胶胞刺盘孢复合群物种鉴定用分子标记及其应用

本发明涉及植物病原生物检测技术，特别涉及一种胶胞刺盘孢复合群物种鉴定用高分辨率分子标记及其应用。

背景技术：

1、胶胞刺盘孢复合群（colletotrichum gloeosporioides species complex）是一类重要的刺盘孢属病原类群，复合群内有超过50个种，在全球普遍分布，侵染为害苹果、梨、草莓、茶、烟草、芒果、牛油果等大量的经济作物。

2、胶胞刺盘孢复合群内物种分化水平较低，种间遗传距离短，形态学特征差异不明显，单纯its标记难以有效区分近缘种，物种鉴定严格依赖于多基因系统发育分析，技术较为复杂。

3、常用的物种鉴定标记包括核糖体dna基因转录间隔区（intergenic spacerregion, its）、肌动蛋白（actin）、β-微管蛋白（β-tubulin）、甘油三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gadph）、钙调蛋白（calmodium, cal）、几丁质合酶（chitin synthase, chs-1）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, gs）、超氧化物歧化酶（manganese-superoxide dismutase, sod2）等。

4、多基因系统发育分析是目前准确鉴定胶胞刺盘孢复合群物种的唯一手段。运用该技术进行物种鉴定，需要对待检菌株的6-8个靶基因进行pcr扩增，再对获得的目标dna片段进行测序，最后结合参照菌株进行系统发育分析，根据系统发育分析结果进行物种判定。该技术手段结果可靠，但步骤繁琐，技术复杂，且费时费力，对分析人员的专业背景要求较高。

技术实现思路

1、针对现有的技术不足，本发明的目的是提供一种新的高多态性且恒速进化的基因标记，可以实现单基因系统发育分析准确物种鉴定的目的，减少物种鉴定的技术复杂性。

2、为此，本发明所提供的胶胞刺盘孢复合群物种鉴定序列为seq id no.1所示序列。该序列为物种果生刺盘孢的基因，其同源基因（与seq id no.1所示序列同源性大于等于88.3%）在胶胞刺盘孢复合群物种中普遍存在，且有高多态性和恒速进化的特征。

3、进一步，本发明还提供了根据上述基因及其同源基因比对结果设计的pcr扩增引物。

4、具体的，所述pcr扩增引物包括引物p1-f和引物p1-r，所述引物p1-f的序列如seqid no.2所示，所述引物p1-r的序列如seq id no.3所示。

5、同时，本发明还提供了上述基因及引物鉴定胶胞刺盘孢复合群物种的应用。

6、相关鉴定方法包括：

7、（1）从待测菌株材料中提取基因组dna；

8、（2）以待测菌株的基因组dna为模板，用上述引物进行pcr扩增和sanger测序；

9、（3）基于sanger测序结果，与参照物种序列进行dna序列多重对位和基因系统发育分析，根据系统发育树分支方式判定菌株的物种分类地位。

10、更进一步，本发明提供了上述引物用于制备胶胞刺盘孢复合群物种鉴定试剂盒的应用。

11、另一方面，本发明又提供了一种胶胞刺盘孢复合群物种鉴定试剂盒。所提供的试剂盒包括pcr扩增试剂和上述引物。

12、相比于现有技术，本发明至少具有下列有点及有益效果：

13、（1）本发明提供一种胶胞刺盘孢复合群高分辨率且有匀速进化特征的基因标记，可实现单一分子标记对近缘物种的有效区分，有效弥补了多基因系统发育手段技术复杂的缺点；

14、（2）本发明鉴定步骤简单准确，成本低廉，无需对多个基因位点进行pcr扩增，便于高通量分析，易于推广；

15、（3）本发明可应用于农业科研中的高通量、无偏差物种多样性分析，可为田间病害多样性调查、有害生物检验等提供重要依据。

1.一个在胶胞刺盘孢复合群各物种间高多态性且近匀速进化的基因，其特征在于，所述基因序列为seq id no.1所示序列。

2.权利要求1所述基因及其近缘种基因序列鉴定胶胞刺盘孢复合群物种的应用，所述近缘种基因序列与seq id no.1所示序列的碱基同源性大于等于88.3%。

3.权利要求1及其近缘种基因序列的pcr扩增引物，所述近缘种基因序列与seq idno.1所示序列的同源性大于等于88.3%。

4.如权利要求2所述的pcr扩增引物，其特征在于，包括引物p1-f和引物p1-r，所述引物p1-f的序列如seq id no.2所示，所述引物p1-r的序列如seq id no.3所示。

5.权利要求3或4所述引物鉴定胶胞刺盘孢复合群物种的应用。

6.一种菌种鉴定方法，其特征在于，包括：

7.权利要求2或3所述引物用于制备胶胞刺盘孢复合群物种鉴定试剂盒的应用。

8.一种胶胞刺盘孢复合群物种鉴定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括pcr扩增试剂和权利要求2或3所述引物。