一种复合酶解联合复合型树脂柱层析富集多种稀有人参皂苷的方法及其应用与流程

本发明属于中药活性成分制备，具体涉及一种复合酶解联合复合型树脂柱层析富集多种稀有人参皂苷的方法及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、红参为人参经蒸制干燥而成的传统名贵中药材，富含多种原生人参皂苷（如rg1、re、rd等）。稀有人参皂苷（如rg3、rh2、c-k、rk1、rg5等）生物活性显著高于原生人参皂苷，具有抗肿瘤、增强免疫、抗疲劳、抗氧化等药理活性，但天然含量极低。有文献报道采用hplc法测定了10批市售红参药材中6种稀有人参皂苷的含量，单个稀有人参皂苷的含量不超过0.046%。

3、定向转化是提升稀有人参皂苷含量的有效手段。现有转化方法主要包括酸碱水解法、单一β-葡萄糖苷酶酶解法以及一锅法混合酶解等。然而，酸碱水解条件剧烈，易产生大量副产物且安全性较差；单一β-葡萄糖苷酶无法切除鼠李糖苷键，导致含鼠李糖的原生皂苷re在该体系中无法被有效利用，造成底物浪费；常规一锅法混合酶解缺乏时序控制，易使底物过度降解为苷元，产物得率低。此外，脱水型稀有皂苷（rk3、rh4、rk1、rg5）需额外的高温或酸处理步骤方可生成，工序繁琐、能耗较高。传统工艺虽可获得含多种稀有人参皂苷的皂粉，但其总含量通常不理想，例如已有报道制备的15种稀有人参皂苷皂粉中单体总含量之和仅为68.5%，难以满足高纯度制剂需求。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明提供一种复合酶解联合复合型树脂柱层析富集多种稀有人参皂苷的方法及其应用。具体的，本发明基于时序分步酶解联合同步灭活脱水，从而实现糖苷键有序水解与c-20位脱水的连续完成，并耦合梯度洗脱，同时稳定获得高纯度10种稀有人参皂苷混合物，非常有利于工业化生产应用。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种复合酶解联合复合型树脂柱层析富集多种稀有人参皂苷的方法，所述方法包括：

4、s1、将红参药材加水煎煮提取、浓缩后得浓缩液；

5、s2、采用时序分步酶解策略，在第一时序阶段向所述浓缩液中加入α-l-鼠李糖苷酶；第二时序阶段向其中加入β-葡萄糖苷酶、纤维素酶得酶解反应液；

6、s3、对所述酶解反应液进行加热与过滤处理，得到酶解转化液；其中，通过加热处理同步实现酶的灭活与诱导酶解产物中c-20位羟基脱水；过滤用于去除不溶性杂质；

7、s4、经柱层析对多种稀有人参皂苷进行富集纯化，所述柱层析采用复合树脂柱，其中复合树脂为非极性树脂与弱极性树脂的混合物。

8、其中，所述步骤s1中，加水煎煮提取的具体步骤包括：将红参药材加水煎煮提取，冷却，过滤得提取液；优选为采用两次提取法进行，第一次加入红参药材8~12倍质量水，煎煮1.5~2.5 h过滤得滤液和滤渣；第二次加入所述滤渣的6~10倍质量水，煎煮1~2 h；煎煮液冷却后经100~300目筛网过滤，合并滤液。

9、所述步骤s2中，在第一时序阶段加入α-l-鼠李糖苷酶，从而脱除re的c-6位末端鼠李糖，将re转化为rg1。此阶段不添加β-葡萄糖苷酶，以避免β-葡萄糖苷酶过早水解葡萄糖苷键产生中间体，对后续鼠李糖苷酶活性产生竞争性抑制。

10、即红参浓缩液中虽然天然含有rg1（可直接被β-葡萄糖苷酶水解），但同时还含有大量re。re的c-6位连接的是“鼠李糖-葡萄糖”二糖，其末端鼠李糖阻挡了β-葡萄糖苷酶的有效作用，导致re在仅含β-葡萄糖苷酶的体系中无法被有效利用，造成底物浪费。有鉴于此，本发明通过第一时序阶段先加入α-l-鼠李糖苷酶，将re水解为rg1，使这部分原本被浪费的底物也可以作为β-葡萄糖苷酶的反应底物，额外贡献rh1、f1、rk3、rh4的产量。

11、本发明在第二时序阶段并不需要分离α-l-鼠李糖苷酶，而是直接加入β-葡萄糖苷酶、纤维素酶，继续反应3 h，定向水解葡萄糖苷键。

12、本发明经hplc实时监测，在ph 5.0、55℃条件下，α-l-鼠李糖苷酶可在2小时内将末端鼠李糖切除95%以上，而此时β-葡萄糖苷键保留率＞95%。若提前加入β-葡萄糖苷酶，会竞争性水解未被保护的葡萄糖苷键，产生非天然中间体并抑制后续鼠李糖苷酶活性。因此设定第一阶段为1.5~3 h（优选为2 h），第二阶段为2~5 h（优选为3 h），从而实现去屏障-主链水解的时序解耦作用。

13、同时，为了维持酶的最适活性，本发明中，酶解过程中ph优选维持为4.9~5.1。具体的，由于酶解过程中糖苷键水解会释放游离糖和有机酸，可能引起反应液ph下降（实验监测显示，5小时内ph可下降0.3~0.5）。为维持酶最适活性，在酶解开始后每1小时测定一次ph，若ph低于4.8，用0.1 m柠檬酸三钠溶液回调至5.0±0.1。

14、本发明中，所述复合酶系组成（以每公斤红参药材计）：

15、β-葡萄糖苷酶（100 u/g，来源于黑曲霉）：20~30g；

16、α-l-鼠李糖苷酶（40000 u/g，来源于黑曲霉）：0.07~0.20g；

17、纤维素酶（400 u/mg，来源于木霉属）：2.5~5.0g。

18、所述步骤s3中，加热处理具体条件为：在75~95℃（优选为80℃）保温处理20~60min，从而实现酶的彻底灭活，终止酶解反应；同时诱导酶解产物中c-20位羟基脱水，生成rk3、rh4、rk1、rg5。

19、脱水型皂苷生成的化学机理：

20、在ph 5.0、80℃弱酸性加热条件下，酶解后暴露的c-20位叔羟基发生质子化脱水反应（遵循e1消除机理），生成稳定的碳正离子中间体后，进一步消除质子形成δ20(21)或δ20(22)双键，从而专一性生成rk3/rh4（来自rh1）与rk1/rg5（来自rg3）。原生皂苷中c-20位被糖基保护时脱水极难发生，本发明通过时序酶解将rh1和rg3的c-20位羟基充分暴露，为脱水提供了专一底物。因此该脱水步骤具有底物依赖性，不会引发其他位点随机脱水，产物谱可控。

21、所述步骤s4中，所述非极性树脂可以为d101树脂，所述弱极性树脂可以为ab-8树脂；因此，所述复合树脂为d101树脂与ab-8树脂的混合物，d101树脂与ab-8树脂的质量比为（1~5）:1，更优选为3:1。混合树脂对rh1、f1、rk3、rh4的吸附容量较单一d101树脂提高20%以上。

22、上样量为每毫升树脂上样0.1~0.3 g生药对应的酶解转化液；洗脱流速为0.5~2bv/h；梯度洗脱具体程序包括：依次用纯水0.5~2 bv，20%乙醇3~5 bv，60%乙醇3~5 bv，70%乙醇3~5 bv，95%乙醇2~4 bv进行洗脱，合并60%~95%乙醇洗脱液。

23、进一步的，所述方法还包括对步骤s4的产物进行浓缩、干燥和粉碎的步骤，从而得到红参稀有皂苷粉。

24、本发明的第二个方面，提供上述方法在制备富含多种红参稀有皂苷产品中的应用。所述稀有红参皂苷包括人参皂苷rh1、人参皂苷f1、人参皂苷f2、20(s)-人参皂苷rg3、20(s)-人参皂苷rh2、人参皂苷c-k、人参皂苷rk3、人参皂苷rh4、人参皂苷rk1和人参皂苷rg5。

25、所述产品可以为食品或药品，所述食品可以为保健食品，在此不做具体限定。

26、与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：

27、上述技术方案通过第一阶段α-l-鼠李糖苷酶将re水解为rg1，使原本在单一β-葡萄糖苷酶体系中无法被利用的re也可作为后续酶解反应的有效底物，从而将10种目标稀有皂苷的总得率从单一酶体系的约1.89%提升至2.92%，显著提高了原料利用率；同时，上述技术方案通过时序分步酶解与加热保温同步灭活脱水的耦合设计，实现了糖苷键有序水解与c-20位脱水的连续完成，能够在一次工艺中同时稳定获得10种目标稀有皂苷，产物谱完整；在此基础上，采用d101与ab-8复合树脂（3:1）进行梯度洗脱，进一步发挥了复合树脂的协同吸附效应，有效去除了干扰杂质，使最终产物中10种稀有人参皂苷的总含量达到95%以上，同时稀有皂苷粉的得率稳定在2.5%以上（以红参药材计），实现了高纯度与高得率的协同统一；此外，三批放大验证结果表明，得率rsd为2.3%、总含量rsd为0.5%，工艺稳定可放大，具有良好的工业化应用前景。