一种延长山羊豆新根瘤菌HWHS1菌液常温保存时间的保护剂及其应用的制作方法

本申请涉及微生物发酵的，尤其涉及一种延长山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液常温保存时间的保护剂及其应用。

背景技术：

1、山羊豆新根瘤菌是与花生专一性共生固氮的核心功能性微生物，可将空气中惰性氮气转化为花生可直接吸收利用的化合态氮，显著减少化学氮肥施用，改良根际土壤微生态，提升花生产量与品质，在生态农业、绿色种植、化肥减量增效领域具备极高应用价值。

2、目前市面上见到的根瘤菌产品，大多是以冻干粉、固体颗粒或泥炭吸附剂型的形式出售，很少见到液体形态的产品。主要原因在于，根瘤菌这类微生物天生比较“娇贵”——它们习惯了在植物根部生活，脱离宿主环境后抗逆性弱、自主生存能力较差。常规未添加任何保护剂成分的液态根瘤菌菌剂在常温仓储、运输条件下，菌体易发生应激凋亡，有效活菌数衰减速率快，自然常温储存1个月即出现大规模菌体死亡，储存3个月后有效活菌数仅为2-5亿/ml，远低于农业应用的有效活菌标准，无法满足田间规模化施用要求。

3、现有根瘤菌保活技术高度依赖严苛的低温、无氧、干燥保存条件，主流保活方式包括低温冷链冷藏、真空冷冻干燥、泥炭等固体介质吸附保存。上述技术均存在明显缺陷：低温冷藏需要全程冷链配套，生产、仓储、物流成本高，偏远地区适用性差；真空冷冻干燥工艺流程复杂、能耗高、菌体机械损耗大，且产品使用前需复水活化，操作繁琐、时效性差；固体吸附剂型有效活菌载量低、释放缓慢、固氮起效滞后。

4、现阶段行业内缺乏适配山羊豆新根瘤菌hwhs1菌株特性的专用液态复合保护体系，无法实现常温长效稳定保活，严重制约了高活性液态根瘤菌菌剂的工业化生产与大面积推广应用。

5、因此，开发一种能够使山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂在常温下长期稳定保存的保护剂，具有重要的现实意义和产业化价值。

技术实现思路

1、本申请提供一种延长山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液常温保存时间的保护剂及其应用。本申请通过多组分协同复配与工艺优化，构建适配山羊豆新根瘤菌hwhs1的常温长效保活体系，无需冷链、冻干等复杂工艺，显著提升液态菌剂常温货架期与活菌留存率。

2、第一方面，本申请提供一种延长山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液常温保存时间的保护剂，采用如下技术方案：

3、一种延长山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液常温保存时间的保护剂，所述保护剂包括1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮k30和抗坏血酸钠。

4、本申请将1,4-哌嗪乙磺酸二钠与吗啉乙磺酸钠盐（作为两性离子缓冲体系，稳定发酵液渗透压和ph环境）、聚乙烯吡咯烷酮k30（pvp k30，作为高分子保护剂，可在菌体表面形成柔性保护层，防止菌体机械损伤和胞内物质外渗）以及抗坏血酸钠（作为强效抗氧化剂，清除胞外自由基）进行复配。上述四种组分形成“渗透保护+物理包埋+抗氧化”的三重协同防护体系，显著延长了菌液的常温保存时间。

5、可选地，所述1,4-哌嗪乙磺酸二钠的浓度为0.1-0.3g/l。

6、可选地，所述1,4-哌嗪乙磺酸二钠的浓度为0.15-0.25g/l。

7、可选地，所述吗啉乙磺酸钠盐的浓度为1-3g/l。

8、可选地，所述吗啉乙磺酸钠盐的浓度为1.5-2.5g/l。

9、可选地，所述聚乙烯吡咯烷酮k30的浓度为1-3g/l。

10、可选地，所述聚乙烯吡咯烷酮k30的浓度为1.5-2.5g/l。

11、可选地，所述抗坏血酸钠的浓度为0.1-0.5g/l。

12、可选地，所述抗坏血酸钠的浓度为0.2-0.4g/l。

13、经过试验分析可知，1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮k30和抗坏血酸钠的浓度低于下限时，保护效力不足；高于上限时，不仅增加成本，还可能因渗透压过高或组分过量对菌体产生轻微抑制作用。故结合成本与最优效果，限定了上述优选范围。

14、第二方面，本申请提供上述保护剂在制备高稳定性山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂中的应用。

15、将该保护剂应用于高稳定性液态菌剂的制备中，解决了现有根瘤菌产品（如冻干粉、泥炭剂）在液态形式下常温无法长期保存的行业痛点，大幅降低了冷链运输和储藏成本。

16、第三方面，本申请提供一种高稳定性山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂。所述液态菌剂包括山羊豆新根瘤菌hwhs1活菌以及上述保护剂。所述液态菌剂在15-30℃常温条件下保存3个月后，有效活菌数不低于30亿/ml；保存6个月后，有效活菌数不低于20亿/ml。

17、基于上述保护剂制得的液态菌剂，具有优异的常温货架期，在无需额外添加保护载体的情况下，即可满足“3个月有效活菌数不低于20亿/ml”的农业施用标准，具备极高的商业化落地价值。

18、第四方面，本申请提供一种山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液的常温保护方法，采用如下技术方案：

19、一种山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液的常温保护方法，将上述保护剂应用于山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂制备过程中。

20、可选地，所述常温保护方法具体为：采用分步添加的方式将所述保护剂加入山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液中，具体为：在所述发酵培养基灭菌前，将1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮k30加入所述发酵培养基，随所述发酵培养基高温高压灭菌；发酵完成后，将过滤除菌后的抗坏血酸钠母液加入发酵后的菌液。

21、采用分步添加的工艺是因为抗坏血酸钠在高温高压（121℃）灭菌条件下极易被氧化分解而失去抗氧化活性。因此，将耐高温的1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐和pvpk30与培养基同灭菌，而将抗坏血酸钠通过过滤除菌方式在发酵完成后加入，既保证了各组分活性不被破坏，又保障了最终产品的无菌指标。

22、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

23、（1）本申请的液态菌剂产品能够在15-30℃常温条件下实现长效保存，在保存6个月后，有效活菌数依然不低于20亿/ml，彻底改变了传统根瘤菌液态菌剂常温存放1个月即出现大规模死亡的窘境。

24、（2）本申请的液态菌剂产品配方简洁、原料易得、成本较低，其制备方法中仅需采用“耐热组分随培养基灭菌、热敏组分分步过滤添加”的常规工艺，无需依赖昂贵的大型冻干设备或全程冷链，极大降低了企业的生产与储运成本。

25、（3）本申请的保护剂通过多重组分的协同作用，能全面、稳定地保护山羊豆新根瘤菌hwhs1细胞在常温静置状态下的活力，所制备的液态菌剂产品可直接施用于田间，无需复水活化，使用极为便捷，适合大面积的农业推广。

1.一种延长山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液常温保存时间的保护剂，其特征在于，所述保护剂包括1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮k30和抗坏血酸钠。

2.根据权利要求1所述保护剂，其特征在于，所述1,4-哌嗪乙磺酸二钠的浓度为0.1-0.3g/l；

3.根据权利要求1所述保护剂，其特征在于，所述吗啉乙磺酸钠盐的浓度为1-3g/l；

4.根据权利要求1所述保护剂，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮k30的浓度为1-3g/l；

5.根据权利要求1所述保护剂，其特征在于，所述抗坏血酸钠的浓度为0.1-0.5g/l；

6.一种权利要求1-5中任一项所述保护剂在制备高稳定性山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂中的应用。

7.一种高稳定性山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂，其特征在于，所述液态菌剂包括山羊豆新根瘤菌hwhs1活菌以及权利要求1-5中任一项所述的保护剂。

8.根据权利要求7所述的液态菌剂，其特征在于，所述液态菌剂在15-30℃常温条件下保存3个月后，有效活菌数不低于30亿/ml；保存6个月后，有效活菌数不低于20亿/ml。

9.一种山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液的常温保护方法，其特征在于，将权利要求1-5中任一项所述保护剂应用于山羊豆新根瘤菌hwhs1液态菌剂制备过程中。

10.根据权利要求9所述山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液的常温保护方法，其特征在于，所述常温保护方法具体为：采用分步添加的方式将所述保护剂加入山羊豆新根瘤菌hwhs1菌液中，具体为：在所述发酵培养基灭菌前，将1,4-哌嗪乙磺酸二钠、吗啉乙磺酸钠盐、聚乙烯吡咯烷酮k30加入所述发酵培养基，随所述发酵培养基高温高压灭菌；发酵完成后，将过滤除菌后的抗坏血酸钠母液加入发酵后的菌液。