铁纳米簇用于制备抗败血症及其诱发的心肌损伤药物的应用的制作方法

1.本发明涉及铁纳米簇的新适应症，具体涉及铁纳米簇用于抗败血症及其诱发的心肌损伤药物的应用。


背景技术：

2.铁纳米簇文献1：“stabilization of fe
‑
pd bimetallic nanoparticles with sodium carboxymethyl cellulose for catalytic reduction ofpara
‑
nitrochlorobenzene in water.”中公开的一种新型材料，该材料的活性目前未知。


技术实现要素：

3.发明人通过构建败血症及其诱发的心肌损伤动物模型，观察其生存率、肛温、血常规、血生化、心脏超声、炎症等各项指标发现：
4.铁纳米簇可抑制败血症引起的生存率下降、改善败血症评分和肛温、升高wbc、plt数量降低rbc数量以及降低ldh、bun、ck、ast的水平；
5.铁纳米簇可提高由败血症引起的每搏输出量(stroke volume，sv)、心输出量(cardiac output，co)、左心室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume，lvesv)、左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，lvedv)的降低；改善左心室收缩末期后壁厚度(left ventricular end systolic posterior wall，lvpws)、左心室舒张末期后壁厚度(left ventricular end diastolic posterior wall，lvpwd)的增加；同时，铁纳米簇可改善由败血症引起的心肌组织紊乱，降低纤维化水平，从而达到改善心功能的作用。
6.铁纳米簇可抑制败血症诱发的心肌组织损伤后tnf
‑
α、il
‑
6、f4/80、ly6g的高表达、降低炎症相关分子il
‑
1β、il
‑
6、nlrp3等mrna的水平，并减少由败血症引起的超氧化物阴离子累积，发挥抗炎、抗氧化应激反应的作用；
7.基于上述发现，本发明提供了铁纳米簇用于制备治疗和/或预防败血症及其诱发的心肌损伤药物的应用。
8.同时提供一种药物，所述药物由纳米铁簇和药物辅料制备而成。
9.进一步，所述药物为静脉注射给药制剂。
10.更进一步，所述药物的给药剂量为每千克体重5mg
‑
20mg铁纳米簇。
附图说明：
11.图1为按照文献1所公开方法制备的铁纳米簇的表征信息；a图为铁纳米簇的粉末x射线衍射谱(xrd)图，b图为铁纳米簇的拉曼光谱图，c图为铁纳米簇的x射线光电子能谱(xps)宽谱图，d图为fe的2p
3/2
和2p
1/2
精细谱图；
12.图2为铁纳米簇对心脏、脾、肾等器官的毒性检测：图2a图为心肌组织he染色，图2b图为肝组织he染色，图2c图为肾组织he染色；
13.图3为铁纳米簇对clp损伤后小鼠生存率的影响，观察clp术后72h内各组小鼠的生存情况以及败血症评分，图3a图为小鼠生存率造模图片，图3b图为小鼠生存率曲线，图3c图为小鼠败血症评分结果，按照败血症相关参数变量对小鼠损伤后状态进行评分，结果以“均数
±
标准差”表示，n＝10。
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
14.图4为铁纳米簇对clp损伤后8h小鼠败血症评分以及肛温的影响，图4a图为小鼠功能学检测造模图片，图4b图为败血症评分结果，图4c图为小鼠肛温统计分析图，结果以“均数
±
标准差”表示，n＝6；
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
15.图5为铁纳米簇对clp损伤后小鼠血常规各项指标的影响，于小鼠术后8h测定血常规，wbc：白细胞；rbc：红细胞；plt：血小板；结果以“均数
±
标准差”表示，n＝6；
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
16.图6为铁纳米簇对clp损伤8h后小鼠血生化各项指标的影响，于小鼠术后8h测定血常规，ldh：乳酸脱氢酶；ck：肌酸激酶；ast：谷草转氨酶；bun：尿素氮；结果以“均数
±
标准差”表示，n＝6；
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
17.图7为铁纳米簇对clp损伤8h后心肌组织形态的影响，心肌组织切片he染色结果；he，苏木精
‑
伊红；
18.图8位铁纳米簇对clp损伤8h后心肌组织纤维化的影响，心肌组织切片masson染色结果；
19.图9为铁纳米簇对clp损伤8h后心脏功能各项指标的影响，图9a图为超声心动图长轴m模典型图片，以及各项心脏功能指标的统计分析图，sv：每搏输出量；co：心输出量；lvesv：左心室收缩末期容积；lvedv：左心室舒张末期容积；lvpws：左心室收缩末期后壁厚度；lvpwd：左心室舒张末期后壁厚度；图9b图为超声心动图短轴m模典型图片，以及各项心脏功能指标的统计分析图；结果以“均数
±
标准差”表示，n＝6，
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
20.图10为铁纳米簇对clp损伤8h后心肌炎症相关指标的影响，图10a图为免疫组织化学染色结果，炎症相关典型指标il
‑
6、tnf
‑
α、f4/80、ly6g的免疫组织化学染色结果；图10b图为mrna表达水平结果，炎症相关分子il
‑
1β、il
‑
6、nlrp3、caspase1、tnf
‑
αmrna表达水平的统计分析图；结果以“均数
±
标准差”表示，n＝6，
*
vs.clp组，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001；
21.图11为铁纳米簇对clp损伤8h后心肌组织中超氧化物阴离子水平的影响，心肌组织dhe染色结果，dhe，超氧化物阴离子荧光探针。
具体实施方式
22.败血症是指宿主对感染的反应失调导致的危及生命的器官功能障碍。败血症加重可引起感染性休克、弥散性血管内凝血和器官功能受损，严重威胁患者生命。心脏是败血症损伤最为严重的器官之一。临床研究表明，伴有严重心肌损伤的败血症患者死亡率高达80％。在败血症早期，心肌损伤可加速败血症病情恶化。败血症诱发的心肌损伤属于感染性心肌损伤的一种。感染性心肌损伤指病毒感染过程中或恢复期中出现的如心脏扩大、心力衰竭、心源性休克或心律异常等心肌损伤，典型的症状为疲乏无力、食欲不振、恶心、呕吐、呼吸困难、面色苍白，发热。
23.以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些的任何限定。
24.盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，clp)动物模型是经典的败血症动物模型，本发明实施例采用clp动物模型为研究对象，该动物模型可造成急性心肌损伤，即败血症诱发的心肌损伤。
25.需要说明的是，以下实验所用的铁纳米簇是按背景技术文献1中所述方法制备：将feso4·
7h2o水溶液与0.5％羧甲基纤维素钠(cmc)水溶液混合，然后在机械搅拌下加入冰冷的nabh4水溶液作为还原剂，混合溶液瞬间变成黑色，30分钟后通过磁分离法收集铁纳米簇颗粒，经过多次洗涤后，将铁纳米粒子通过超声重新分散在0.2％cmc溶液中，在超声下一次性加入现配的0.2％硫化钠水溶液，继续超声10分钟后通过磁分离收集硫化铁纳米簇，经过多次洗涤(磁分离除去上清液)，沉淀重新超声分散在cmc溶液中，保存备用；过程中所有用到的水都是去氧水。所制备材料的表征如图1所示，在xrd测试结果中，根据铁及其化合物的标准pdf卡，44.7
°
处的强峰应归属于α
‑
铁单质的特征峰(pdf#06
‑
0696)，19.3
°
的峰应归于fe(oh)2的特征峰(pdf#13
‑
0089)，说明制备的铁纳米簇的主要成分是铁，同时含有少量的氢氧化亚铁(fe(oh)2)(图1a)；氢氧化亚铁(fe(oh)2)是来自铁纳米簇在水中的弱水解。新制的铁纳米簇在无氧水中会不断产生小气泡，这意味着铁纳米簇与h2o反应，生成了fe(oh)2和h2；在拉曼光谱中，400
‑
800cm
‑1范围内可识别的峰也证实了铁纳米簇颗粒表面存在氧态的铁(图1b)；利用x
‑
射线光电子能谱(xps)进一步证实了铁纳米簇表面的氧化态铁(fe(ii)和fe(iii))的存在和含量(图1c和1d)。
26.所用动物购自空军军医大学实验动物中心，所用试剂为市场采购。如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。
27.实施例1：发明人研究发现铁纳米簇对小鼠的心脏、肝、肾器官没有毒性
28.方案：
29.采用balb/c小鼠，给予一定浓度的铁纳米簇后，观察动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。
30.步骤：
31.取20只雌雄各半的balb/c小鼠在24h内以900mg/kg的剂量腹腔注射给药3次，每次间隔6h(9:00、15:00和21:00)。对照组按相同的方式给每只小鼠腹腔注射等体积的去氧水。试验前动物禁食不禁水12h，给药4小时后自由采食和饮水。连续14d观察并记录每组小鼠的行为变化，毒性症状和死亡率。试验第15天处死小鼠，大体观察其心、肝、肾等主要器官的组织变化，并取主要脏器放入4％多聚甲醛中进行固定，用于后续he染色。
32.器官组织he染色：
33.①
石蜡包埋：将组织放入4％多聚甲醛中，固定至少24h；石蜡包埋、切片与脱蜡(按照顺序依次在80％、95％、95％、100％乙醇中浸泡40min，再按照100％乙醇、100％乙醇∶二甲苯＝1∶1混合液、二甲苯浓度梯度浸泡30min进行组织脱水透明；然后于包埋机中浸蜡3h，最后进行滴蜡包埋。
34.②
切片：设置切片厚度为5μm，使用捞片法将切片贴于多聚赖氨酸覆膜载玻片上，70℃烤片1h后，60℃烤片5h。
35.③
染色：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再次浸泡10min，按照100％、100％、95％、95％、80％乙醇、去离子水的顺序依次浸泡2min脱蜡至水，以备染色；将切片浸入苏木素染液染色3min，使用自来水轻柔冲洗5min；浸入1％盐酸乙醇30s，1％氨水3min脱色，使用自来水轻柔冲洗3min；浸入伊红染液染色3min，使用自来水轻柔冲洗3min；按照70％、80％浓度乙醇30s，95％、95％、95％、100％、100％浓度梯度乙醇、二甲苯、二甲苯的顺序分别浸泡2min进行脱水透明处理；中性树胶封片。
36.结果：
37.小鼠心肌、肝、肾组织的he染色结果如图2所示，与对照组相比，给予900mg/kg的nannofe后，小鼠心肌、肝、肾组织均未发生明显的组织结构改变，表明在此浓度范围内，铁纳米簇对小鼠没有毒性作用。
38.实施例2：发明人研究发现铁纳米簇能够改善败血症引起的小鼠死亡
39.方案：
40.采用clp手术，于在体水平上构建败血症模型，给予铁纳米簇预保护。
41.步骤：
42.使用野生型balb/c小鼠作为研究对象，按照研究设计，用随机数字表法进行随机分组，小鼠感染性心肌损伤模型按照rittirsch d等发表的clp实验方法，复制重度感染性心肌损伤模型。具体实验步骤如下：
43.(1)分组：生存率实验：将balb/c小鼠分为假手术组、clp组、铁纳米簇 clp组(5、10、20mg/kg剂量)，每组10只。
44.(2)clp造模：
①
第7天造模。采用小动物吸入麻醉系统对小鼠进行麻醉：小鼠吸入含异氟烷2％(体积分数vol/vol)的氧气，麻醉流量为3.0l/min，造模过程中流量为1.5l/min。麻醉程度监测标准为肢体的撤回反射消失，将小鼠固定并持续吸入含异氟烷2％的氧气维持麻醉；
②
小鼠腹正中区域备皮，用75％乙醇将皮肤消毒两次，延中下腹部正中行纵切口1cm，逐层切开分离皮肤、皮下组织，见腹白线，延腹白线切开腹直肌及腹膜，切口两侧用0.9％生理盐水湿润，用弯镊进腹，找到盲肠后轻柔牵出，将靠近回盲瓣处的粪便轻柔挤向盲肠末端(避免空气残留)，在盲肠末端至回盲瓣连线上2/3处(生存率实验为clp损伤加重模型，功能学检测采用盲肠末端至回盲瓣连线上1/3处结扎，其余步骤与加重模型相同)用4号无菌手术缝线结扎盲肠，在结扎线与盲肠末端中点处用2.5ml注射器针头对穿已结扎肠(避开血管)，穿孔后轻轻挤压盲肠，可见结扎段盲肠内容物质顺穿刺孔流出，将盲肠连同周围所有肠管还纳入腹腔。用3号无菌手术缝线逐层间断缝合腹膜及皮肤；
③
术毕，所有实验小鼠均于术后立即背部皮下注射37℃生理盐水(10.0ml/kg体重)进行液体复苏，妥善标记后放回鼠笼，等待苏醒。
45.(3)假手术组：假手术组除不进行盲肠结扎穿孔外，其余步骤与clp组造模相同。
46.(4)给药：clp造模前6天对各组小鼠进行进行预处理(腹腔注射)，给予假手术组、clp组去氧水；铁纳米簇 clp组：3mg/ml的铁纳米簇，用去氧水稀释，制成剂量分别为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的铁纳米簇溶液，每2天给药1次，共3次，确保每次给药的时间段以及手术时间相同。
47.(5)clp手术后开始计时，每1h观察一次，记录72h内各个分组小鼠死亡数量，统计并分析生存率。
48.(6)根据文献“a robust scoring system to evaluate sepsisseverity in an animal model”中公开的败血症评分表对clp后72h的小鼠进行打分。
49.(7)根据各组生存率以及败血症评分结果，确定铁纳米簇最佳保护浓度，筛选确定出最佳保护浓度后，同上进行动物实验，所取得的标本进行后续检测。
50.结果：
51.小鼠生存率曲线如图3b所示，与对照组相比，clp处理后，小鼠72h内生存率为50％(p＜0.01)。与clp组相比，5mg/kg铁纳米簇处理后小鼠生存率为70％；10mg/kg铁纳米簇处理后小鼠生存率为100％(p＜0.05)；20mg/kg铁纳米簇处理后小鼠生存率为90％(p＜0.05)。提示铁纳米簇可以提高小鼠clp后的生存率。
52.败血症评分如图3c所示，与10mg/kg铁纳米簇相比，20mg/kg铁纳米簇败血症评分显著较低(p＜0.05)。结合生存率和败血症评分结果，确定铁纳米簇最佳保护浓度为20mg/kg(后续功能学检测将采用此浓度)。
53.实施例3：发明人研究发现铁纳米簇能改善败血症评分、小鼠肛温及败血症引起的血常规变化
54.方案：
55.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型(后续所有功能学检测采用盲肠末端至回盲瓣连线上1/3处结扎，其余步骤与加重模型相同，如图4a)，给与铁纳米簇处理。
56.步骤：
57.(1)分组：生存率实验：将balb/c小鼠分为假手术组、clp组、铁纳米簇 clp组(20mg/kg剂量，腹腔注射)，每组6只。
58.(2)clp造模：结扎位置采用盲肠末端至回盲瓣连线上1/3处结扎，其余步骤同实施例2。
59.(3)根据败血症评分表对clp后8h的小鼠进行评分。
60.(4)检测clp手术8h后小鼠肛温的变化：损伤8h后，固定住小鼠，用棉球将小鼠的肛门清理干净，将温度检测探针轻轻插入肛门，待数据稳定后记录温度。
61.(5)检测clp手术8h后小鼠血常规各项指标的变化：损伤8h后，采用摘眼球取血法取血，用全自动血常规仪进行血常规检测。
62.结果：
63.于小鼠clp处理8h后进行败血症评分，结果如图4b所示，与对照组相比，clp组败血症评分显著升高(p＜0.0001)，给与铁纳米簇保护后，败血症评分显著降低(p＜0.0001)；
64.于小鼠clp处理8h后进行肛温检测，结果如图4c所示，与对照组相比，clp组肛温显著降低(p＜0.0001)，给与铁纳米簇保护后，肛温显著升高(p＜0.0001)；
65.于小鼠clp处理8h后检测了血常规相关指标的变化，如图5所示，与对照组相比，wbc、plt显著下降(p＜0.01)，rbc显著上升(p＜0.001)，而铁纳米簇处理后wbc、plt均显著上升(p＜0.5)，rbc显著下降(p＜0.001)。
66.实施例4：发明人研究发现铁纳米簇能改善败血症引起的血生化变化
67.方案：
68.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇处理，具体步骤同实施例3。
69.步骤：
70.检测clp手术8h后小鼠血生化各项指标的变化：损伤8h后，采用摘眼球取血法取血，收集每组全血，3000r/min，离心10min，吸取血清，随后使用全自动血生化分析仪进行检测。
71.结果：
72.于小鼠clp处理8h后检测了血生化相关指标的变化，如图6所示，与对照组相比较，clp损伤8h后，血清中ldh、bun、ck、ast水平均显著上升(p＜0.01)，给与铁纳米簇处理后，ldh、bun、ck、ast水平出现明显下降(p＜0.01)。
73.实施例5：发明人研究发现铁纳米簇能改善败血症引起的心肌组织损伤
74.方案：
75.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇处理，具体步骤同实施例3。
76.步骤：
77.石蜡包埋、切片、染色步骤同实施例1。
78.结果：
79.小鼠心肌组织he染色结果显示，如图7所示，与对照组相比，clp损伤后心肌组织结构紊乱，视野内细胞核数量显著增加，肌细胞间微血管单核细胞浸润增加；与clp损伤组相比，给与铁纳米簇后，可见心肌组织结构相对清晰，视野内细胞核数量减少，肌细胞间微血管单核细胞浸润减少。
80.实施例6：发明人研究发现铁纳米簇能减轻败血症引起的心肌组织纤维化。
81.方案：
82.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇处理，具体步骤同实施例3。
83.步骤：
84.心肌组织masson染色：
85.①
石蜡包埋、切片步骤同实施例1。
86.②
染色：脱蜡至水；流水冲洗数分钟；1％的丽春红和酸性品红混合溶液滴染3
‑
5min；蒸馏水洗；1％磷钼酸浸泡5min；2％亮绿溶液滴染3min；流水冲洗；0.2％醋酸溶液分色10s；流水冲洗；脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。
87.结果：
88.小鼠心肌组织masson染色结果显示，如图8所示，与对照组相比，clp损伤后蓝色胶原纤维显著增多，铁纳米簇处理后蓝色胶原纤维显著减少，纤维化程度降低。
89.实施例7：发明人研究发现铁纳米簇可以改善败血症心肌损伤引发的心肌功能损伤。
90.方案：
91.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇
处理，具体步骤同实施例3。
92.步骤：
93.小动物超声检测clp手术8h后小鼠心脏功能：各组动物于超声检测前一天脱去小鼠左胸区域被毛，小鼠经2％异氟烷麻醉，麻醉气体流量为1.0l/min，异氟烷吸入麻醉后固定于37℃恒温板上，充分暴露左侧胸廓，采用30mhz探头，选取标准胸骨旁左室长轴切面及标准左心室乳头肌短轴切面，记录m模心脏超声切面图像，测量指标包括：每搏输出量、心输出量、左室收缩末期容积、左室舒张末期容积、左室收缩末期后壁厚度、左室舒张末期后壁厚度等。
94.在检测过程中应该注意以下几点可能影响检测结果的细节：第一，麻醉状态不可以过深，否则会影响小鼠的心率和收缩功能；第二，小鼠的体位要摆好，四肢不可固定地过伸过紧，否则会压迫小鼠心脏，最终影响心功能检测的准确性；第三，小鼠靠近心脏部分至少提前一天进行脱毛处理，脱毛太早会导致检测时生出新毛发，成像时生成伪影，影响超声结果，太晚则使小鼠处于应激状态干扰心功能结果。
95.结果：
96.小动物超声检测clp手术8h后小鼠心肌收缩功能，结果如图9a(左室长轴超声结果)、9b(左室短轴超声结果)所示，与对照组相比，小鼠心脏的sv、co、lvesv、lvedv显著下降(p＜0.01)，给与铁纳米簇保护后，心功能明显改善。以及与对照组相比，小鼠左室收缩末期后壁厚度(lvpws)、左室舒张末期后壁厚度(lvpwd)明显变厚(p＜0.001)，给与铁纳米簇保护后，心功能明显改善(p＜0.01)。
97.实施例8：发明人研究发现铁纳米簇通过减轻炎症反应，改善感染性clp引起的心肌损伤。
98.方案：
99.采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇处理，具体步骤同实施例3。
100.步骤：
101.(1)免疫组织化学检测：
102.①
石蜡包埋、切片步骤同实施例1。
103.②
染色：切片常规脱蜡至水：根据试剂盒要求(购自武汉赛维尔生物科技有限公司)：分别取各组小鼠心脏组织石蜡切片依次经二甲苯2次，每次10min，100％乙醇2次、每次10min；95％、90％、80％、70％乙醇各1次，每次5min，最后浸入蒸馏水中5min；抗原修复：柠檬酸钠缓冲液微波抗原修复20min，流水冲洗10min；阻断内源性过氧化物酶：3％双氧水，室温20min。pbs洗3次，每次5min；封闭：滴加5％正常山羊血清封闭液，室温孵育30min；滴加一抗：擦去多余血清，加一抗，4℃孵育过夜。pbs洗3次，每次5min；滴加二抗：滴加辣根过氧化物酶hrp标记的二抗(1∶5000，pbs配制)，37℃温箱内孵育1h，pbs洗3次，每次5min；dab显色：滴加dab 0.5
‑
3min，镜下控制显色程度，流水冲洗10min，苏木素复染，1％盐酸酒精分化，1％氨水脱色，脱水，经二甲苯透明后用中性树胶封片。
104.③
显微镜下观察并拍照：显微镜下观察并拍照，每张切片随机找出20
‑
30个不重叠视野，光镜下组织切片呈棕黄色颗粒性沉积区域为阳性染色部位。
105.(2)实时定量荧光pcr：
106.①
样品总rna提取：将装有小鼠心脏样本的离心管从液氮中取出后，加入1ml trizol(购自takara生物公司)和2个研磨小珠，置于组织破碎仪上于60hz破碎1min，轻轻摇晃使trizol与样品混匀，置于冰上裂解5min；加入200μl氯仿，手动剧烈震荡管体15s，室温孵育15min后，置于4℃高速离心机离心15min，转速为12000rmp/min；此时rna全部位于上层水相中，用移液器吸取400μl水相转移至干净的无rna酶的离心管中，加入等体积的异丙醇进行混合，手动摇晃15s，室温孵育10min后，置于4℃高速离心机离心15min，转速为12000rmp/min；弃上清，加入75％乙醇(用depc水配制)，手动摇晃使rna沉淀悬浮，室温孵育5min后，4℃，8000rmp/min离心5min，重复该操作一次；弃去乙醇溶液，留下rna沉淀，室温干燥5
‑
10min；采用20ul depc水溶解rna沉淀，打开dna/rna浓度测定仪，测定样品的浓度，放于
‑
80℃冰箱进行保存。
107.②
反转录：将提取的总rna从
‑
80℃冰箱中取出，加入反转录试剂后置于pcr仪器中进行反转录，反转录程序为：37℃ 15min；85℃ 5s；反转后的cdna放于
‑
20℃保存，反转录体系如表1所示：
108.表1反转录体系
[0109][0110]
③
qrt
‑
pcr：将cdna、试剂盒(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)及所需引物(购自苏州金唯智生物科技有限公司，nlrp3：正向引物5
′‑
ggagttcttcgctgctatgta
‑3′
；反向引物5
′‑
ggaccttcacgtctcggttc
‑3′
；il
‑
1β：正向引物5
′‑
gtgtctttcccgtggacctt
‑3′
；反向引物5
′‑
catctcggagcctgtagtgc
‑3′
；il
‑
6：正向引物5
′‑
ttgggactgatgctggtgac
‑3′
；反向引物5
′‑
ggtatagacaggtctgttgggagt
‑3′
；tnf
‑
α：正向引物5
′‑
actgaacttcggggtgatcg
′
；反向引物5
′‑
tggtggtttgctacgacgtg
‑3′
；caspase1：正向引物5
′‑
agaacagaacaaagaagatggcaca
‑3′
；反向引物5
′‑
gtgccatcttctttgttctgttctt
‑3′
)从
‑
20℃冰箱中取出，准备好实验所需的器材；待样品和试剂盒融化后，按照以下比例配制溶液后，使用rt
‑
qpcr仪器设置好的程序进行实验。反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性15s；58℃退火延伸20s；72℃终末延伸30s，共40个循环，反应体系如表2所示：
[0111]
表2 qrt
‑
pcr反应体系
[0112][0113]
结果：
[0114]
小鼠心肌组织ihc染色结果显示，如图10a所示，与对照组相比较，clp损伤后il
‑
6、tnf
‑
α、f4/80、ly6g表达均显著升高，给与铁纳米簇处理后其表达量显著降低；
[0115]
小鼠心肌组织qrt
‑
pcr结果显示，如图10b所示，与对照组相比，clp损伤后炎症相
关分子il
‑
1β、il
‑
6、nlrp3、caspase1、tnf
‑
α的mrna水平均显著升高(p＜0.01)，给与铁纳米簇处理后il
‑
1β、il
‑
6、nlrp3、caspase1、tnf
‑
α的表达量下降(p＜0.01)。
[0116]
实施例9：发明人研究发现铁纳米簇通过减少由败血症引起的超氧化物阴离子累积，改善感染性clp引起的心肌损伤。
[0117]
方案：
[0118]
采用clp手术，于在体水平上构建败血症及其诱发的心肌损伤模型，给与铁纳米簇处理。
[0119]
步骤：
[0120]
dhe染色：
[0121]
②
石蜡包埋、切片步骤同实施例1。
[0122]
②
dhe染色：将切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再次浸泡10min，按照100％、100％、95％、95％、80％乙醇、去离子水的顺序浸泡2min脱蜡至水，以备染色。脱蜡结束后，使用dhe染色液于37℃下孵育30min，经过适当洗涤后，荧光显微镜下观察并拍照，荧光显微镜下组织切片呈红色荧光阳性染色部位，每张切片随机找出20
‑
30个不重叠视野。
[0123]
结果：
[0124]
小鼠心肌组织dhe染色结果显示，如图11所示，与对照组相比较，clp损伤后红色荧光部位显著增多，且红色荧光强度显著增强，铁纳米簇处理后其荧光部位显著减少，荧光强度明显下降。