样品制备的方法和装置与流程

1.本发明涉及分离领域，例如分析物的回收，并提供使样品制备更有效的工具和方法。更具体地，本发明涉及一种微量洗脱柱；包括一个或多个此类柱的板；以及一种能够使用较小洗脱体积的样品制备方法。
2.发明背景
3.开发微量洗脱技术主要是为了满足减少溶剂使用和减小提取仪器尺寸的需求。通常，在此类方法中，相对于样品、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的体积而言，提取相的体积非常小。
4.大多数市售微量洗脱型板产品运转的洗脱体积为50μl或更大。通常将洗脱体积分成两等份进行施用，从床层质量为2和5mg的材料中回收材料。使用大洗脱体积的原因之一是为了防止分析物从板的柱床上的回收率低和/或不一致。回收率低或不一致的原因有多种。由于床层填充不均匀，柱可能会产生通道。液体流可能会流过柱床，使柱内的树脂或床层的一部分未完全反应而不受样品、洗涤液和/或洗脱液的影响。在任何这些步骤中，流动不佳或不一致可能需要大量的缓冲液，尤其是在洗涤和洗脱步骤中，以确保所有柱介质都与溶剂/缓冲液接触并发生反应。随着柱床尺寸的减小，填充床的均匀性更难以实现。
5.用于自上而下流动的微量洗脱柱的任何柱都可能含有截留或部分截留在柱床中的空气。事实上，这是关于板如何运作的人为现象，而且是标准操作的一部分。即使在液体离开床层之后，也可能通过施加到柱的连续顶部压力或底部真空而无意中简单地引入空气。
6.将空气无意中引入吸附床的另一种方式是通过气隙工艺。―气隙”是截留在柱床顶部和引入柱床顶部的液体的段塞(slug)之间的空气。存在气隙时，由于气隙顶部的液体被柱床顶部的压力或柱底的真空迫使通过柱，空气将被迫通过柱床。这可能导致空气被部分且不可预测地保留在柱床中。
7.柱床中这种不需要的空气被称为夹带空气。空气可以在调节、上样、样品洗涤或样品洗脱的任何液体流动步骤中引入。床层中的空气会中断液体的流动，从而使流经柱的液体既不一致也不可预测，例如由于流动的通道作用。其还可以改变液体流经柱的流速。基于柱的板可能含有大量的死体积，所述死体积必须通过引入任何缓冲步骤来清除。在这种情况下，将需要大的洗脱体积来提供多次洗脱和回收目标分析物的机会，而较小的洗脱体积会导致材料回收率低以及材料的柱间回收率不一致。
8.在样品制备领域，存在从板式固相萃取柱中提高分析物回收率一致性和质量回收率的需求。还存在小洗脱体积的需求，同时保持分析物从板式柱的树脂中的完全质量回收。如上所述，存在减少板的柱床中的夹带空气的量的需求，并且需要避免将空气引入板的柱床中。最后，存在当将液体引入板的柱床中时避免气隙的需求。
9.wo 2005/070141(phynexus,inc.)涉及用于纯化分析物(例如肽、蛋白质或核酸)的萃取柱。所述柱的特征可在于使用中的低背压，并且在一些实施方案中，据称分析物的洗脱可以在小体积液体中获得。
10.柱体可由多种材料制成，例如塑料、玻璃、陶瓷或金属。此外，萃取柱包括一块或两块筛板(frit)，例如膜筛网，其特征可在于低孔体积。膜筛网的极性会很重要——亲水性筛网将促进与床层的接触并促进气液界面建立表面张力；而疏水筛网不会提高表面张力，因此流动的阈值压力会不同。
11.us 4,779,467(rainin instruments co.,inc.)涉及一种用于具有模块化结构的多通道空气置换移液管的液体端组件，该组件使得单个部件在被污染或磨损时能够容易地被更换。该组件还确保选择性地移除选定的活塞和气缸部件，从而可以使用少于全部数目的通道进行移液，而无需首先戳掉吸头(tip)然后手动移除或重新布置吸头阵列。更具体地，这通过还包括模块化活塞装置的液体端组件来实现，该模块化活塞装置包括具有第一端和第二端的圆柱形杆，其中活塞装置包括配置在杆的第一端附近的弹簧捕获装置。
12.us 2018/0252687(tecan)涉及用于从液体样品中提取分析物，特别是从生物流体中提取分析物的微柱。更具体地，us 2018/0252687的目的是提供一种提取装置，该装置可提高处理通量，可从样品中移出非常高百分比的分析物，是可运输的，可无损坏地储存并且价格低廉。还希望这种装置与现有的自动化设备兼容，并且不会将洗脱液或任何可能干扰分析结果的化合物浸入生物或其他流体样品中。同样，希望最小化介质床体积和相关的死体积，以降低洗涤液的体积。
13.根据us 2018/0252687，这可以通过包括第一微柱和第二微柱的装置来实现，所述第一微柱包括第一通道、延伸穿过第一通道的流量分配器层；所述第二微柱包括第二通道、延伸穿过第二微柱的提取层；其中，第一微柱位于第二微柱之上并与之串联，第一通道与第二通道流体连通。
14.us 2018/0238842(showa denko)涉及一种液相色谱柱和包括该液相色谱柱的液相色谱装置。更具体地，根据us 2018/0238842，与连续使用相关的问题的一个实例是柱的过滤器可能被注入的样品组分或随样品组分注入的杂质堵塞，并且施加到系统的压力可能超过装置的极限，导致分析失败。
15.为解决此类问题，us 2018/0238842记载了一种液相色谱柱，其包括圆柱柱体；设置在柱体的洗脱液流入侧端的流入侧过滤器；设置在柱体的洗脱液流出侧端的流出侧过滤器；以及填充在流入侧过滤器和流出侧过滤器之间的填料，其中流入侧过滤器具有由从填料的一侧开始依次设置的第一树脂过滤器构件和第二树脂过滤器构件组成的双层结构，所述第一树脂过滤器构件的压痕弹性模量低于所述第二树脂过滤器构件。
16.尽管有可用的产品和技术，但在样品制备领域，特别是在固相微量洗脱领域，仍然需要更有效的方法，以尽可能少地使用液体和试剂进行快速分析，尤其是在自动化领域多样本的并行处理中。


技术实现要素：

17.本发明的一个方面是一种微量洗脱柱，其包括柱体，柱体包括底部筛板和顶部筛板，其中柱体包括布置在底部筛板和顶部筛板之间的吸附剂，以及布置在顶部筛板上方的任选的过滤筛板，其中顶部筛板和/或底部筛板的孔体积约为0.2μl。此外，底部筛板的孔径可以小于顶部筛板的孔径。
18.本发明的另一个实施方案是微量洗脱柱，其包括柱体，柱体包括底部筛板和顶部
筛板，其中柱体包括布置在底部筛板和顶部筛板之间的吸附剂，不存在过滤筛板。
19.本发明的另一方面是一种用于并行处理样品的板，其包括多个位置，根据本发明的一个或多个的柱被布置在这些位置中。
20.本发明的另一方面是制备用于后续分析的样品的方法，其中将1
‑
50μl范围内的洗脱溶剂的等分试样施加到根据本发明的柱的顶部。
21.从从属权利要求以及下面的详细说明书中将可以看出本发明的进一步细节、优点和实施方案。
22.附图简述
23.图1示出本发明的单个微量洗脱柱1，其包括底部筛板3和顶部筛板4，以及布置在底部筛板3和顶部筛板4之间的吸附剂5。将环形脊7布置成能够使其定位在板10中的y方向上清晰可见，而布置成接收每个柱的所述环形脊7的装置12的的总体定位由箭头指示。
24.图2示出本发明的单个微量洗脱柱1，其除了图1中描述的特征之外，还示出了任选的过滤筛板6。
25.图3a
‑
b以两个不同的视角示出本发明的微量洗脱柱1，其包括轴环(collar)8和平面9。
26.图4a
‑
c以三个不同的视角示出本发明的板10，其包括布置成接收本发明的一个或多个柱1的多个位置11。
27.图5a
‑
b通过示意性侧视图(图5a)和示意性俯视图(图5b)示出本发明的板1。
28.图6说明了如何将缓冲液施加到具有柱壁13(此处为亲水的)和亲水的顶部筛板4的本发明的柱1的顶部。示出了缓冲液分配管14。
29.图7说明了如何将缓冲液施加到具有柱壁13(此处为疏水的)和亲水的顶部筛板4的本发明的柱1的顶部，其中缓冲液液滴15的直径小于顶部筛板上方的柱体2的直径。
30.图8说明了图7中描述的柱，其中液滴15与顶部筛板4接触。液滴沿柱的内壁流动并覆盖顶部筛板4的顶部。
31.图9说明了根据实施例4b获得的分析物回收性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。
32.图10说明了根据实施例4b获得的相对标准偏差(rsd)性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。
33.图11说明了根据实施例4c获得的分析物回收性能，比较了2mg lvf柱格式的最小洗脱体积。
34.图12说明了根据实施例4c获得的相对标准偏差(rsd)性能，比较了2mg lvf柱格式的最小洗脱体积。
35.图13说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。
36.图14说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。
37.图15说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。
38.图16说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的
10mg固定孔板。
39.定义
40.术语―微量洗脱”在本文中以其最广泛的含义使用，包括从萃取柱中的作为回收所需材料的最后步骤的小体积洗脱。
41.术语―柱”在本文中以其样品制备领域中的常规含义使用，其为布置成用来接收吸附剂的腔室。
42.术语―吸附剂”在本文中使用，包括将材料吸附到固相介质的材料，其通常是具有较高表面的材料。吸附剂有时也称为床层或树脂。术语―筛板”在本文中以其样品制备领域中的常规含义使用，即布置用于将萃取介质固定在柱中的多孔材料。筛板在本文中有时被称为―筛网(screen)”。如本文所用，术语―过滤筛板”是一种位于入口筛板上方的筛网、膜或筛板材料，用于从进入柱床的液体中除去颗粒物质。
43.如本文所用，术语―固相萃取”被定义为通过其将溶解或悬浮在液体混合物中的化合物，根据其物理和化学性质，通过吸附到柱介质中而与混合物中的其他化合物分离的样品制备方法。
44.如本文所用，术语―洗脱体积”被定义为洗脱液的体积，洗脱液有时称为解吸液，分析物可在其中解吸和收集。
45.如本文所用，术语―生物分子”是指源自生物系统的分子，例如蛋白质、肽和核酸。
46.发明详述
47.如上所述，本发明涉及一种用于低(即小)体积洗脱和回收材料(例如从固相萃取板中回收材料)的方法和设备。
48.在第一方面，例如在图1和图2中所示例的，本发明涉及包括柱体2的微量洗脱柱1，柱体2包括底部筛板3和顶部筛板4，其中所述柱体2包括布置在底部筛板3和顶部筛板4之间的吸附剂5，以及布置在顶部筛板上方的任选过滤筛板6。该柱有利地是流通式柱，其中液体在顶部添加并且从底部流出。
49.本发明的柱有利地以板格式使用，当将柱布置在板中时，有利于用于以自上而下的流动形式的并行处理。因此，通过本发明的这种柱，流体将从顶部施加到底部。或者，柱可以用作移液管吸头柱，例如以来回流动吸头柱格式或在常规移液中。
50.为了改善柱在板格式中的使用，例如在图1中所示例的，根据本发明的柱可以包括防止其在y方向上移动的装置，例如环形脊7或其他被布置成接收板10的孔的支撑部分的突起。
51.此外，当柱被布置在板中时，为了防止或至少显著减少其在x方向上的移动，例如在图3中所示例的，根据本发明的柱可以包括布置在柱体上部的轴环8，轴环8包括至少两个相对的平面9，例如四个平面，即两对相对的表面。
52.有利地，已将吸附剂5已经装载在基本上避免或至少最小化顶部筛板4下方的空隙体积(即在顶部筛板和吸附剂5之间)的体积内。换言之，为了避免以上讨论的空气夹带问题，将吸附剂装载到底部筛板3和顶部筛板4之间的空间中，以最小化任何自由空间或空气。因此，吸附剂5可以作为填充床而不是流化床而提供。在一个实施方案中，本发明不允许吸附剂颗粒在顶部筛板4下方自由移动；或至少将任何此类移动显著减少到对柱性能没有影响的程度。
53.底部筛板3可以是低孔隙率的，例如在上文讨论的wo 2005/070141中所记载的筛板。在一些实施方案中，筛板的孔体积可以是0.2μl或更小。此外，底部筛板3可以是水可湿性的，即基本上亲水的。为了能够有利地添加样品，如下文将详细讨论的，顶部筛板4可以是水可湿性的，即基本上亲水的。柱体2或至少柱体的内部可以是疏水的，或至少基本上疏水的。然而，作为改变某些特性和性能的替代方案，柱体2的内部可以是水可湿性的，即基本上亲水的。
54.根据本发明的柱可以被配置用于自上而下的柱流，在这种情况下，过滤筛板6被配置成能够除去大颗粒，例如源自生物样品的污染物。在本发明的上下文中，应当理解，术语自上而下流动被理解为表示常规使用中柱在板中的位置，或作为移液管吸头的位置。
55.如图1和图2所示，底部和顶部筛板用于容纳吸附剂5的床层。任选的附加过滤器筛网除去样品中的物质，以防止柱床堵塞。在一些实施方案中，柱的过滤筛板和顶部筛板之间存在0.1
‑
20mm的间隙。在一些实施方案中，所述间隙在0.5mm和10mm之间。在一些实施方案中，顶部筛板和过滤筛板之间的间隙为0.5、1、2、4和5mm。
56.在本发明的柱中，过滤筛板的死体积(即保留在过滤器孔中的液体的间隙体积)在0.05μl
–
5μl的范围内。在一些实施方案中，死体积在0.05μl
–
2μl的范围内。在一些实施方案中，死体积在0.1μl
–
1μl的范围内。
57.技术人员可以根据例如样品的性质和微量洗脱的目的选择合适的孔隙度和底部、顶部和过滤筛板的其他尺寸。
58.在本发明的另一方面，本发明涉及适合用于样品并行处理的板10，其包括多个位置11，根据本发明的一个或多个的柱已被布置在这些位置11中。
59.有利地，这种板的每个孔将包括与每个柱的环形脊7接合的装置12。此外，本发明的板可以包括布置成接收两个或更多个平面9的装置，这些平面9布置在每个柱的上部，例如在轴环8中或与轴环8一起，如图8中所示例的。因此，板可以是方形的，以适合柱轴环的平面的方式。
60.如上所述，本发明的板可以是具有任选的可移除的移液管吸头柱的可互换板。本发明的板可以构造成接收多个平行排列的柱，其中柱可以被移除并用作吸头柱。在一个实施方案中，板以8
×
12行配置的96柱格式操作。板的柱的微量洗脱可通过控制筛板极性和塑料来实现。
61.如上文简要讨论的，本发明的柱可以是包括水可湿性筛网筛板和任选的水可湿性聚合物壁的组件的组合。在本发明的一些实施方案中，可以使用非水可湿性聚合物筛网筛板，其包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚丙烯(pp)、聚醚醚酮(peek)、聚萘二甲酸乙二醇酯(pen)、聚四氟乙烯(ptfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(pbt)等。
62.本发明的筛板具有孔径和孔隙率。孔径或孔隙直径是筛板中的有效开口，其将允许具有规定孔径的材料通过或大部分通过筛板。筛板由聚合物线或其他聚合物材料构成，使这些区域封闭，即无孔。筛板的孔隙率定义为筛板的孔隙开放面积除以总面积再乘以100。
63.在本发明的一些实施方案中，底部出口筛板的孔径或孔隙直径小于顶部或入口筛板。发现含有颗粒材料的样品会堵塞筛板并且通过柱的流量会受到限制或停止。大于顶部筛板孔径的样品颗粒将保留在柱床顶部。然而，小于顶部筛板孔径的样品颗粒会通过并可
能滞留在柱中。如果颗粒滞留在底部筛板的孔中，则通过柱的流量可能会减少甚至停止。在本发明的一些实施方案中，发现通过顶部筛板的样品颗粒可以通过降低底部筛板相对于顶部筛板的孔径来防止堵塞柱。在这些样品中，通过柱的颗粒将不会滞留或堵塞下部出口筛板，且流量将不会受到阻碍。
64.构造柱并用于避免引入液体时产生气隙，尤其是将小体积液体引入柱的顶部。如果柱中夹带空气，柱两端的亲水性筛板和柱内的低死腔允许在引入下一个液体体积时排出大部分空气。该板是真正的低体积板格式，其可以任选是灵活的板/吸头格式。对于2mg质量的柱床，即使洗脱体积小于50、45、40、35、30、25、20、15甚至10μl，也可以回收超过90％的引入柱床的洗脱体积。对于在0.2
–
2mg范围内的柱床质量，即使洗脱体积小于50、45、40、35、30、25、20、15、10甚至5μl，也可以回收超过90％的引入柱床的洗脱体积。对于在2
–
20mg范围内的柱床质量，即使洗脱体积小于50、45、40、35、30、25甚至20μl，也可以回收超过90％的引入柱床的洗脱体积。
65.位于板的柱中的柱床质量可在2、5、10或20mg范围内。位于96柱板中的柱床质量可在0.1
–
10mg和0.2
–
5mg范围内。
66.本发明的柱允许除去气隙，从而可以避免在柱床中引入空气。在一个实施方案中，这是通过使用亲水性的筛板和柱壁来实现的，使得添加的液体沿壁和柱滑下并覆盖筛板，不允许空气进入柱床。在另一个实施方案中，这是通过使用具有亲水性的筛板并将液体滴入床层中来实现的，其中液滴的直径小于筛板上方的柱的直径。在另一个实施方案中，这是通过存储液滴来实现的，使得液滴底部接触并覆盖亲水性筛板。
67.在另一方面，本发明涉及一种制备用于后续分析的样品的方法，其中将至少一种体积在100
‑
400μl范围内的样品施加到根据本发明的柱上。
68.使用本发明的板，低或微量洗脱体积是可能的。因此，可以将样品施加到装载有吸附剂5的柱1上，并且可以在后续步骤中通过施加体积在1
‑
50μl范围内的洗脱液进行洗脱。例如，柱中吸附剂重量为2
‑
5mg的质量重量时，可使用50μl及以下的洗脱体积来洗脱，其中洗脱体积/回收体积的比率在0.9
‑
1.0的范围内。
69.该方法可以是自上而下的柱流方法，其中可将样品施加到过滤筛板6。
70.或者，该方法为移液方法，其中样品被吸出并通过底部筛板3以接触布置在底部筛板3和顶部筛板4之间的吸附剂5。
71.在一些实施方案中，使用高压迫使液体通过板中的柱。该高压用于除去可能包含在床层中的夹带空气，从而改善液体与包含在柱床中的介质的接触。然而，高压也用于显著增加液体流速和液体通过床层的线速度。可用于本发明的板的压力为2
‑
30psi、3
‑
25psi、4
‑
20psi、5
‑
15psi和5
‑
10psi，同时保持固相介质对分子的捕获。出人意料地是，这些高压范围可用于本发明的柱板中，因为高线速度通常会由于缓慢的捕获动力学而限制分子的捕获。
72.在本发明的一个实施方案中，本发明的柱和带有柱的板的单个柱床的吸附剂的质量重量范围为2
‑
5mg；可以用少于50μl洗脱体积来进行洗脱，分析物的回收率在90
–
100％的范围内。在本发明的另一个实施方案中，对于小于50μl的洗脱体积，施加的洗脱体积/回收体积的比率在0.9
‑
1.0的范围内。在本发明的另一个实施方案中，对于小于50、45、40、35、30、25、20和15μl的洗脱体积，施加的洗脱体积/回收体积的比率在0.9
‑
1.0的范围内。施加到本发明的板中柱的顶部的小于50μl洗脱体积允许体积床完全流动并且不会被柱体、床层
或筛板内可能包含的死腔截留。出人意料地是，即使在本发明的柱床中夹带空气，也可以使用这些小的洗脱体积，并且可以实现高达90
‑
100％的回收率。
73.柱可设计为能够向柱的顶部筛板添加小于50、40、30、25、20、15、10和5μl的洗脱体积，而不会在柱的顶部引入气隙。
74.包含柱的板可配置为8
×
12(96柱)格式，但板不限于这种配置。本发明的板可具有任意数量的行和列。该板可以以96孔板类型格式进行处理。在本发明的一些实施方案中，柱可不从板格式中移除。在一些实施方案中，吸头柱可从板上移除并且可以以1
‑
2、1
‑
4、1
‑
8、1
‑
12或1
‑
96个移液泵格式进行处理。来自本发明的板的移液器吸头柱可以以2、4、8多通道移液器格式进行处理。在一些术语中，柱可被称为板格式内的孔或柱孔。然而，柱孔必须保留具有底部或出口筛板、顶部或入口筛板以及包含在这两个筛板内的介质的格式。
75.洗脱体积可低至25
‑
50μl、20
‑
50μl、15
‑
50μl或10
‑
50μl的范围。洗脱体积可一次性加入。对于20、15、10、5、4、3、2、1和0.5mg的柱床质量，以μl计的洗脱体积(ev)与以mg计的柱床质量(bm)的比率(ev:bm比率)可小于25、20、15、10、5、4、3或2。出人意料地是，随着床层质量的减少，本发明的板和柱中较小的床层质量可适应更小的ev:bm比率。这与本领域技术人员所预期的相反。
76.在一些实施方案中，柱床以体积而不是质量来表示。在这种情况下，对于50、40、30、20、15、10和5μl的柱床体积，以μl计的洗脱体积(ev)与以μl计的柱床体积(bv)的比率(ev:bv比率)可小于10、5、4、3或2。类似地，随着床层体积的减小，本发明的板和柱中的小体积床层可适应更小的ev:bv比率。
77.柱可从板上拆下，并可用于来回流动的吸头柱格式。
78.将柱设计为能够向柱的顶部筛板添加小于50、40、30、25、20、15、10和5μl的洗脱体积，而不会在柱的顶部引入气隙。
79.将板配置为8
×
12格式，但不限于这种配置。其可具有任意数量的行和列。该板可以以96孔板类型格式进行处理，或者可以以1
‑
2、1
‑
4、1
‑
8、1
‑
12或1
‑
96个移液泵格式来处理来自板的吸头柱。从板上移除的吸头可使用以2、4、8和12通道移液器格式的多通道移液器头进行处理。
80.相对于收集孔的底部，柱末端(或底部筛板)的位置距离350μl收集板底部约5mm以内，从而避免由于高流速而导致的飞溅、气溶胶形成。
81.96柱板的顶部筛板和洗脱筛板的直径在0.1
‑
4mm和1
‑
2mm的范围内。
82.柱可密封成带有环形脊的板格式，而单个吸头柱也可从板上移除。
83.使用5mg或更少床层质量进行板固相萃取，其中使用助滤剂进行样品添加。
84.任选的模块化双柱格式使用与一次96板格式和1
‑
96移液器吸头柱格式兼容的吸头柱，具有：
85.a)柱体上的环形脊，以将柱密封在板中；
86.b)柱顶部的平面边缘，以限制柱顶部在板中的移动；
87.c)其中可以从板和移液头上移除柱。
88.通过本发明的方法所制备的样品可以在后续步骤中进一步分析，例如通过质谱，如通过lc
‑
ms或lc
‑
ms/ms。
89.附图详述
90.图1示出本发明的单个微量洗脱柱1，其包括底部筛板3和顶部筛板4、布置在底部筛板3和顶部筛板4之间的吸附剂5。将脊7布置成能够使其定位在板中的y方向上清晰可见。柱1可以是永久性的或任选地从其板上可移除的并且用作移液管吸头柱。小质量柱的平均直径可以在1
‑
4mm的范围内，如在以上详述部分中进一步详细讨论的。
91.图2示出本发明的单个微量洗脱柱，除了图1中描述的特征外，其还示出任选的过滤筛板6。过滤筛板6可具有不同尺寸的孔来过滤样品中所包含的大颗粒，防止堵塞吸头柱。
92.图3a
‑
b示出本发明的微量洗脱柱，包括轴环8和平面9。
93.图4a
‑
c示出本发明的板10，包括布置成接收脊7的装置11。
94.图5a
‑
b通过示意性侧视图(图5a)和示意性俯视图(图5b)示出本发明的板10。所示板布置为用于通过自上而下柱流进行柱加载、柱洗涤和柱洗脱。使用小洗脱体积时，可以防止空气进入柱床。柱1可以嵌入板中；或者它们是可移除的。任选的模块化双柱格式使用与一次96板格式和1
‑
96移液管吸头柱格式兼容的吸头柱，在柱体2上具有环形脊7以将每个柱1密封到板10中。可将平面有利地布置在每个柱1的顶部，以限制柱在板10的顶部沿x方向的移动。
95.图6说明了如何将缓冲液施加到本发明的具有壁13(此处为亲水的)和亲水的顶部筛板4的柱1的顶部。将缓冲液施加到具有亲水壁和亲水的顶部筛板4的柱1的顶部。液滴15将沿着柱壁的侧面向下移动，以防止在液体等分试样和柱的顶部之间形成气隙。液滴接触并覆盖亲水的顶部筛板4。
96.图7说明了如何将缓冲液施加到本发明的具有壁13(此处为疏水的)和亲水的顶部筛板4的柱1的顶部，其中液滴16的直径小于顶部筛板4上方的柱的直径。将缓冲液施加到具有疏水壁和亲水的顶部筛板4的柱的顶部，其中液滴15的直径小于筛板上方的柱的直径。随着液体被施加到柱的顶部，形成液滴15。液滴15不接触壁以形成气隙。
97.图8说明了如何将缓冲液施加到本发明的具有壁13(此处为疏水的)和亲水的顶部筛板4的柱1的顶部，其中液滴15接触顶部筛板4。液滴沿柱壁流动并覆盖顶部筛板4的顶部。将缓冲液施加到具有壁13和亲水的顶部筛板4的柱的顶部，其中液滴接触筛板。液滴15覆盖顶部筛板4的顶部和吸附剂5的顶部。气隙未形成。分配管14可随液体的分配而升高。
98.图9说明了根据实施例4b获得的分析物回收性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。更具体地，分析物在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、皮质醇、11
‑
脱氧皮质醇、皮质酮、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、dhea、雌酮、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、睾酮、dht；在y轴上绘制回收率％。对于给定的分析物组，两种格式之间的回收率比较是相当的，所有目标的回收率>60％。
99.图10说明了根据实施例4b获得的相对标准偏差(rsd)性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。更具体地，分析物在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、皮质醇、11
‑
脱氧皮质醇、皮质酮、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、dhea、雌酮、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、睾酮、dht；在y轴上绘制rsd％。对于给定的分析物组，2mg lvf格式的rsd在除1种情况外的所有情况下都更好。两种格式的所有分析物的rsd均低于10％。这说明了根据实施例4b呈现的数据可重复性。
100.图11说明了根据实施例4c获得的分析物回收性能，比较了2mg lvf柱格式的最小洗脱体积。更具体地，分析物在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、皮质醇、11
‑
脱
氧皮质醇、皮质酮、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、dhea、雌酮、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、睾酮、dht；在y轴上绘制回收率％。当洗脱体积低至20μl时，获得通常可接受的回收率。然而，30μl的洗脱体积表明回收率增加，并且性能与高达50μl的相当。这表明该分析物组可以用低至30μl的量洗脱而不会影响结果。
101.图12说明了根据实施例4c获得的相对标准偏差(rsd)性能，比较了2mg lvf柱格式的最小洗脱体积。更具体地，分析物在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、皮质醇、11
‑
脱氧皮质醇、皮质酮、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、dhea、雌酮、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、睾酮、dht；在y轴上绘制rsd％。所有洗脱体积的rsd均低于13％。对于给定的分析物组，所有洗脱体积均显示等效的rsd。这说明了根据实施例4c呈现的数据可重复性。
102.图13说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。使用直接注射从每个格式返回的洗脱体积、按1:1稀释或蒸发然后在对于每种格式等效的―洗脱”体积中重构的标准程序对数据进行比较。针对2mg lvf和10mg fwp格式，分别呈现比较直接注射洗脱液，分别按1:1稀释，蒸发和重构的数据。更具体地，精简的分析物组在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、11
‑
脱氧皮质醇、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、dheas、睾酮、dht；在y轴上绘制峰面积响应。数据表明，每个实验的2mg lvp板的峰面积增加。
103.图14说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。使用蒸发，然后以相等的―洗脱”体积重构每种格式进行数据比较，如前述图13所示。更具体地，精简的分析物组在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、11
‑
脱氧皮质醇、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、dheas、睾酮、dht；在y轴上绘制峰面积响应。数据表明，与传统的10mg固定孔板格式相比，2mg lvp板的峰面积增加。
104.图15说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。使用直接注射从每个格式返回的洗脱体积进行数据比较，如前述图13所示。更具体地，精简的分析物组在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、11
‑
脱氧皮质醇、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、dheas、睾酮、dht；在y轴上绘制峰面积响应。数据表明，与传统的10mg固定孔板格式相比，2mg lvp板的峰面积增加。
105.图16说明了根据实施例4d获得的分析物峰面积性能，比较了2mg lvf柱与传统的10mg固定孔板。使用从每种格式返回的洗脱体积与水按1:1稀释进行数据比较，如前述图13所示。更具体地，精简的分析物组在x轴上从左到右排列：18
‑
羟基皮质酮、可的松、11
‑
脱氧皮质醇、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、dheas、睾酮、dht；在y轴上绘制峰面积响应。数据表明，与传统的10mg固定孔板格式相比，2mg lvp板的峰面积增加。
106.实验
107.本实施例仅用于说明目的，不应被解释为限制由所附权利要求书限定的本发明。本技术在下文或其他地方提供的所有参考文献均通过引用的方式并入本文中。
108.柱：
109.在以下实施例中使用的根据本发明的低体积格式(lvf)柱由高纯度聚丙烯制成，其形状与图1相对应。
110.柱尺寸如下：2mg。
111.本文中所使用的柱中布置的筛板(以下表示为筛网)均按照标准方法由尼龙制成，并具有以下特性：
112.底部和顶部筛板：
113.25:19(以孔径(μm)表示：开放百分比)
114.过滤筛板：
115.105:52(以孔径(μm)表示：开放百分比)
116.除非另有说明，否则实施例中使用的吸附剂(以下表示为树脂)可从biotage(https://biotage.com/)商购获得。在底部筛板和顶部筛板之间的柱中装载吸附剂，直到吸附剂和顶部筛板之间几乎没有空间。
117.实施例1：本发明的微量洗脱柱的流动特性
118.实验设置和结论
119.将图2中所描述的、布置如图5中所描述的板中的低体积格式(lvf)柱在extrahera
tm
(https://biotage.com/)上处理三次，以确定流动特性。
120.基于evolute abn 20μm和30μm材料的粒径，研究了各种顶部和底部筛网。
121.使用abn 30μm树脂观察到最短的处理时间和最低的施加压力。对于这两种树脂，使用单吸头―105:52”筛网观察到最短的处理时间和最低的压力(尽管差异通常很小)，并且处理时间比手动施加 压时更快。
122.材料
123.在phynexus phytips(2mg)(https://phynexus.com/)中提供了evolute abn 20μm和30μm、5μl，其中已按本说明书的描述布置了底部筛板、顶部筛板和顶部筛板上方的过滤筛板。
124.下面，将为低体积格式的缩写的术语―lvf”与术语―本发明的微量洗脱柱”互换使用。当已将本发明的微量洗脱柱布置为固定(不可移动)在底板中用于并行处理时，它也可以表示为―lvf孔”。
125.表1：筛网配置(孔径(μm)：开放百分比)
126.顶部筛网(s)底部筛网25:1925:19105:5225:1925:19&105:5225:19105:52&105:5225:19
127.顶部筛网筛板的直径为0.120英寸，底部筛网筛板的直径为0.086英寸。直径是外径，包括大约0.020英寸的柱壁厚度。为了计算有效筛板直径的直径，从每个直径减去0.040英寸。
128.方法
129.在biotage lvf底板的a行中填充了每个粒径和筛网配置的一式三份lvf孔(图4和5)。
130.样品
131.根据血浆样品的标准程序处理从人类健康志愿者获得的尿样。
132.lvf孔是在手动模式下在extrahera上使用biotage evolute abn处理的。所有步骤均使用2.0巴的正压设置，因为当在一组使用过的20μm吸头上运行时，判断这会启动流动。在最后的洗脱步骤之前将压力增加到5.0巴并持续30秒，尽管这不会导致任何额外的液滴从吸头上滴落。
133.表2：abn通用处理方法
[0134][0135]
流量是通过以下方式进行判断的：测量从压头下降到每个吸头最后一整滴滴落的时间，测量从三个吸头中最早通过溶剂到三个吸头中最后一个的范围。这些时间是通过对每个步骤进行录像并通过查看影片单独监控每个吸头来准确确定的。还在不同时间点拍摄了来自吸头的精选的特写图像。一些溶剂被轻微染色以试图使它们更明显，尽管这有时会导致颜色集中在吸头介质上。
[0136]
观察
[0137]
a)abn30μm，5 μl phytip lvf extrahera处理
[0138]
使用2巴的正压轻松处理所有吸头。当同时观察所有品种时，从一个品种的吸头到另一个品种的吸头的流动通常几乎没有差异，但是30μm要比相应的20μ变体速度更快。在研究单个批次时，单筛网吸头的洗脱速度比双筛网略快，且105:52吸头的洗脱速度比25:19等价物略快。即使在差异最大化的提取过程的后期，它对流速的影响也不太可能显著。
[0139]
表3：abn 30μm
‑
顶部和双筛网选项(秒，2巴)
[0140]
步骤105:52 105.5225:19 105:52105:5225:19调节11
‑
1311
‑
1511
‑
1210
‑
13平衡12
‑
1315
‑
1612
‑
1312
‑
13上样21
‑
2520
‑
2519
‑
2122
‑
26洗涤20
‑
2121
‑
2821
‑
2322
‑
25洗脱14
‑
1515
‑
1912
‑
1616
‑
17
[0141]
b)abn 20μm，5μl phytip lvfextrahera处理
[0142]
使用2巴的正压轻松处理所有吸头。当同时观察所有品种时，从一个品种的吸头到
另一个品种的吸头的流动通常几乎没有差异，但20μm吸头速度较慢。在研究单个批次时，单筛网吸头的洗脱速度比双筛网略快，且105:52吸头的洗脱速度比25:19等价物略快。即使在差异最大化的提取过程的后期，它对流速的影响也不太可能显著。
[0143]
表4：abn20μm
‑
顶部和双筛网选项(秒，2巴)
[0144]
步骤105:52 105.5225:19 105:52105:5225:19调节15
‑
1917
‑
2013
‑
1615
‑
18平衡27
‑
3227
‑
2920
‑
2424
‑
27上样29
‑
3635
‑
3828
‑
3230
‑
33洗涤29
‑
3430
‑
3427
‑
3132
‑
41洗脱19
‑
2421
‑
2415
‑
1716
‑
23
[0145]
实施例2：微量洗脱柱与市售产品的比较
[0146]
综述
[0147]
使用两种类型的预处理血浆对低体积格式(lvf)吸头和oasisμelution孔进行处理，以确定流动特性。
[0148]
使用已/未离心的新鲜血浆和离心老化血浆观察到典型的流动特性。
[0149]
材料
[0150]
evolute abn 30μm、5μl、105μm 25μm顶部筛网(pte93
‑
05
‑
xx)
[0151]
oasis hlbμelution 30μm
[0152]
wbs血浆#5260(老化、高沉淀)
[0153]
wbs血浆#413(新鲜、低沉淀)
[0154]
(wbs＝welsh blood service)
[0155]
方法
[0156]
将每批血浆的等分试样以6500xg离心10分钟。将上清液转移到新容器中并丢弃任何沉淀(pellet)。
[0157]
将每批未离心(
‑
c)和已离心( c)的血浆的等分试样用1％甲酸按1:1稀释。
[0158]
lvf柱填充在biotage lvf底板中。将每批预处理血浆(
‑
c/ c)的200μl亚等分试样转移到一式两份的lvf吸头(由于数量有限)和一式三份的μelution孔中。
[0159]
使用最大流量(粗调)设置处理具有压力 96多支管(manifold)的lvf柱；使用可变流量(细调)设置处理μelution板。记录处理压力和时间。
[0160]
表5：处理时间
[0161][0162]
μelution孔的处理更加直接，使用细调设置完成上样并按预期停止流动。使用粗调设置处理lfv吸头会导致已完成的吸头超过组件的―气泡点”。
[0163]
实施例3：spe
[0164]
本实施例描述了使用现有技术柱(分别为30和10mg)或根据本发明的柱(2mg lvf)的一系列分析物的固相萃取(spe)回收率，该分析物在对通过spe所制备的样品进行的lc
‑
ms中获得。
[0165]
设置该实施例用于表明，使用低洗脱体积用根据本发明的微量洗脱柱可获得高回收率。
[0166]
使用在材料和方法中所描述的lvf柱。
[0167]
样本是来自英国welsh blood service的废弃人血浆。
[0168]
实施例3a：abn混合物9的lc
‑
ms分析
[0169]
在该实施例中，混合物9是以下酸性、碱性和中性药物的内部测试混合物：对乙酰氨基酚(中性药物)、纳曲酮、美托洛尔、米安色林(碱性药物)、泼尼松龙(中性类固醇)、酮洛芬、华法林、舒林酸、吲哚美辛(酸性药物)，该混合物用于低洗脱体积spe板的回收率测定。
[0170]
固相树脂：evolute abn
[0171]
方法
[0172]
1.调节：meoh
[0173]
2.平衡：0.1％甲酸水溶液
[0174]
3.上样：5ng在200μl中(1:1，血浆:1％甲酸)
[0175]
4.洗涤：95/5h2o/meoh
[0176]
5.洗脱：50μl meoh
[0177]
6.干燥：气流
[0178]
7.重构：1ml流动相(80/20h2o/meoh)
[0179]
8.分析连接到premier xe三重四极杆质谱仪的waters acquity uplc，进样量为10μl
[0180]
9.使用内部和外部标准进行数据分析
[0181]
表6
[0182]
柱床质量调节平衡上样洗涤洗脱30mg fwp1ml1ml0.2ml1ml0.5ml10mg fwp0.5ml0.5ml0.2ml0.5ml0.2ml2mg lvf0.5ml0.5ml0.2ml0.1ml2
×
25μl
[0183]
表7：30mg柱fwp
[0184][0185]
10mg柱fwp
[0186][0187]
2mg柱lvf
[0188][0189]
实施例3b
[0190]
使用2mg lvf，除了使用小于50μl的单等分试样洗脱分析物外，其余与实施例3a相同。该等分试样用20、30、40或45μl的甲醇的单等分试样成功洗脱分析物。
[0191]
实施例3c
[0192]
使用2mg lvf，除了将25μl缓冲液的单等分试样施加到具有疏水壁和亲水筛板的板柱顶部外，其余与实施例1相同。使用亲水壁，将样品、洗涤液和洗脱液施加到柱子上，液体沿柱壁向下流动并减少气隙。在处理柱子时，较少的空气被引入柱床中。
[0193]
实施例3d
[0194]
使用2mg lvf，除了将25μl缓冲液的单等分试样施加到具有疏水壁和亲水筛板的板柱顶部且其中液滴的直径小于筛板上方的柱的直径外，其余与实施例1相同。当液体被引入柱中时，该方法防止将气隙引入柱中。
[0195]
实施例3e
[0196]
使用2mg lvf，除了将25μl缓冲液的单等分试样施加到具有疏水壁和亲水筛板的板柱顶部且其中液滴接触筛板外，其余与实施例1相同。等分试样以1、2或更多滴液滴的形式施加，并流动以覆盖柱床筛板的顶部。当液体被引入柱中时，该方法防止将气隙引入柱中。
[0197]
实施例4
–
具有顶部筛板和底部筛板的微量洗脱柱
[0198]
在以下实施例中使用的本发明的具有底部筛板和顶部筛板(但没有过滤筛板)的低体积格式(lvf)柱由高纯度聚丙烯制成，其形状与图1相对应。
[0199]
柱尺寸如下：2mg。
[0200]
本文所使用的柱中布置的筛板(以下表示为筛网)均按照标准方法制备，并具有以下特性：
[0201]
筛板：
[0202]
底部：15:10尼龙(以孔径(μm)表示：开放百分比)
[0203]
顶部：33:21聚酯(以孔径(μm)表示：开放百分比)
[0204]
除非另有说明，否则实施例中使用的吸附剂(以下表示为树脂)可从biotage(https://biotage.com/)商购获得。吸附剂作为填充床装载在底部筛板和顶部筛板之间的柱中，允许吸附剂和顶部筛板之间根据顶部筛板的直径留出微小的空间。
[0205]
实施例4a：spe
[0206]
本实施例描述了使用现有技术柱(10mg)或根据本发明的柱(2mg lvf)的一系列分析物的固相萃取(spe)回收率，该分析物在对通过spe所制备的样品进行的lc
‑
ms中获得。
[0207]
设置该实施例用于表明，使用低洗脱体积用根据本发明的微量洗脱柱可获得高回收率。
[0208]
使用在材料和方法中所描述的lvf柱。
[0209]
样品是来自美国golden west biologicals的剥离的人血清。由于靶板的内源性，本实施例中使用了剥离的血清。分析比较了空白血清(n＝1)，然后提取前(n＝7)和提取后(n＝4)的加标(spiked)血清，以获得可重复性。
[0210]
实施例4b：内源性类固醇激素的lc
‑
ms分析
[0211]
在本实施例中，一组内源性类固醇激素：18
‑
羟基皮质酮、可的松、皮质醇、11
‑
脱氧皮质醇、皮质酮、21
‑
脱氧皮质醇、雌二醇、dhea、雌酮、雄烯二酮、11
‑
脱氧皮质酮、17
‑
羟孕酮、黄体酮、17
‑
羟基孕烯醇酮、孕烯醇酮、睾酮、dht，其用于低洗脱体积spe板的回收率测定。
[0212]
固相树脂：evolute abn
[0213]
方法
[0214]
1.调节：meoh
[0215]
2.平衡：0.1％甲酸水溶液
[0216]
3.上样：1ng在200μl中(1:1，血浆:1％甲酸)中；相当于10ng/ml
[0217]
4.洗涤1：h2o
[0218]
5.洗涤2：60/40(v/v)h2o/meoh
[0219]
5.洗脱：20
‑
50μl meoh
[0220]
6.干燥：气流
[0221]
7.重构：200μl的50/50h2o/meoh
[0222]
8.分析连接到8060三重四极杆质谱仪的shimadzu nexera uhplc，进样量为5μl
[0223]
9.使用内部和外部标准进行数据分析
[0224]
表1：处理量
[0225] 10mg fwp格式2mg lvf格式调节500μl100μl平衡500μl100μl上样200μl200μl洗涤1500μl100μl洗涤2500μl100μl洗脱150μl40μl
[0226]
fwp
–
固定孔板
[0227]
表2：10mgfwp对比2mglvf的结果
[0228][0229][0230]
在图9和10中分别示出回收率数据和rsd。
[0231]
实施例4c
[0232]
使用2mg lvf，除了使用小于50μl的单等分试样洗脱分析物外，其余与实施例4b相同。使用含有20、30、40或50μl甲醇的溶剂的单等分试样成功洗脱分析物。
[0233][0234]
[0235][0236]
使用由本发明实现的非常小的洗脱体积的结果分别在图10和11中以类固醇组呈现。
[0237]
测试实施例4d
[0238]
与实施例4b相同，用2mg lvf使用30μl的单等分试样洗脱分析物，相比之下10mg fwp则使用150μl。在图13
‑
16中，我们通过以下步骤比较了两种格式返回的分析物峰面积：使用标准的蒸发方法，然后分别以30或150μl重构；注射前用h2o按1:1稀释提取物；直接注入meoh洗脱液。