用于植物基于染色质模块介导的表观重塑与长效转录沉默的复合表达系统及其应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种用于植物基于染色质模块介导的表观重塑与长效转录沉默的复合表达系统及其在稳定外源基因表观状态及压制内源有害转座子中的应用。

背景技术：

1、在植物基因工程与育种改良中，外源基因的稳定表达与基因组完整性的维持是两大核心诉求。然而，植物基因组中广泛存在着大量的转座子（transposable elements,tes）和重复序列。在逆境胁迫（如高温、干旱）下，这些本该沉寂的有害转座子容易发生非特异性激活和“跳跃”，从而破坏植物基因组的稳定性和正常的发育网络。另一方面，通过遗传转化新插入植物基因组的外源目的基因，往往缺乏稳定的表观遗传上下文（epigeneticcontext），即缺乏维持表观稳态所需的特定染色质模块（chromatin modules），极易发生表达量剧烈波动或在传代过程中被宿主逐渐识别并触发转录后基因沉默。

2、目前，植物界主要依靠依赖于rna介导的dna甲基化途径（rddm途径）来压制上述异常序列。但rddm途径高度依赖复杂的前体小rna（sirna）的加工、转运和靶向匹配。在人工基因组编辑或多基因回路设计中，若要对全局的大量位点或未知的外源序列进行表观稳态重塑，依靠设计海量的特异性sirna既不现实，也极易造成严重的转录紊乱。

3、因此，本领域亟需一种全新的、不依赖小rna引导的、基于底层染色质模块组装的表观遗传重塑工具。该工具应当能够自发感知特定的基因组环境（如游离的外源插入片段或富集的转座子区），利用蛋白质机器自身的空间锚定和催化特性，在靶位点强行沉积抑制性标记，实现长效、可跨代遗传的常染色质向异染色质的同化与转录沉默，最终在靶序列上从头建立起高度凝聚的抑制性染色质模块。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种自发识别、物理串联且双向互锁的用于植物基于染色质模块介导的表观重塑与长效转录沉默的复合表达系统及其在调控植物基因转录沉默、压制有害转座子、稳定外源表达回路表观状态中的具体应用，以克服现有技术中依赖sirna途径进行表观沉默效率低下、通用性差的缺陷。

2、本发明提供的用于植物基于染色质模块介导的表观重塑与长效转录沉默的复合表达系统，利用从头甲基化与组蛋白修饰的双向驱动机制，在无需内源小rna引导下，自发在特定基因组区域（如外源插入序列或转座子区域）建立可跨代稳定遗传的异染色质稳态并阻断其转录，该系统包括协同表达的如下四个组件：

3、（1）组蛋白h3k9甲基转移酶组件，用于写入并沉积h3k9me2组蛋白抑制标记；

4、（2）从头（de novo）dna甲基转移酶组件，用于无模板沉积非cg序列环境的dna甲基化修饰；

5、（3）第一表观修饰识别与空间锚定蛋白组件，具有甲基化dna识别活性，用于物理锚定并协同招募；

6、（4）第二表观修饰识别与空间锚定蛋白组件，具有甲基化dna识别活性，与所述第一锚定蛋白组件协同，加固异染色质复合体的空间组装。

7、进一步地：

8、所述组蛋白h3k9甲基转移酶组件，为含有set催化结构域和sra甲基化识别结构域的甲基转移酶；

9、所述从头dna甲基转移酶组件，为具有dna甲基化从头催化活性的甲基转移酶；

10、所述第一和第二表观修饰识别与空间锚定蛋白组件，均为含有sra结构域且自身无组蛋白甲基化催化活性的骨架蛋白。

11、进一步地：

12、所述组蛋白h3k9甲基转移酶组件，为拟南芥来源的suvh4蛋白，或其具有h3k9甲基转移酶活性的片段；

13、所述从头dna甲基转移酶组件，为拟南芥来源的drm2蛋白，或其具有dna甲基化从头催化活性的片段；

14、所述第一表观修饰识别与空间锚定蛋白组件，为拟南芥来源的suvh9蛋白，或其具有甲基化dna结合活性的片段；

15、所述第二表观修饰识别与空间锚定蛋白组件，为拟南芥来源的suvh2蛋白，或其具有甲基化dna结合活性的片段。

16、进一步地，各组件在表达时分别融合连接有不同的检测和指示标签，其中：

17、所述suvh4蛋白融合连接有绿色荧光蛋白变体gfp；

18、所述suvh9蛋白融合连接有检测标签flag；

19、所述drm2蛋白融合连接有检测标签myc；

20、所述suvh2蛋白融合连接有检测标签ha。

21、进一步地，所述四个组件的转录表达盒被物理串联并整合至单一的植物重组双元表达载体中，各组件由独立的植物启动子驱动，以实现单载体介导的多基因表观重塑复合体的高效协同表达。

22、本发明还提供上述复合表达系统在调控植物基因组转录沉默与稳态重塑中的应用。

23、具体地，包括：

24、（1）阻断或沉默新转入的外源目的基因位点的异常非特异性转录，以建立并稳定外源位点的异染色质状态；

25、（2）在逆境或热压力条件下，自发识别并协同压制植物内源有害转座子（tes）的非特异性转录和跳跃激活；

26、（3）同化植物常染色质区域，使其重塑为高度凝聚的异染色质结构；

27、（4）精准沉默外源侵染的病毒基因组，以提高植物的抗病毒防御能力。

28、进一步地，本发明还提供一种在植物细胞中建立长效异染色质稳态并实施转录沉默的方法，具体地，将含有上述复合表达系统中所述组件的单一重组双元表达载体导入植物细胞中进行协同表达。

29、所述单一重组双元表达载体的具体构建方式及结构特征为：

30、以植物双元表达载体（优选为pqtbd2）为基础骨架，在其t-dna区域内通过同源重组（homologous recombination, hr）技术，物理拼装四个独立的转录表达盒。所述四个转录表达盒均由独立的植物强启动子（如拟南芥pubq10启动子）驱动，具体包含：

31、（1）表达盒 a：由拟南芥强启动子pubq10驱动的、c端融合有绿色荧光蛋白变体的甲基转移酶表达盒pubq10-suvh4-gfp；

32、（2）表达盒 b：由启动子pubq10驱动的、c端融合有flag纯化检测标签的锚定蛋白表达盒pubq10-suvh9-flag；

33、（3）表达盒 c：由启动子pubq10驱动的、c端融合有myc检测标签的从头甲基转移酶表达盒pubq10-drm2-myc；

34、（4）表达盒 d：由启动子pubq10驱动的、c端融合有ha纯化检测标签的锚定蛋白表达盒pubq10-suvh2-ha。

35、此外，所述单一双元表达载体骨架上搭载有用于植物稳定转化筛选的植物选择性抗性标记基因（如草铵膦抗性基因，basta），以及用于原核生物扩增筛选的细菌抗性标记基因（如壮观霉素抗性基因，spectinomycin）。该载体构建方案成功克服了多基因大型复合质粒在组装过程中的重组与断裂瓶颈，确保了四大表观修饰组件在单一载体上的稳定串联，从而实现植物细胞内的高效协同表达。

36、本发明与现有技术相比，具有如下极其显著的有益效果：

37、彻底摆脱对小rna的依赖：本系统放弃了复杂的crispr或小rna定点引导，利用表观识别因子自发的底层物理亲和力搜寻特定游离位点，直接实施大面积的异染色质重塑，从而在靶区快速建立起极度致密的抑制性染色质模块，在全局抑制转座子爆发和外源序列稳态化领域具有得天独厚的通用性。

38、极简的高效单载体装配：本发明攻克了四基因大型复合质粒组装的技术瓶颈，将多达四个庞大的表观修饰因子（suvh4/suvh2/suvh9/drm2）串联在同一载体上并成功表达，极大地提升了转基因工程的转化效率与后代遗传稳定性。