
‑
1 细胞具有显著的保护作用。有水凝胶覆盖的细胞明显比没有水凝胶覆盖的细胞生长得更好，说明六种水凝胶在低ph条件下对细胞有明显的保护作用。
[0135]
(5)ges
‑
1细胞在凝胶表面的粘附
[0136]
将200μl的水凝胶前驱液加入24孔板，37℃培养箱中凝胶化。将20000 个ges
‑
1细胞接种于水凝胶表面，培养12h后让细胞粘附。然后，用1ml/s 流速的培养基洗涤水凝胶表面20s，吸走粘附不牢或者未粘附的细胞和培养基，加入含10％cck
‑
8的新鲜无血清培养基，
在37℃孵育3h(37℃，5％co2)。最后，用酶标仪(multiskan fc,usa)在450nm处测量吸光度。水凝胶的细胞黏附性是根据仍然黏附在水凝胶表面的细胞数量来评价的。
[0137]
图17示出了本技术实施例中ges
‑
1细胞在各组冻干粉水凝胶表面的粘附能力。图17显示了ges
‑
1细胞在水凝胶表面的粘附能力。这六种水凝胶都表现出一定的细胞粘附。现配cs
‑
gp水凝胶与cs
‑
gp冻干粉水凝胶的细胞粘附无显著差异，但csla/cs
‑
gp和csla
‑
gp水凝胶的细胞粘附能力略大于对应的冻干粉水凝胶。
[0138]
从上述实施例中获得的数据以平均数
±
标准差(sd)表示，并使用spss11.0(spss,chicago,il,usa)进行分析。各组间显著性差异采用方差分析 (anova)，确定统计学意义。*p<0.05为组间差异有统计学意义，**p<0.01 为极显著。
[0139]
第二方面，本发明实施例提供一种冻干粉的应用，将本技术提供的上述的冻干粉，作为一种生物材料应用于内镜下粘膜剥离术。
[0140]
基于上述实施例中各表征和检测结果，本发明人得出以下结论：
[0141]
内镜粘膜下剥离术是一种早期治疗胃癌的有效方法，但术中及术后并发症如出血、穿孔等限制了其广泛应用。近年来，一些新的术中生物材料被开发出来，可以减少esd中这些并发症的发生。先前的研究已证实壳聚糖温敏水凝胶可作为术中生物材料用于esd。然而，这种水凝胶的长期稳定性保存较差，以及临时制备的复杂性，给大规模生产和应用带来了挑战。为了解决这些问题，本研究在壳聚糖分子链中引入乳糖基团，以壳聚糖水凝胶冻干粉为基础，重新构建了可注射的温敏水凝胶。我们对冻干过程对水凝胶的理化性质和生物学性质的影响进行了深入的研究。
[0142]
基于上述实施例的研究，壳聚糖温敏性水凝胶作为esd术中生物材料，其温敏成胶特性、成胶时间、力学强度、可注射性、组织粘附性等理化特性是至关重要的。根据测量到的流变特性(图1)，本研究评价的冻干粉水凝胶前体溶液在37℃下可以形成凝胶。研究表明，壳聚糖侧链上的氨基和羟基对其温敏成胶特性起着重要的调控作用。冷冻干燥和研磨等物理方法对壳聚糖上的氨基和其侧链上的羟基并没有很大影响，这是为什么冻干粉水凝胶依然能保持其温敏特性的原因。虽然csla/cs/gp冻干粉水凝胶的成胶时间比相应的现配水凝胶的成胶时间长，但成胶时间均在5min内(图4)，满足esd 微创手术的时间要求。dma结果(图6)表明，相对于三种现配水凝胶，冻干粉水凝胶的机械强度有所提高，这可能与冻干粉的浓度有关。在三种冻干粉水凝胶中，以csla
‑
gp凝胶粉为基础的水凝胶力学强度最好。这可能是由于乳糖基团的引入延长了壳聚糖分子链，增加了h键的数量,从而导致h键网络的形成。现配水凝胶前体溶液在4℃保存10天后出现部分絮凝，这在一定程度上反映了壳聚糖温敏水凝胶长期稳定保存较差。低温流动性和注射力测试结果(图9
‑
10)显示，冻干粉水凝胶的注射可行性与对应的现配水凝胶相比有明显改善。事实上，注入力与生理盐水相近，这意味着可以通过内镜喷洒管注射水凝胶。此外，csla
‑
gp冻干粉水凝胶表现出最佳的可注射性(图 10)，这与其csla含量有关。根据ftir光谱(图2)，1290cm
‑1处的峰对应酰胺键iii，随着csla浓度的增加，该峰强度增强。添加了csla的水凝胶冻干粉末更加均匀，具有规则的针状结构(图3)，这可能有助于提高其可注射性。冻干粉末水凝胶也表现出一定的组织粘连性，尽管组织粘附性略低于现配水凝胶(图11
‑
12)。冻干粉水凝胶的其它相关性质也进行了研究。冻干过程对凝胶体系的最终ph值影响不大，冻干粉水凝胶的ph值接近中性(图 5)。体外降解试验结果(图7)显示，水凝胶可以在含有胃蛋白酶的酸性pbs 溶液中维持几天。从
sem图像来看，冻干粉水凝胶基本保持了原有的多孔网络结构(图8)。综上所述，csla/cs/gp冻干粉水凝胶基本保持了原有的良好性能，相对于现配水凝胶，其可注射性和机械强度均有所提高。
[0143]
生物学实验结果表明，csla/cs/gp冻干粉水凝胶无细胞毒性，且包裹在水凝胶内部和在水凝胶表面均表现出良好的细胞增殖，从而证实了这些水凝胶具有良好的细胞相容性(图13
‑
15)。更重要的是，冻干粉末水凝胶在酸性环境下对ges
‑
1细胞有明显的保护作用，覆盖水凝胶的细胞明显比不覆盖的细胞生长更好(图16)。这可能是因为水凝胶的强度增加了，水凝胶阻碍了酸性溶液的流动。此外，水凝胶中的羟基和氨基可以确保细胞周围的酸性较弱的环境。csla/cs/gp冻干粉末水凝胶也表现出一定的细胞粘附性，可能是因为水凝胶具有多孔的网络结构，提供了大量的细胞附着位点，促进了细胞的扩散和进一步增殖。以上实验结果证明，本发明提供的冻干粉能够稳定储存，使用方便，同时满足esd手术的大部分要求，可以作为一种esd术中生物材料应用。
[0144]
以上对本发明所提供的一种固态胶黏剂及其制备方法与应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。