一种头孢羟氨苄原料药及其制剂中聚合物杂质的检测方法与流程

1.本发明属于分析化学和药物质量控制领域，具体涉及一种检测头孢羟氨苄原料药及其制剂中聚合物杂质的方法。


背景技术：

2.抗生素中的高分子杂质容易诱发过敏反应，威胁患者用药安全，因此需要严格控制其含量。高分子杂质主要包括外源性的高分子杂质和内源性的聚合物杂质。其中外源性的高分子杂质是由发酵工艺引入的残留蛋白、核酸、多糖与抗生素结合而生成的；内源性的聚合物杂质是抗生素分子之间通过共价键的形式结合形成的一系列不同分子量、不同立体结构的杂质，主要包括二聚体、三聚体、多聚体以及它们的异构体等。β
‑
内酰胺类抗生素分子中通常含有游离的氨基和结构不稳定的四元内酰胺环，容易发生氨基进攻四元内酰胺环的酰胺键，产生聚合物杂质。随着抗生素生产工艺的优化，过程控制日益严格，外源性的杂质现在已基本得到有效控制，但是内源性的聚合物杂质可能在药品原料与制剂生产、运输、存储过程中持续产生，目前已成为影响抗生素药品用药安全的风险要素之一。
3.自2005年版以来，为保证抗生素药品的用药安全性，中国药典对越来越多品种抗生素进行了聚合物杂质控制。近年来，色谱分离技术的迅速发展也为聚合物杂质的质控提供了更多的技术选择。目前已报道的方法主要包括葡聚糖凝胶g10色谱法(sephadex g10)、高效凝胶色谱法(hpsec)、反相高效液相色谱法(rp
‑
hplc)以及毛细管电泳法(hpce)、液质联用、柱切换技术、离子交换法等。技术手段的发展催生了聚合物质控理念的提升，逐渐由控制聚合物杂质总量向精准控制指针式聚合物杂质(即特定的代表性聚合物杂质单体)发展。
4.目前，中国药典(2020年版)中已收载采用反相色谱法分析头孢唑肟聚合物杂质，利用高效凝胶色谱法检测头孢地嗪、头孢米诺等头孢菌素类抗生素药物中的聚合物杂质，以及运用g10凝胶色谱法对多种头孢类品种检测聚合物杂质。但迄今还没有法定的头孢羟氨苄聚合物的检测方法。
5.臧洪梅、王雪分别报道采用sephadex g
‑
10法检查头孢羟氨苄中的聚合物杂质(1.臧洪梅.头孢羟氨苄高分子聚合物检查方法的建立与验证[j].中国抗生素杂志,2010,035(006):450
‑
452。2.王雪.浅析头孢羟氨苄高分子聚合物检查方法[j].科学与财富,2016,8(5)。)。王成刚则通过高效分子排阻色谱(hpsec)测定了头孢羟氨苄胶囊中聚合物杂质的含量(王成刚,等.高效分子排阻色谱法测定头孢羟氨苄胶囊中的高分子杂质[j].中国药学杂志,2011,46(13):1027
‑
1029.)。但是发明人在研究中发现，由于聚合物分子量大，无论是在sephadex g
‑
10还是在hpsec中，这些聚合物杂质都属于弱保留值杂质，在主峰前出峰，且容易受到小分子杂质的干扰，导致方法专属性较差。


技术实现要素：

[0006]
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种头孢羟氨苄原料药及其制剂中聚合物
杂质的检测方法。本发明提供的检测方法能够对头孢羟氨苄中的聚合物杂质进行有效分离，方法专属性好，实现对头孢羟氨苄原料及其制剂中聚合物杂质进行指针性精准控制。
[0007]
为了实现上述技术效果，本发明采用了如下的技术方案：
[0008]
一种头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，所述检测方法基于反相高效液相色谱法，包括色谱条件的建立和聚合物杂质定位对照溶液的制备；其中，所述色谱条件为：
[0009]
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶，
[0010]
流动相：以ph4.8～5.2的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，按照表1所示程序进行梯度洗脱：
[0011]
表1本发明的梯度洗脱程序
[0012][0013]
流速：0.9～1.1ml/min，
[0014]
柱温：28～32℃，
[0015]
检测波长：220nm；
[0016]
所述聚合物杂质定位对照溶液的制备，包括头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品的制备和聚合物杂质定位对照溶液的制备，操作步骤为：
[0017]
称取头孢羟氨苄原料40mg，置于西林瓶中，加入氯仿5ml，再加入三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度为8mg/ml的溶液，在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，得到所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品，密封避光保存；
[0018]
精密称取适量所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品，加流动相a溶解并定量稀释制成浓度为5mg/ml的溶液，得到所述聚合物杂质定位对照溶液。
[0019]
优选地，所述色谱条件中，色谱柱为phenomenex gemini或类似的色谱柱，规格4.6mm
×
250mm，粒径0.5μm。
[0020]
优选地，所述ph4.8～5.2的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液通过如下方法制备：
[0021]
取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至4.8～5.2，用水稀释至1000ml，混匀，即得。
[0022]
优选地，所述0.02mol/l磷酸二氢钾溶液的ph为5.0。
[0023]
优选地，流速为1.0ml/min。
[0024]
优选地，柱温为30℃。
[0025]
优选地，上述头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法还包括供试品溶液的制备：
[0026]
精密称取头孢羟氨苄原料药，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，即得；或
[0027]
取头孢羟氨苄片剂10片，研磨成细粉，精密称取细粉适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0028]
取头孢羟氨苄胶囊内容物适量，精密称定，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0029]
取头孢羟氨苄颗粒剂5包，混合均匀，研磨成细粉，精密精密称取细粉适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0030]
取注射用头孢羟氨苄内容物适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，即得。
[0031]
优选地，上述头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，还包括对照溶液的制备：
[0032]
精密量取所述供试品溶液适量，用流动相a定量稀释制成每1ml中含头孢羟氨苄50μg的溶液，即得。
[0033]
优选地，上述头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，还包括测定，具体操作为：
[0034]
取所述聚合物杂质定位对照溶液20μl，注入液相色谱仪，在所述色谱条件下记录色谱图，得到聚合物杂质定位色谱图；分别精密量取所述供试品溶液和所述对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，分别记录色谱图，得到供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图；将所述供试品溶液色谱图与所述聚合物杂质定位色谱图进行比对，所述供试品溶液色谱图中小于所述对照溶液主峰面积0.05倍的峰忽略不计，根据色谱峰的保留时间对供试品溶液中存在的聚合物杂质进行定位；按主成分自身对照法，对已经定位的聚合物杂质进行定量分析。
[0035]
优选地，头孢羟氨苄原料或其制剂中聚合物杂质总量的限度为：供试品溶液色谱图中，已经定位的聚合物杂质峰的峰面积之和不得大于对照溶液峰面积的1.0倍(即头孢羟氨苄原料药或制剂中聚合物杂质的总量不超过主成分的1％)。
[0036]
优选地，所述聚合物杂质定位色谱图在25min～40min区间出现的聚合物杂质峰包括来自头孢羟氨苄二聚体ⅰ、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体i、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体ii、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体iii、头孢羟氨苄二聚体i衍生物、头孢羟氨苄二聚体i衍生物异构体、头孢羟氨苄二聚体ⅱ、头孢羟氨苄三聚体和头孢羟氨苄四聚体中的一种或多种头孢羟氨苄聚合物杂质产生的色谱峰。
[0037]
根据质谱数据，解析出上述头孢羟氨苄聚合物杂质可能具有如下的结构：
[0038][0039]
命名为头孢羟氨苄二聚体ⅰ的聚合物杂质含量较高。因此，优选地，本发明所述头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，以保留时间25.96
±
2min的头孢羟氨苄二聚体ⅰ为指针性杂质，最低定量限为1.67
×
10
‑3μg，最低检测限为1.11
×
10
‑3μg。
[0040]
本领域技术人员应该理解，本说明书中，所述聚合物杂质定位对照溶液和供试品溶液制备过程中，取样量可以在所示的取样量
±
5％波动，制备得到的相应溶液的浓度也随着而波动。如，制备头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品时，可以称取头孢羟氨苄原料38～42mg，置于西林瓶中，加入氯仿5ml，再加入三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度为7.6～8.4mg/ml的溶液；在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，密封避光保存，作为头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品。
[0041]
本发明提供的头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，能够同时检测出多种聚合物杂质，各聚合物杂质分离度好，且本方法能够排除头孢羟氨苄原料药或其制剂中小分子杂质的干扰。因此，本发明的检测方法专属性良好、灵敏度高、耐用性良好。本发明的检测方法应用于实际生产，可以为保障临床用药安全发挥作用。
附图说明
[0042]
以下结合附图对本发明做进一步的说明。
[0043]
图1叠加的色谱图示出的是磷酸二氢钾溶液不同浓度条件下的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1是0.005m磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为2是0.01m磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为3是0.02m磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色
谱图，标号为4是0.05m磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图。
[0044]
图2叠加的色谱图示出的是0.02m磷酸二氢钾溶液不同ph值条件下的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1是ph3.0的磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为2是ph3.5的磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为3是ph4.0的磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为4是ph5.0的磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图，标号为5是ph5.5的磷酸二氢钾溶液为流动相a得到的色谱图。
[0045]
图3叠加的色谱图示出的是不同有机相构成的流动相得到的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1的是有机相组成为甲醇:乙腈＝100:0(v/v)得到的色谱图，标号为2的是有机相组成为甲醇:乙腈＝80:20(v/v)得到的色谱图，标号为3的是有机相组成为甲醇:乙腈＝70:30(v/v)得到的色谱图，标号为4的是有机相组成为甲醇:乙腈＝60:40(v/v)得到的色谱图，标号为5的是有机相组成为甲醇:乙腈＝50:50(v/v)得到的色谱图。
[0046]
图4叠加的色谱图示出的是不同洗脱程序下得到的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1的是洗脱程序1得到的色谱图，标号为2的是洗脱程序2得到的色谱图，标号为3的是洗脱程序3得到的色谱图，标号为4的是洗脱程序4得到的色谱图，标号为5的是洗脱程序5得到的色谱图。
[0047]
图5叠加的色谱图示出的是流动相不同流速下得到的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1的是流速0.8ml/min得到的色谱图，标号为2的是流速1.0ml/min得到的色谱图，标号为3的是流速1.2ml/min得到的色谱图。
[0048]
图6叠加的色谱图示出的是不同色谱柱得到的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1的是capecll mgii c18色谱柱得到的色谱图，标号为2的是kromasil c18色谱柱得到的色谱图，标号为3的是bds hypersil
tm c18色谱柱得到的色谱图，标号为4的是phenomenex gemini c18色谱柱得到的色谱图。
[0049]
图7叠加的色谱图示出的是不同柱温条件下得到的典型rp
‑
hplc色谱图；图中，标号为1的是柱温26℃下得到的色谱图，标号为2的是柱温30℃下得到的色谱图，标号为3的是柱温35℃下得到的色谱图，标号为4的是柱温38℃下得到的色谱图。
[0050]
图8是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
5的质谱图；其中，a是unk
‑
5的质谱tic图，b是unk
‑
5的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0051]
图9是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
6b的质谱图；其中，a是unk
‑
6b的质谱tic图，b是unk
‑
6b的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。。
[0052]
图10是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
7b的质谱图；其中，a是unk
‑
7b的质谱tic图，b是unk
‑
7b的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0053]
图11是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
8的质谱图；其中，a是unk
‑
8的质谱tic图，b是unk
‑
8的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0054]
图12是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
9的质谱图；其中，a是unk
‑
9的质谱tic图，b是unk
‑
9的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0055]
图13是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
10的质谱图；其中，a是unk
‑
10的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0056]
图14是头孢羟氨苄聚合物杂质unk
‑
11的质谱图；其中，a是unk
‑
11的质谱tic图，b是unk
‑
11的典型质谱图，其中在上的是一级质谱图，在下的是二级质谱图。
[0057]
图15的色谱图是专属性实验中得到的头孢羟氨苄聚合物杂质定位对照溶液的典型色谱图。
[0058]
图16示出的是头孢羟氨苄方法学验证样品与破坏试验降解溶液的典型色谱图；其中a是方法学验证溶液的色谱图，b是氧化降解溶液的色谱图，c是碱降解溶液的色谱图，d是水浴降解溶液的色谱图，e是酸降解溶液的色谱图，f是uv降解溶液的色谱图，g是高温降解溶液的色谱图。
[0059]
图17示出的是耐用性实验中不同流速下得到的典型色谱图；其中，标号为a的是流速0.9ml/min得到的色谱图，标号为b的是流速1.0ml/min得到的色谱图，标号为c的是流速1.1ml/min得到的色谱图。
[0060]
图18示出的是耐用性实验中不同柱温下得到的典型色谱图；其中，标号为a的是柱温28℃下得到的色谱图，标号为b的是柱温30℃下得到的色谱图，标号为c的是柱温32℃下得到的色谱图。
[0061]
图19示出的是耐用性实验中流动相不同ph下得到的典型色谱图；其中，标号为a的是ph4.8下得到的色谱图，标号为b的是ph5.0下得到的色谱图，标号为c的是ph5.2下得到的色谱图。
[0062]
图20示出的是实施例4测定的2批次头孢羟氨苄原料的典型rp
‑
hplc色谱图；其中，标号为1的是批号201410003的头孢羟氨苄原料的色谱图，标号为2的是批号201410002的头孢羟氨苄原料的色谱图，标号为3的是降解浓溶液的色谱图。
[0063]
图21示出的是对比例1得到的高效凝胶色谱法测定头孢羟氨苄的典型色谱图，其中a是降解浓溶液的高效凝胶色谱图，b是头孢羟氨苄原料(批号201410003)的高效凝胶色谱图。
具体实施方式
[0064]
本发明提供一种头孢羟氨苄原料药或其制剂中聚合物杂质的检测方法，所述检测方法基于反相高效液相色谱法，包括色谱条件的建立、聚合物杂质定位对照溶液的制备、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定法；其中：
[0065]
色谱条件的建立：
[0066]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选phenomenex gemini或类似的色谱柱，规格4.6mm
×
250mm，粒径0.5μm；
[0067]
流动相：以ph4.8～5.2(优选ph5.0)的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至4.8～5.2，优选调ph至5.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得)，以甲醇为流动相b，按照表1所示程序进行梯度洗脱。
[0068]
流速：0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min；
[0069]
柱温：28～32℃，优选30℃；
[0070]
检测波长：220nm；
[0071]
聚合物杂质定位对照溶液的制备：
[0072]
称取头孢羟氨苄原料40mg，置于西林瓶中，加入氯仿5ml，再加入三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度为8mg/ml的溶液，在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件
下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，密封避光保存，得到所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品；
[0073]
精密称取适量所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品，加流动相a并定量稀释成浓度为5mg/ml的溶液，得到所述聚合物杂质定位对照溶液；
[0074]
供试品溶液的制备：
[0075]
精密称取头孢羟氨苄原料药，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，即得；或
[0076]
取头孢羟氨苄片剂10片，研磨成细粉，精密称取细粉适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0077]
取头孢羟氨苄胶囊内容物适量，精密称定，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0078]
取头孢羟氨苄颗粒剂5包，混合均匀，研磨成细粉，精密精密称取细粉适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，滤过，取续滤液，即得；或
[0079]
取注射用头孢羟氨苄内容物适量，加流动相a溶解并定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，即得；
[0080]
对照溶液的制备：
[0081]
精密量取所述供试品溶液适量，用流动相a定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄50μg的溶液，即得；
[0082]
测定法：
[0083]
取所述聚合物杂质定位对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，得到聚合物杂质定位色谱图；分别精密量取所述供试品溶液和所述对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，分别记录色谱图，得到供试品溶液色谱图和对照溶液色谱图；将所述供试品溶液色谱图与所述聚合物杂质定位色谱图进行比对，所述供试品溶液色谱图中小于所述对照溶液主峰面积0.05倍的峰忽略不计，根据色谱峰的保留时间对供试品溶液中存在的聚合物杂质进行定位；按主成分自身对照法，对已经定位的聚合物杂质进行定量分析。
[0084]
基于上述检测方法，建立了头孢羟氨苄原料或其制剂中聚合物杂质总量的限度：
[0085]
供试品溶液色谱图中，已经定位的聚合物杂质峰的峰面积之和不得大于对照溶液峰面积的1.0倍(即头孢羟氨苄原料药或制剂中聚合物杂质的总量不超过主成分的1％)。
[0086]
基于上述方法，所述聚合物杂质定位色谱图在25min～40min区间出现的聚合物杂质峰包括来自头孢羟氨苄二聚体ⅰ、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体i、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体ii、头孢羟氨苄二聚体ⅰ异构体iii、头孢羟氨苄二聚体i衍生物、头孢羟氨苄二聚体i衍生物异构体、头孢羟氨苄二聚体ⅱ、头孢羟氨苄三聚体和头孢羟氨苄四聚体中的一种或多种头孢羟氨苄聚合物杂质产生的色谱峰。
[0087]
本发明建立的检测方法，以保留时间25.96
±
2min的头孢羟氨苄二聚体ⅰ为指针性杂质，最低定量限为1.67
×
10
‑3μg，最低检测限为1.11
×
10
‑3μg。
[0088]
以下参照具体的实施例来详细说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于阐明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0089]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和设备购买情况如下：
[0090]
thermal u3000高效液相色谱仪；dianox u3000液相色谱系统；
[0091]
thermal公司q exactive focus质谱仪；
[0092]
色谱柱：
①
capcell pak c18，5μm，4.6*250mm；
②
kromasil c18，5μm，4.6*250mm；
③
bds hypersil
tm
,c18,250mm
×
4.6mm；
④
phenomenex gemini c18,5μm，250mm
×
4.6mm；
[0093]
sartorius电子天平；
[0094]
头孢羟氨苄原料(批号：201410003，生产商为华北制药河北华民药业有限责任公司)；
[0095]
甲醇为色谱纯，供应商thermal fisher公司；
[0096]
无水磷酸氢二钠(批号20181025)、无水磷酸二氢钠(批号20181105)为分析纯，磷酸(批号20190826，分析纯)，供应商国药集团化学试剂公司；
[0097]
水为自制蒸馏水。
[0098]
实施例1头孢羟氨苄原料药中聚合物杂质的检测方法的建立
[0099]
本实施例采用的聚合物杂质定位对照溶液，通过如下方法制备：
[0100]
称取头孢羟氨苄原料40mg，置于西林瓶中，加入氯仿5ml，再加入三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度为8.0mg/ml的溶液，在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，密封避光保存，得到所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品；
[0101]
精密称取适量所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品，加流动相a并定量稀释成浓度为5mg/ml的溶液，得到所述聚合物杂质定位对照溶液。
[0102]
供试品溶液通过如下方法制备：
[0103]
精密称取头孢羟氨苄原料药，加流动相a溶解并定量稀释制成每1ml中含头孢羟氨苄5mg的溶液，即得。
[0104]
对照溶液通过如下方法制备：
[0105]
精密量取所述供试品溶液适量，用流动相a定量稀释成每1ml中含头孢羟氨苄50μg的溶液，即得。
[0106]
反相色谱法(rp
‑
hplc)用于聚合物分析时，常因聚合物杂质的色谱保留能力较强，导致聚合物杂质的洗脱难度加大。反相色谱法(rp
‑
hplc)还存在因色谱柱死吸附导致无法检出大分子量的聚合态杂质的风险。为了解决上述问题，保证聚合物杂质被顺利洗脱，本实施例考察了色谱柱、流动相组成、梯度洗脱程序、流速、柱温等因素对聚合物杂质分离度的影响。
[0107]
1.流动相的优选
[0108]
本发明建立的反相色谱法的流动相由磷酸盐缓冲液和有机溶剂两相构成。
[0109]
1.1磷酸盐缓冲液浓度的优选
[0110]
色谱柱：phenomenex,gemini,5μm,c18,250mm
×
4.6mm；流速：1.0ml
·
min
‑1；检测波长：220nm；柱温：30℃。
[0111]
流动相1：a相：0.005mol/l磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾0.68g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；按照表2所示进行梯度洗脱：
[0112]
表2梯度洗脱程序1
[0113][0114]
流动相2：a相：0.01mol/l磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾1.36g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；洗脱程序见表2。
[0115]
流动相3：a相：0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；洗脱程序见表2。
[0116]
流动相4：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾6.8g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；洗脱程序见表2。
[0117]
精密吸取聚合物杂质定位对照溶液20μl，注射入液相色谱仪，记录色谱图。具体见图1。图1示出，随着缓冲盐浓度降低，各杂质峰之间分离能力变差；当磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/l时，聚合物杂质间有较好的分离度，而磷酸二氢钾溶液为0.05mol/l时，杂质间虽有良好的分离，但盐浓度较高，易析出晶体，可能造成色谱柱的堵塞。因此磷酸二氢钾溶液浓度优选为0.02mol/l。
[0118]
1.2磷酸盐缓冲液ph值的优选
[0119]
色谱柱：同1.1
[0120]
流动相1：a相：ph3.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用30％磷酸溶液调节ph值至3.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；梯度洗脱程序见表2。
[0121]
流动相2：a相：ph3.5的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用30％磷酸溶液调节ph值至3.5，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；梯度洗脱程序见表2。
[0122]
流动相3：a相：ph4.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用30％磷酸溶液调节ph值至4.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；梯度洗脱程序见表2。
[0123]
流动相4：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；梯度洗脱程序见表2。
[0124]
流动相5：ph5.5的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.5，用水稀释至1000ml，混匀)；b相：甲醇；梯度洗脱程序见表2。
[0125]
精密吸取聚合物杂质定位对照溶液20μl，注射入液相色谱仪，记录色谱图。具体见图2。图2示出，随着磷酸盐缓冲液的ph值由5.5变化到3.0，头孢羟氨苄主峰后的聚合物杂质峰的分离度逐渐增大，色谱保留行为逐渐增强，但峰型变差。当缓冲盐溶液ph＝5.5时，聚合物杂质间分离能力也未得到明显改善。因此，磷酸盐缓冲液ph优选为5.0。
[0126]
1.3有机相的优选
[0127]
色谱柱：同1.1
[0128]
流动相1：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得)；b相：乙腈
‑
甲醇(0％:100％，v/v)；梯度洗脱程序见表2。
[0129]
流动相2：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液；b相：乙腈
‑
甲醇(20％:80％，v/v)；梯度洗脱程序见表2。
[0130]
流动相3：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液；b相：乙腈
‑
甲醇(30％:70％，v/v)；梯度洗脱程序见表2。
[0131]
流动相4：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液；b相：乙腈
‑
甲醇(40％:60％，v/v)；梯度洗脱程序见表2。
[0132]
流动相5：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液；b相：乙腈
‑
甲醇(50％:50％，v/v)；梯度洗脱程序见表2。
[0133]
精密吸取聚合物杂质定位对照溶液20μl，注射入液相色谱仪，记录色谱图。具体见图3。图3示出随着乙腈比例的增加，聚合物杂质的保留能力减弱，各聚合物杂质间的分离能力下降，且主峰与聚合物杂质间的保留时间差缩短，分离效果变劣。因此，优选b相为甲醇，不添加乙腈。
[0134]
1.4梯度洗脱程序的优选
[0135]
色谱柱：同1.1
[0136]
流动相：a相：ph5.0的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至5.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得)；b相：甲醇；梯度洗脱程序分别为：
[0137]
(1)洗脱程序1：见表2所示；
[0138]
(2)洗脱程序2：见表3所示；
[0139]
表3梯度洗脱程序2
[0140][0141]
(3)洗脱程序3：见表4所示。
[0142]
表4梯度洗脱程序3
[0143][0144]
(4)洗脱程序4：见表5所示。
[0145]
表5梯度洗脱程序4
[0146][0147]
(5)洗脱程序5：见表1所示。
[0148]
精密吸取聚合物杂质定位对照溶液20μl，注射入液相色谱仪，记录色谱图。具体见图4。图4示出随着有机相比例的升高，更多聚合物杂质被检出，并且通过调整有机相比例，聚合物杂质的峰型能到了一定的改善，聚合物杂质与头孢羟氨苄主峰的相对保留时间增大，最终选择各聚合物杂质峰间分离效果、峰型较好，聚合物杂质与头孢羟氨苄主峰间的相对保留时间较为合，能检出数量最多聚合物杂质峰的洗脱程序5作为最终洗脱程序。
[0149]
通过上述研究，优选的流动相为：
[0150]
以ph4.8～5.2(优选ph5.0)的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至4.8～5.2，优选调ph至5.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得)，以甲醇为流动相b，按照表1所示洗脱程序进行梯度洗脱。
[0151]
2.流动相流速的优选
[0152]
色谱柱：同1.1；
[0153]
以优选出的流动相和梯度洗脱程序，在流速0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min下分别对聚合物杂质对照溶液进行洗脱，记录色谱图。具体见图5。图5示出流速在0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min对聚合物杂质的分离效果相当。因此，流动相流速可以为0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min。
[0154]
3.色谱柱的优选
[0155]
在上述优选出的流动相、流速等条件下，更换不同的色谱柱
①
capcell pak c18，5μm，4.6*250mm；
②
kromasil c18，5μm，4.6*250mm；
③
bds hypersil
tm
,c18,250mm
×
4.6mm；
④
phenomenex gemini c18,5μm，250mm
×
4.6mm。
[0156]
不同色谱柱得到的聚合物杂质对照溶液色谱图见图6。图6示出只有phenomenex gemini c18色谱柱可以较好的分离样品中的头孢羟氨苄聚合物杂质，因此优选phenomenex gemini c18色谱柱或性能与之类似的色谱柱。
[0157]
4.柱温的优选
[0158]
以优选出的色谱柱、流动相、流速下，分别调整柱温至26℃、30℃、35℃、38℃，对聚合物杂质对照溶液进行洗脱，记录色谱图。具体见图7。图7示出上述不同柱温条件下对聚合物杂质的分离效果相当。因此，柱温可以为26℃～38℃，优选30℃。
[0159]
通过本实施例，建立了本发明的头孢羟氨苄聚合物杂质检测方法的色谱条件：
[0160]
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选phenomenex gemini或类似的色谱柱，规格4.6mm
×
250mm，粒径0.5μm；
[0161]
流动相：以ph4.8～5.2(优选ph5.0)的0.02mol/l磷酸二氢钾溶液为流动相a(取磷酸二氢钾2.72g，加水800ml使溶解，用1mol/l氢氧化钾溶液调节ph值至4.8～5.2，优选调ph至5.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得)，以甲醇为流动相b，按照表1所示程序进行梯度洗脱；
[0162]
流速：0.8～1.2ml/min，优选1.0ml/min；
[0163]
柱温：26℃～38℃，优选30℃；
[0164]
检测波长：220nm。
[0165]
实施例2头孢羟氨苄聚合物杂质的分离和结构鉴定
[0166]
在聚合物杂质检测方法的研究和建立过程，获得结构明确的聚合物杂质对照品并对聚合物杂质进行有效分离和结构鉴定是研究的关键步骤。
[0167]
本实施例采用柱切换lc/msn方法(c18
‑
sw
‑
c18)对聚合物杂质对照溶液中的聚合物杂质进行分离和结构鉴定。
[0168]
一维色谱系统：实施例1优选并建立，用于聚合物杂质的分离。
[0169]
二维色谱系统：用于对目标杂质进行脱盐处理以及进行ms分析。
[0170]
流动相：iia相：甲酸
‑
水(0.5:100，v/v)，iib相：甲酸
‑
乙腈(0.5:100，v/v)，梯度洗脱，参见表6，流速：0.7ml/min。
[0171]
二维色谱柱：agilent,sb
‑
c18,size 4.6mm i.d.
×
150mm,5μm。
[0172]
切换阀：六通阀a和b；切换用定量环体积：500μl。
[0173]
表6柱切换
‑
lc/msn法中色谱系统ii的梯度洗脱条件
[0174][0175]
注：t
r
：一维色谱中目标杂质的出峰时间。
[0176]
质谱方法
[0177]
质谱调谐方法
[0178]
spray voltage( ):3000.00v；capillary temperature( ):350.00℃；sheath gas( ):35.00l/hr；aux gas( ):10.00l/hr；
[0179]
max spray current( ):100.00；probe heater temp( ):350.00℃；s
‑
lens rf level:50.00；ion source:hesi
[0180]
一级质谱方法
[0181]
polarity:positive；dd
‑
ms2:discovery；in
‑
source cid:―；resolution:70,000；scan range:200to 2000m/z；agc target:1e6；maximum it:auto；micro scans:1；spectrum data type:profile；
[0182]
二级质谱方法
[0183]
resolution:17,500；isolation window:3.0m/z；isolation offset:―；(n)ce:13；default charge state:1；
[0184]
agc target:5e4；maximum it:auto；loop count:3.
[0185]
柱切换lc/msn法的工作流程
[0186]
首先，采用一维色谱系统中的方法对样品进行分离；然后通过切换阀，将目标杂质峰的t
r
±
0.30min区间内的流出组分切换至500μl的切换用定量环中；最后，采用二维色谱系统进行梯度洗脱，对目标杂质进行脱盐处理，并将其输送至质谱仪中进行ms分析。
[0187]
采用实施例1优选的色谱条件，在所述头孢羟氨苄聚合物杂质定位溶液中主要检出了9个疑似聚合物的杂质(unk
‑
5、unk
‑
6b、unk
‑
7b、unk
‑
8、unk
‑
9、unk
‑
10、unk
‑
11、unk
‑
12和unk
‑
13)，采用柱切换
‑
lc/msn法对上述聚合物杂质进行了定性分析和结构解析，各聚合物杂质的质谱图分别见图8
‑
图16。其中杂质unk
‑
5的含量较高，命名为头孢羟氨苄二聚体ⅰ，可作为质量控制的指针性聚合物杂质。
[0188]
由于各聚合物杂质稳定性差，分离出的单体极易发生结构异构化，因此目前只能根据质谱数据解析和推导出来的各聚合物杂质的可能的结构，如下所示：
[0189][0190]
各聚合物杂质的归属见表7。
[0191]
表7分离和鉴定出的头孢羟氨苄聚合物杂质
[0192][0193]
实施例3方法学验证
[0194]
为了保证建立的方法灵敏、准确、耐用，本实施例对已经建立的聚合物杂质检测方法的相关方法学参数进行了测定。
[0195]
仪器：dianox u3000液相色谱系统，sartorius电子天平。
[0196]
色谱系统：实施例1建立。
[0197]
样品溶液：取头孢羟氨苄原料药约40mg，置于西林瓶中，加入氯仿5ml，再加入三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度约为8.0mg/ml的溶液，在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，密封避光保存，作为头孢羟氨苄聚合物方法学验证储备样品。精密称取适量头孢羟氨苄聚合物杂质定位储备样品，加流动相a定量稀释成浓度约为5mg/ml的溶液，作为方法学验证样品溶液。
[0198]
3.1专属性实验
[0199]
精密量取方法学验证用样品溶液20μl，进样，记录色谱图。结果显示各聚合物杂质峰分离度良好(见图15)，各杂质峰经质谱分析已经证明为头孢羟氨苄的聚合物杂质(参见实施例2)。
[0200]
为了进一步验证聚合物杂质的出峰位置不受小分子杂质干扰，本研究对头羟氨苄原料进行了破坏性实验。
[0201]
酸降解溶液:
[0202]
称取头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置于10ml量瓶中，加入7ml的流动相a溶解，然后加入1ml的0.1mol/lhcl溶液，在60℃水浴中放置20min，取出放冷到室温并用流动相a稀释至刻度，备用。
[0203]
碱降解溶液:
[0204]
称取头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置于10ml量瓶中，加入7ml的流动相a溶解，然后加入1ml的0.1mol/lnaoh溶液，在60℃水浴中放置15min，加入1ml的0.1mol/lhcl溶液，用流动相a稀释至刻度，取出放冷到室温，备用。
[0205]
水浴降解溶液：
[0206]
称取头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置于10ml量瓶中，加流动相a溶解稀释至刻度，于60℃水浴放置60min取出，冷却至室温，备用。
[0207]
氧化降解溶液:
[0208]
称取头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置于10ml量瓶中，加流动相a约9ml溶解，然后加入1ml的3％双氧水，在室温下放置15min，用流动相a稀释至刻度，摇匀，备用。
[0209]
uv降解溶液:
[0210]
取头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，将其转移到表面皿中，在254nm波长紫外灯下照射3hr。
[0211]
高温降解溶液：
[0212]
取头孢羟氨苄原料药供试品约100mg，置于105℃烘箱中加热24hr，后取出放冷。取上述头孢羟氨苄原料药供试品约50mg，置10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀备用。
[0213]
结果显示，头孢羟氨苄原料药经酸、碱、水浴、氧化、uv和高温破坏后样品的杂质峰均有所增加，小分子杂质峰与聚合物杂质峰之间均有良好的分离效果，色谱图见图16。
[0214]
综上所述，本法可有效分离样品中头孢羟氨苄聚合物杂质，专属性良好。
[0215]
3.2检测限与定量限
[0216]
精密量取方法学验证样品溶液，用流动相a进行倍比稀释，得到不同浓度的系列溶液，注入液相色谱仪。以基线噪音的10倍为指标，得到方法的最低定量限；以基线噪音的3倍为指标，得到方法的最低检测限。
[0217]
结果表明，聚合物杂质头孢羟氨苄二聚体i(保留时间25.96
±
2min，实施例2中的杂质unk
‑
5)的最低定量限为1.67
×
10
‑3μg；最低检测限为1.11
×
10
‑3μg。
[0218]
3.3重复性实验
[0219]
精密量取方法学验证样品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样3针。如表8所示，结果表明方法重复性良好。
[0220]
表8重复性实验结果
[0221][0222]
3.4耐用性实验
[0223]
精密量取方法学验证样品溶液20μl，注入液相色谱仪，考察在不同流速、柱温、流动相ph值和不同色谱柱条件下，聚合物杂质的分离情况。
[0224]
1、流速分别为0.9ml/min，1.0ml/min，1.1ml/min时，均可有效分离样品中的头孢羟氨苄聚合物，色谱图见图17。
[0225]
2、柱温分别为28℃，30℃，32℃时，均可有效分离样品中的头孢羟氨苄聚合物，色谱图见图18。
[0226]
3、流动相a的ph为4.8，5.0，5.2时，均可有效分离样品中的头孢羟氨苄聚合物，色谱图见图19。
[0227]
上述系列的方法学验证实验结果表明，本发明建立的头孢羟氨苄聚合物杂质分析方法专属性良好、灵敏度高、耐用性良好，适合作为头孢羟氨苄原料药或其制剂的聚合物杂质的检测方法。
[0228]
实施例4本发明建立的检测方法对实际头孢羟氨苄原料的检测
[0229]
以本发明建立的检测方法对2批次头孢羟氨苄原料进行了检测，计算样品中聚合物的含量。
[0230]
4.1供试品溶液
[0231]
称取头孢羟氨苄原料药适量，置于10ml量瓶中，加流动相a溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含头孢羟氨苄浓度约为5mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
[0232]
4.2对照溶液
[0233]
精密量取上述供试品溶液100μl，置于10ml量瓶中，加流动相a稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为50μg/ml的溶液，作为1％对照溶液。
[0234]
4.3实验结果
[0235]
采用本发明建立的检测方法，对两批头孢羟氨苄原料药进行了检测，结果参见图20。采用主成分自身对照法，对已定位的聚合物杂质进行定量分析，结果参见表9。由实验结果可知，在上述供试品溶液的色谱图中未检出二聚体杂质及更高聚合态的聚合物杂质。
[0236]
表9头孢羟氨苄原料药中聚合物检查结果
[0237][0238]
对比例1高效凝胶色谱法(hpsec)检测头孢羟氨苄原料药
[0239]
1.1仪器与试药
[0240]
1.1.1仪器
[0241]
thermal u3000高效液相色谱仪，sartorius电子天平。
[0242]
1.1.2试药
[0243]
供试品：
[0244]
头孢羟氨苄原料(批号：201410003，生产商为华北制药河北华民药业有限责任公司)；
[0245]
甲醇为色谱纯，由thermal fisher公司提供。无水磷酸氢二钠(批号20181025)、无水磷酸二氢钠(批号20181105)为分析纯，磷酸(批号20190826，分析纯)由国药集团化学试剂公司提供。
[0246]
水为自制蒸馏水。
[0247]
1.2色谱条件的建立
[0248]
色谱柱：tsk
‑
gel g2000 swxl，300mm
×
7.8mm i.d.，5μm，column no.a00984；part no.08540。
[0249]
检测器：uv检测器；检测波长：220nm；流速：0.7ml/min；进样体积：20μl；柱温：30℃。
[0250]
流动相：a相：0.005mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)[0.005mol/l磷酸氢二钠溶液
‑
0.005mol/l磷酸二氢钠溶液(61:39)，用磷酸调节ph至7.0]；b相：乙腈；a:b＝85:15(v/v)。
[0251]
1.3供试品溶液制备
[0252]
①
降解浓溶液：取头孢羟氨苄原料药约40mg，置于西林瓶中，加氯仿5ml、三乙胺4滴，摇匀，溶解成浓度约为8.0mg/ml的溶液，在30
±
2℃避光条件下静置约36h，挥干溶剂，在60
±
2℃条件下真空干燥30min，加水5ml溶解后冷冻干燥成固体粉末，密封避光保存，作为降解浓溶液储备样品。精浓密称取适量头孢羟氨苄聚合物杂质降解储备样品，加水稀释并制成浓度约为2mg/ml的溶液。
[0253]
②
供试品溶液：取201410003批次原料适量，精密称定，分别置于10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为2mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
[0254]
1.4测定
[0255]
精密吸取降解浓溶液、原料供试品溶液各20μl，注入色谱仪，进行分析，色谱图见
图21所示。结果表明，在降解浓溶液中，头孢羟氨苄主峰前主要存在4个弱保留值杂质峰，按色谱保留时间由小到大分别命名为hpsec
‑
1～4，在主峰后存在1个杂质峰，命名为hpsec
‑
5，其中hpsec
‑
4的峰面积最大。头孢羟氨苄原料供试品的高效凝胶色谱图中，主要检出了弱保留值杂质hpsec
‑
1,2,3,4，未检出弱保留值杂质hpsec
‑
5。
[0256]
1.5高效凝胶色谱法(hpsec)专属性研究
[0257]
用柱切换
‑
lc/msn法分析hpsec法分离出的弱保留值杂质的目标峰，根据质谱数据推断弱保留值杂质的化学结构，综合评估hpsec法用于聚合物分析的方法专属性。
[0258]
一维色谱系统及一维色谱柱：同本对比例“1.2”项下。
[0259]
二维色谱系统及二维色谱柱：同实施例2的“二维色谱系统”和“二维色谱柱”。
[0260]
切换阀：同实施例2的“切换阀”。
[0261]
质谱方法：同实施例2的“质谱方法”。
[0262]
柱切换lc/msn法的工作流程：同实施例2的“柱切换lc/msn法的工作流程”。
[0263]
以降解浓溶液为供试品，经过高效凝胶色谱系统(hpsec)分离得到弱保留值杂质峰hpsec
‑
1～5，采用柱切换
‑
lc/msn法对上述杂质进行了定性分析和结构解析(各杂质的质谱图，略)，结果见表10。
[0264]
表10降解浓溶液中相关杂质汇总表
[0265][0266]
上述结果显示，hpsec法分析头孢羟氨苄聚合物时，能够检出聚合物杂质，但是受到多种小分子杂质的共出峰干扰，导致方法专属性较差，定量不准确，因此不适合用于头孢羟氨苄原料药的聚合物质控。