一种酶酵耦合协同原位糖基化修饰制备的黄芪糖多肽及其制备方法和应用

本发明涉及一种糖多肽及其制备方法和应用，具体涉及一种酶酵耦合协同原位糖基化修饰制备的黄芪糖多肽及其制备方法和应用，属于生物工程。

背景技术：

1、黄芪多糖（aps）具有抗氧化、抑制nf-kb、激活nrf2通路的作用，可缓解ccl4、对乙酰氨基酚诱导的化学肝损伤。

2、黄芪小分子多肽、粗提物具有护肝、抗炎活性。

3、将黄芪多糖与黄芪小分子多肽（或粗提物）物理混合，虽然能够用于化学性肝损伤保护，但混合物进入消化道后快速解离，仅能实现抗氧化、抗炎效果简单叠加，同时存在多肽易被消化酶降解、制剂易分层不稳定、口服生物利用度低、重度化学肝损伤修复效果弱、原料投料成本高等多重固有缺陷。

4、糖多肽是糖类单元与多肽链通过共价键结合形成的复合活性物质，兼具多肽与多糖双重结构特征与理化特性，分子结构稳定，活性作用位点丰富。现有研究及应用证实，糖多肽具有优良的抗氧化、免疫调节、血糖调节等生理活性，且生物相容性好、人体吸收率高，作为一种新型绿色基料，在生物医药与大健康领域具有极高的开发价值和广阔的市场应用前景。

5、现有研究表明，灵芝糖多肽、枸杞糖多肽对酒精、代谢性肝损伤具有保护作用。然而，有关黄芪来源的黄芪糖多肽及其对化学药物、毒物诱导的急性化学性肝损伤是否具有保护作用尚未见报道。

6、现阶段糖多肽主流制备工艺存在诸多技术缺陷：

7、（1）化学合成制备方式：工艺步骤繁杂、制备成本高昂，生产过程易产生有害副产物，与绿色生物制造发展理念相悖。

8、（2）单一酶解制备工艺：工艺调控难度大，所得产物生物活性稳定性不佳，分子量分布范围较宽，产品均一性差。

9、（3）纯微生物发酵制备工艺：原料底物利用率偏低，生产周期较长，整体转化制备效率难以满足工业化需求。

10、（4）传统酶酵耦合工艺：普遍采用分步顺序加工模式，仅实现酶解与发酵工序简单组合，无法实现反应体系、工艺参数及作用机理的协同适配优化。

11、（5）传统化学糖基化：反应条件要求苛刻，位点定向修饰能力弱，副产物产出量大，大幅提升后续分离纯化难度；且该工序多后置实施，难以与前端生物转化过程协同联动，工艺整体集成度较低。

12、因此，亟需开发一种综合高效的糖多肽绿色基料制备工艺，突破现有技术瓶颈，实现糖多肽规模化、产业化生产与普及化应用。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的第一个目的在于：提供一种对化学药物、毒物诱导的急性化学性肝损伤具有更好保护作用的黄芪糖多肽，本发明的第二个目的在于：提供一种综合高效的酶酵耦合协同原位糖基化修饰制备前述黄芪糖多肽的方法。

2、为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

3、一种酶酵耦合协同原位糖基化修饰制备黄芪糖多肽的方法，包括以下步骤：

4、（1）匀浆：将黄芪粉碎，按料液比1：1加入40℃温水恒温浸泡12h，获得预处理料液，然后用胶体磨对预处理料液进行研磨，获得匀浆液；

5、（2）温水浸提：按体积比1：5向匀浆液中加入水，在60℃下浸提3h，获得水提液；

6、（3）酶酵耦合反应：向水提液中添加复合生物酶和复合微生物发酵剂，调控体系温度37℃、ph值6.5，同步酶酵反应24h，获得酶酵产物；

7、（4）原位糖基化修饰：酶酵耦合反应结束后，立即向酶酵产物体系中加入复合糖基转移酶，设定反应温度60℃、ph值8.0，酶促接枝反应8h，随后迅速升温至80℃，搅拌交联熟化3h，结束后自然冷却至室温，获得糖基化修饰产物；

8、（5）分离纯化：依次用蝶式离心机、管式离心机、微滤陶瓷膜、超滤陶瓷膜、纳滤陶瓷膜对糖基化修饰产物体系进行逐级分级纯化过滤，获得糖多肽浓缩液；

9、（6）对糖多肽浓缩液进行喷雾干燥或真空冷冻干燥，得到糖多肽干粉。

10、优选的，在步骤（1）中，用胶体磨进行研磨的工序如下：输送泵按300l/h匀速送料，先设定研磨间隙0.2-0.3mm、运转速度3000r/min，进行一次细磨，然后调节研磨间隙0.10-0.15mm、运转速度4000r/min，进行两次精磨。

11、优选的，在步骤（3）中，复合生物酶由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配而成，添加量为水提液质量的0.5%；按质量计，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的复配比例为 2：1：2：2：1或1：2： 3：3：2。

12、优选的，在步骤（3）中，复合微生物发酵剂由复合发酵菌种在mrs培养基中发酵获得，接种量为水提液体积的3%，复合发酵菌种由植物乳杆菌 lhp710、副干酪乳杆菌 sq01、鼠李糖乳杆菌 sq02、热带假丝酵母 cicc31854、发酵毕赤酵母 cicc33372复配而成，其中，植物乳杆菌 lhp710于2021年6月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，保藏编号为cctcc no：m 2021675，分类命名为植物乳杆菌 lhp710 lactobacillusplantarum lhp710，副干酪乳杆菌 sq01于2024年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，保藏编号为cctcc no：m 2024934，分类命名为副干酪乳杆菌 sq01lactobacillus paracasei sq01，鼠李糖乳杆菌 sq02于2024年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，保藏编号为cctcc no：m 2024933，分类命名为鼠李糖乳杆菌 sq02 lactobacillus rhamnosus sq02；按质量计，植物乳杆菌 lhp710、副干酪乳杆菌sq01、鼠李糖乳杆菌 sq02、热带假丝酵母 cicc31854和发酵毕赤酵母 cicc33372的复配比例为2：2：2：1：1或1：1：4：2：3。

13、优选的，在步骤（4）中，复合糖基转移酶由β-半乳糖基转移酶、转谷氨酰胺酶、α-甘露糖苷酶、α-葡萄糖基转移酶、木糖基转移酶复配而成；按质量计，β-半乳糖基转移酶、转谷氨酰胺酶、α-甘露糖苷酶、α-葡萄糖基转移酶和木糖基转移酶的复配比例为2：2：1：3：3或1：3：3：2：1。

14、优选的，在步骤（5）中，微滤陶瓷膜的孔径为0.2μm，超滤陶瓷膜和纳滤陶瓷膜的截留分子量分别为10kda、300da，膜分离全程体系温度控制在40℃、ph值维持在6.5-8.5范围内。

15、一种黄芪糖多肽，由前述方法制备得到。

16、前述黄芪糖多肽的应用，包括：

17、（1）制备抗氧化药物；

18、（2）制备降血压药物；

19、（3）制备化学性肝损伤保护药物。

20、本发明的有益之处在于：

21、（1）黄芪糖多肽的制备过程全程以深度酶解与发酵、酶促反应及物理膜分离为主，无化学有机溶剂添加，生产废液易处理，符合绿色生产标准。

22、（2）本发明将提取-反应-分离环节构建为一体化集成制备体系，实现了高效协同并具有连续性、适配性。有效解决了传统工序衔接脱节、中间产物损耗高、生产流程繁琐等缺陷，实现了从药食同源原料到糖多肽的一体化绿色高效制备。

23、（3）本发明复配破壁酶、多糖降解酶与蛋白酶，同步实现了内源多糖与蛋白的小分子化，结合复合菌种协同发酵，优化底物结构与反应环境，提升了多肽及糖基供体产出效率。采用低温酶促接枝结合升温交联熟化的分段糖基化，强化糖肽共价结合，有效提升了产物结构稳定性。

24、（4）本发明采用陶瓷膜梯度分离纯化，通过微滤-超滤-纳滤多级陶瓷膜错流分离，依据分子量精准分级除杂、脱盐、浓缩，全程低温运行，最大程度保留了生物活性，同时提升了产物纯度与收率。

25、（5）本发明制备的黄芪糖多肽经酶酵耦合与糖基化双重改性后，水溶性、分散性、热稳定性显著提升，相较于普通植物多肽、多糖，体内吸收利用率更高，制备体系最大程度保留天然活性物质，经微生物发酵后又增加新的活性物质（例如：小分子有机酸、微生物源胞外多糖、功能性活性寡肽等），且成品含水率、粉体流动性、粒度均可精准调控。

26、（6）本发明制备得到的黄芪糖多肽干粉，具有抗氧化、抗疲劳、缓解化学性肝损伤等功能，可广泛应用于生物医药与大健康领域。