双靶标CAR-T细胞在治疗B细胞自身免疫性疾病中的用途的制作方法

car-t细胞可用于治疗或预防b细胞自身免疫性疾病。在特定实施方案中，双靶标或双特异性car可用于治疗自身免疫性疾病，诸如系统性红斑狼疮、肌炎、硬皮病或系统性硬化症（ssc）、重症肌无力和肾炎。

背景技术：

1、免疫系统必须首先识别外来物质或危险物质，以便保护身体免受外来物质或危险物质的影响。这些物质包括细菌、病毒、寄生虫（诸如蠕虫）、一些癌细胞、以及甚至移植的器官和组织。这些物质具有可被免疫系统识别的分子，并且可刺激免疫系统的应答。这些分子被称为抗原。抗原可被包含在细胞中或在细胞（诸如细菌或癌细胞）的表面上或作为病毒的组成部分。

2、当一些白细胞（b细胞和t细胞）遇到抗原时，其将知道如何攻击抗原，从而保护身体免受潜在危险的抗原的攻击。b细胞产生抗体，其是人体对抗抗原的主要免疫防御机制中的一个主要免疫防御机制。抗体与特异性抗原紧密结合，并标记它们以进行攻击或直接中和。身体产生成千上万种不同类型的抗体。每种抗体对特异性抗原具有特异性。免疫系统中的细胞将记住特异性抗原，使得这些细胞在下次遇到这些特异性抗原时可更有效攻击。

3、人自身组织中的细胞也具有抗原。在正常情况下，免疫系统仅对外来物质或危险物质起反应，而不会对其自身组织的抗原起反应。然而，有时会发生免疫功能障碍，将自身组织视为外来物，从而产生攻击自身细胞或组织的抗体（也被称为自身抗体）或免疫细胞。该应答被称为自身免疫性应答。其导致炎症和组织损伤。该应答可能会导致自身免疫性疾病。

4、目前已发现了许多自身免疫性疾病，这些自身免疫性疾病可以是将影响皮肤、关节、肾和中枢神经系统的系统性自身免疫性疾病（诸如系统性红斑狼疮）；这些自身免疫性疾病也可以是主要影响身体的胰腺健康的机体自身免疫性疾病（诸如1型糖尿病）。b细胞或t细胞的耐受性丧失通常与自身免疫有关。事实上，人白细胞抗原（hla）基因座通常与自身免疫性疾病的风险增加直接相关。

5、目前，用于自身免疫性疾病的免疫调节药物是范围广泛且非疾病特异性的，并且通常会引起诸如感染、恶性疾病等副作用。显然，大多数患者对这些治疗的应答不理想，或者甚至根本无应答。因此，研究人员迫切需要通过对患有特殊自身免疫性疾病的患者进行分子和临床研究，并结合高通量的综合数据库分析来开发新药或重新定位的药物。而且，个体化药物与新的诊断方法相互补充，从而有助于研究人员更好地分析自身免疫性疾病的发病机制，并且同时研究人员需要进行更多以患者为中心的相关临床试验。自身免疫性疾病的预防也应当是早期干预的一部分。在本文中，研究人员解释了目前疗法的不同类型（诸如合成药物、细胞疗法、靶向代谢途径和微生物组以及其他策略，并且也强调了基础研究、新技术和临床试验的动态结合），从而有助于更多地了解自身免疫性疾病的发病机制，并开发新的疗法。

6、目前，研究人员越来越多地意识到自身免疫性疾病的复杂性，但目前的治疗仅基于简化且还原论式的病理学理解和知识；在临床实践中，患者通常利用递增反应的试错法进行治疗，其以不同的常规缓解病情的药物（诸如用于类风湿性关节炎的甲氨蝶呤、用于治疗多发性硬化症的干扰素b和用于治疗炎症性肠病和银屑病的皮质类固醇）开始。如果患者应答不足，研究人员将升级新药，诸如jak抑制剂或生物药物。这些药物中的所有药物具有广谱作用，但其不是疾病特异性的，并且通常具有某些副作用。与已经进入肿瘤学研究领域的个体化疗法相比，这些药物可能缺乏个体化特征。因此，为了实现对自身免疫性疾病患者更特定且更个性化的治疗，研究人员需要了解个体自身免疫性疾病的复杂性以及不同患者的疾病表现。

7、系统性红斑狼疮（sle）是一种累及多个器官的自身免疫性炎症性结缔组织病，其发病机制复杂，主要与免疫系统对内源性抗原的错误识别、自身反应性b细胞的出现以及自身抗体的产生密切相关。sle的发病年龄大多是20岁至40岁，具有明显的性别倾向，男女比率为约1:9-12。根据文献统计，sle的全球患病率为约43.7/10万人/年，不同地区差异较大：北美洲为约3.7/10万人/年至4.9/10万人/年，欧美为约1.5/10万人/年至7.4/10万人/年，中亚为约15.9/10万人/年，热带拉丁美洲为约110.82/10万人/年。中国的患病率为约47.53/万人/年，并且总患者数量为约700,000人。

8、sle为免疫介导的系统性疾病，其可引起皮肤、肾、血液和骨骼肌系统的各种异常。sle的临床症状为异质性的，具有很大的个体差异。系统性红斑狼疮的常见症状可包括关节痛和关节炎、颊皮疹和其他皮疹、胸膜炎或心包炎、肾或中枢神经系统受累、以及血系统血细胞减少症。系统性红斑狼疮的表现形式为多变的，并且疾病的急性复发和缓解经常在疾病过程中交替发生。sle的严重程度差异很大，由于累积的器官损伤和凝血缺陷，可能带来很大的挑战，并且根据器官受累的严重程度可能是致命的。

9、sle的治疗状态

10、目前，除了非甾体类抗炎药、低剂量激素和免疫抑制剂外，还推荐长期使用羟氯喹（hcq）作为sle的基本治疗。环磷酰胺可用作严重sle的初步治疗或当其他药物失效时用作抢救治疗。然而，仍有少量的危重症患者或难治性患者对上述传统药物治疗应答不良且预后不良，并且与非选择性免疫抑制剂相关的不良反应（诸如感染和代谢异常）随着用药时间的延长而逐渐增加。在传统治疗的基础上，免疫靶向疗法也越来越多地应用于临床中。然而，传统免疫抑制剂（诸如地塞米松、环磷酰胺和抗cd20特异性抗体）虽然可清除短寿命浆母细胞和浆细胞，但无法完全清除分泌自身抗体的抗体分泌细胞asc（包括长寿命浆细胞（llpc）），导致sle复发，从而无法在临床上获得长期的显著作用。综上所述，改善系统性红斑狼疮的治疗特别重要。

11、由car-t细胞治疗sle的靶标选择原因

12、b细胞通过抗体依赖性功能和非抗体依赖性功能在sle的发病机制中起主要作用。

13、在b细胞发育期间自身耐受性的缺乏会导致自身免疫的发生和自身抗体的产生。抗核抗体（ana）是细胞核中针对dna、rna、蛋白质或这些物质的分子复合物的自身抗体，并且其是sle的主要血清学标记物。ana长期以来被发现用于狼疮的诊断，并且其在sle中的作用越来越受到关注。首先，许多自身免疫性疾病的血液系统症状（诸如库氏阳性（抗人球蛋白或红细胞）溶血性贫血和免疫性血小板缺乏症）是由自身抗体直接驱动的。其次，狼疮肾炎的固有组织病理学特征是由许多亚型的免疫球蛋白组成的肾小球免疫复合物的显著存在。在二十世纪六十年代，抗dsdna抗体从狼疮肾炎的肾中洗脱。此外，研究表明，除了抗dsdna之外，多种自身抗体也可从狼疮肾炎的肾中洗脱。最后，狼疮自身抗体可引起系统性炎症的直接证据来自新生儿狼疮（nle），并且母体自身抗体穿过胎盘的被动转移将引起nle。

14、sle患者中的ana的类型主要包括抗dna抗体和抗rna结合蛋白质抗体（抗rbp）。抗dna抗体主要由已转化为浆母细胞的原初b细胞表达和分泌，并且该抗dna抗体的血清滴度将随着疾病的进展而显著变化，而抗rbp抗体主要由llpc分泌，并且通常不会随着疾病的进展而显著变化。据报告，sle易感小鼠的抗体滴度主要由llpc维持。其中，抗dna抗体可与靶抗原形成免疫复合物，从而导致肾沉积、补体活化和细胞因子产生。游离的抗dna抗体还可与神经元中的受体交叉结合而引起神经系统症状或直接与肾中的抗原结合而产生病理反应，而抗rbp抗体还可形成免疫复合物，从而导致细胞因子的产生以及可能的肾沉积和补体活化。

15、在九十年代早期，发现了b细胞不仅直接产生sle中的病理性自身抗体，而且通过由抗原呈递并分泌的细胞因子活化狼疮相关的t细胞。首先，在mrl/lpr狼疮模型小鼠中，去除b细胞的小鼠将显示减弱的t细胞活化和减少的间质性肾炎，这可完全防止sle疾病的进展。特别值得注意的是，这种现象无法完全由自身抗体的缺乏来解释，因为当无法分泌免疫球蛋白的b细胞重新植入b细胞已清除的模型小鼠时，动物中的炎症性t细胞灶将重新出现，并且小鼠将再次变成易感小鼠。这些研究显示存在抗体非依赖性b细胞功能，包括抗原呈递和细胞因子。其次，在缺乏cd11c+树突细胞的mrl/lpr小鼠中，t细胞仍然可被活化。然而，当在基因水平上删除b细胞的抗原呈递能力时，cd4+ t细胞的活化、效应记忆t细胞和滤泡辅助t细胞（tfh）的分化以及自身免疫的进程将被阻止。

16、鉴于b细胞和浆细胞在sle的发病机制中的重要作用，目前针对sle的靶向疗法的研究主要集中在与b细胞和浆细胞相关的靶标，诸如b淋巴细胞刺激因子baff/blys、增殖诱导配体april、cd20、cd22、cd19等等。其他靶标包括fcγriib、布鲁顿酪氨酸激酶、蛋白酶体、t细胞相关靶标、巨噬细胞相关靶标、胞内信号分子、共刺激因子、ige和肠道菌群。详情参见表1。

17、表1 sle的一些已上市或正在研究中的靶向治疗产品。

18、

19、现有的b细胞靶向疗法直接靶向b细胞表面标记物blys、april、cd19、cd20和cd22等，并且通过调节b细胞和/或浆细胞的活化、增殖、分化和凋亡来实现其药理作用。靶向blys的贝利木单抗是被批准用于治疗sle的第一种生物药物。靶向cd20的主要药物包括利妥昔单抗和奥瑞利珠单抗，并且2019年eular指南和2020年中国sle诊疗指南均建议利妥昔单抗可被选择用于难治性sle相关严重血小板减少症患者。然而，可商购获得的靶向疗法产品在sle中尚未实现显著的治疗效果或长期药物缓解。根据统计，在接受贝利木单抗治疗后，12个月内仍观察到26例复发/100例患者，或24个月内仍观察到44例复发/100例患者；两个随机试验显示，利妥昔单抗在非肾sle和狼疮肾炎中并不会优于常规治疗。此外，由于长期用药，患者处于部分免疫缺陷状态，从而增加了不利感染事件的风险。

20、cd19是免疫球蛋白超家族的膜表面糖蛋白并且分子量为95kda，其在浆细胞分化前的b细胞发育的所有阶段广泛表达。目前，靶向cd19的car-t细胞疗法在治疗sle方面相较于其他疗法具有明显的优势，主要表现在其对严重难治性sle的良好治愈效果以及其在无药物存在的情况下的长期缓解。据报告，cd19靶向car-t疗法已应用于严重sle女性患者，并且患者的病情已得到显著缓解，而无明显副作用。另有文献报告了5例难治性系统性红斑狼疮患者经过cd19 car-t治疗后病情显著改善，并且在17个月随访期间，这些患者中无一例患者复发，无药物时均达到缓解，生活质量大大提高。

21、目前，市场上针对sle适应症的car-t疗法均处于研发阶段，并且由ind批准的产品（诸如kyverna therapeutics公司的kyv-101和cabaletta bio公司的caba-201，kyv-101和caba-201已获得fda的用于治疗狼疮肾炎（ln）和活动性狼疮肾炎（活动性ln）或无肾受累的活动性sle的临床默示许可）均靶向cd19靶标，而通过注射jw therapeutics的瑞基奥仑赛治疗中度至重度难治性系统性红斑狼疮的研究性新药申请已获得国家药品监督管理局的默示许可。详情参见表2。

22、表2用于sle相关适应症的ind的公开批准的car-t产品

23、

24、根据已发表的临床结果，由于cd19在浆细胞的表面的表达大多为阴性或极低，尽管cd19的car-t疗法可降低自身抗体的水平，但其总igg抗体水平没有显著降低，即，单独靶向cd19阳性细胞无法深度清除asc（包括导致一些难治性sle的llpc）。在狼疮小鼠模型中，利用car-t治疗cd19也表明，尽管利用car-t治疗cd19可改善狼疮的症状，但自身抗体只能在疾病的早期通过施用来去除。在疾病进展的晚期，由于llpc的积累，仅清除b细胞无法阻止自身抗体的连续产生。为了解决这些问题，发明人通过研究提供了用于改进的双抗原的特异性嵌合抗原受体，以便有效治疗和/或预防系统性红斑狼疮。此外，对于涉及cd19和/或bcma的其他b细胞自身免疫性疾病，本文所公开的双抗原的特异性嵌合抗原受体均可具有良好的治愈效果。

技术实现思路

1、在第一方面，公开了用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的双特异性嵌合抗原受体（car）。car的第一靶标为cd19，并且第二靶标为bcma。

2、b细胞成熟抗原（bcma）是一种iii型跨膜蛋白质，该iii型跨膜蛋白质不包含信号肽并具有富含半胱氨酸的胞外区，并且在b细胞扩增、存活、成熟和分化为浆细胞的过程中起关键的调节作用。bcma是浆细胞的重要表面受体，并且敲除bcma会导致小鼠中由llpc主导的浆细胞显著减少，并且bcma可促进llpc在骨髓中的长期存活。数据显示，sle患者的浆细胞中膜结合bcma的表达比例和丰度显著高于健康人。然而，仅靶向bcma不能有效清除在特定sle发作阶段中被活化的大量致病性b细胞（cd19阳性到强阳性，bcma极弱阳性或阴性）和浆母细胞（cd19阳性到弱阳性，bcma弱阳性到阳性）。在使用靶向cd19的car-t疗法和靶向bcma的car-t疗法治疗伴有sle的弥漫性大b细胞淋巴瘤（dlbcl）患者的过程中，发现同时靶向两种抗原不仅可将ana降低至不可检测的水平，而且还可显著降低总igg抗体水平，这表明该双靶标联合疗法可靶向产生大量自身抗体的asc，并且进一步避免igg自身抗体的产生和复发。

3、根据本公开，发现了靶向cd19和bcma的组合可完全阻断产生自身抗体的途径，并且完全覆盖b细胞、浆母细胞和处于产生自身抗体的多个分化阶段的浆细胞，因此基于该概念设计的双靶标car-t疗法可用于由b细胞介导的自身免疫性疾病，尤其是难治性sle，并且预期获得更快的缓解以及更深入且持久的治愈效果。

4、在一些实施方案中，双特异性car可通过杀伤或抑制cd19阳性b细胞、浆母细胞和bcma阳性浆细胞来治疗或预防b细胞介导的自身免疫性疾病。上述药物和制剂同时具有杀伤cd19阳性b细胞、浆母细胞和bcma阳性浆细胞的能力。靶标cd19和bcma的组合不仅可对b细胞介导的自身免疫性疾病具有更深入的治愈效果，而且还具有降低此类疾病复发可能性的潜力。其机制和原理如图2所示。

5、在一个实施方案中，双特异性car可与一种或更多种药剂组合。药剂可以是提高具有car核酸或多肽的细胞的功效的药剂。药剂可用于改善与施用包含car核酸或car多肽的细胞相关联的一种或更多种副作用。药剂可以是用于治疗与bcma和cd19相关的疾病的另外的药剂。药剂可以是选自以下项的第二疗法：手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、dna疗法、rna疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法以及它们的任何组合。

6、药物可杀伤或抑制cd19阳性b细胞、浆母细胞和bcma阳性浆细胞，以治疗自身免疫性疾病。

7、自身免疫性疾病为由b细胞介导的自身免疫性疾病。由b细胞介导的自身免疫性疾病包括：系统性红斑狼疮（sle）；肾小球肾炎，包括自身免疫性慢性肾病、狼疮肾炎、急性肾小球肾炎、免疫性肾炎、膜性肾病、iga肾病；抗中性粒细胞胞质抗体（anca）相关性血管炎（aav）；硬皮病或系统性硬化症（ssc）；肌炎或特发性炎症性肌炎，包括皮肌炎、多发性肌炎、免疫介导的坏死性肌病（imnm）、抗合成酶综合征、包涵体肌炎和重叠肌炎；多发性硬化症（ms）；炎症性肠病（ibd）；类风湿性关节炎（ra）；干燥综合征（ss）；自身免疫性溶血性贫血；视神经脊髓炎（nmo）；视神经脊髓炎谱系疾病（nmosd）；特发性血小板减少性紫癜（itp）；系统性自身免疫性小血管炎综合征或与抗中性粒细胞胞质抗体相关的多血管炎；韦格纳氏肉芽肿病（gpa）、嗜酸性肉芽肿性多血管炎（egpa，许尔许斯特劳斯综合征（churg-strausssyndrome））；寻常型天疱疮；自身免疫性脑炎；寻常型天疱疮；重症肌无力；抗磷脂综合征；恰加斯氏病（chagas' disease）；格雷夫斯病（graves' disease）；结节性多动脉炎；肺出血-肾炎综合征；川崎病（kawasaki disease）、淀粉样变性；意义未明的单克隆免疫球蛋白、poems综合征；克罗恩病（crohn's disease）；溃疡性结肠炎；成年发病斯蒂尔病（adultonset still's disease）；和慢性进行性皮质脱髓鞘性脑病（cidp）。

8、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮，并且在上述实施方案中的一些实施方案中，系统性红斑狼疮包括中度至重度难治性系统性红斑狼疮、狼疮肾炎、活动性狼疮肾炎和无肾受累的活动性系统性红斑狼疮。

9、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为肌炎。

10、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为肾小球肾炎，并且在一些实施方案中，肾小球肾炎为以下中的至少一者：自身免疫性慢性肾病、狼疮肾炎、急性肾小球肾炎、免疫性肾炎、膜性肾病和iga肾病。

11、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为多发性硬化症。

12、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为硬皮病或系统性硬化症（ssc）。

13、在一个实施方案中，由b细胞介导的自身免疫性疾病为重症肌无力。

14、本文所公开的第二方面是嵌合抗原受体的结构。靶向bcma的第一抗体或其抗原结合片段或靶向cd19的第二抗体或其抗原结合片段独立地选自骆驼ig、ignar、fab片段、fab'片段、f(ab')z片段、f(ab')3片段、fv、单链抗体（诸如scfv、二价scfv和(scfv)z）、微抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的fv蛋白（“dsfv”）和单结构域抗体（sdab，纳米抗体）、嵌合抗体、人源化抗体、单结构域抗体、双特异性抗体或多特异性抗体、结合配体或蛋白质结构域。靶向bcma的抗原结合片段或靶向cd19的抗原结合片段为scfv。

15、在一个实施方案中，双特异性car包含靶向bcma的抗体或其抗原结合片段，该靶向bcma的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区（vh,bcma），该vh,bcma具有包含seq idno: 5的氨基酸序列的互补决定区1（hcdr1）、包含seq id no: 6的氨基酸序列的hcdr2和包含seq id no: 7的氨基酸序列的hcdr3；和轻链可变区（vl,bcma），该vl,bcma具有包含seqid no: 8的氨基酸序列的互补决定区1（lcdr1）、包含seq id no: 9的氨基酸序列的lcdr2和包含seq id no: 10的氨基酸序列的lcdr3。

16、在一个实施方案中，双特异性car包含靶向cd19的抗体或其抗原结合片段，该靶向cd19的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区（vh,cd19），该vh,cd19具有包含seq idno: 11的氨基酸序列的互补决定区1（hcdr1）、包含seq id no: 12的氨基酸序列的hcdr2和包含seq id no: 13的氨基酸序列的hcdr3；和轻链可变区（vl,cd19），该vl,cd19具有包含seq id no: 14的氨基酸序列的互补决定区1（lcdr1）、包含seq id no: 15的氨基酸序列的lcdr2和包含seq id no: 16的氨基酸序列的lcdr3。

17、在一个实施方案中，双特异性car包含：带有上文所提及的cdr（seq id no: 5至seq id no: 10）的靶向bcma的抗体或其抗原结合片段；和带有上文所提及的cdr（seq idno: 11至seq id no: 16）的靶向cd19的抗体或其抗原结合片段。

18、在一个实施方案中，包含vh,bcma的双特异性car包含与seq id no: 1具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，vl,bcma包含与seq id no: 2具有至少95%同一性的氨基酸序列。

19、在一个实施方案中，包含vh,cd19的双特异性car包含与seq id no: 3具有至少95%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，vl,cd19包含与seq id no: 4具有至少95%同一性的氨基酸序列。

20、在一些实施方案中，bcma抗原结合片段包含seq id no: 1和seq id no: 2两者或与它们具有至少95%氨基酸同一性的序列；并且/或者cd19抗原结合片段包含seq id no: 3和seq id no: 4两者或与它们具有至少95%氨基酸同一性的序列。

21、在一个实施方案中，双特异性car可具有选自下式中的任一者的结构：

22、1a)l-vl,cd19-vh,bcma-vl,bcma-vh,cd19-h-tm-c-cd3ζ；

23、1b)l-vl,cd19-vl,bcma-vh,bcma-vh,cd19-h-tm-c-cd3ζ；

24、2a)l-vh,cd19-vl,bcma-vh,bcma-vl,cd19-h-tm-c-cd3ζ；

25、2b)l-vh,cd19-vh,bcma-vl,bcma-vl,cd19-h-tm-c-cd3ζ；

26、3a)l-vl,cd19-vh,cd19-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vh,bcma-vl,bcma-h-tm'-c-cd3ζ；

27、3b)l-vh,cd19-vl,cd19-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vh,bcma-vl,bcma-h-tm'-c-cd3ζ；

28、3c)l-vl,cd19-vh,cd19-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vl,bcma-vh,bcma-h-tm'-c-cd3ζ；

29、3d)l-vh,cd19-vl,cd19-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vl,bcma-vh,bcma-h-tm'-c-cd3ζ；

30、4a)l-vh,bcma-vl,bcma-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vl,cd19-vh,cd19-h-tm'-c-cd3ζ；

31、4b)l-vl,bcma-vh,bcma-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vl,cd19-vh,cd19-h-tm'-c-cd3ζ；

32、4c)l-vh,bcma-vl,bcma-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vh,cd19-vl,cd19-h-tm'-c-cd3ζ；或

33、4d)l-vl,bcma-vh,bcma-h-tm-c-cd3ζ-2a肽-l-vh,cd19-vl,cd19-h-tm'-c-cd3ζ。

34、在一个实施方案中，双特异性car具有1a)、2a)、3a)或4a)中的一者的式。

35、在上述式1a)、式1b)、式2a)和式2b)包含由靶向bcma的抗体或其抗原结合片段和靶向cd19的抗体或其抗原结合片段形成的环结构。例如，在式1a)中，vl,cd19-vh,bcma-vl,bcma-vh,cd19构成环结构；在式2a)中，vh,cd19-vl,bcma-vh,bcma-vl,cd19构成环结构。

36、在上式中，“-”独立地为连接子肽或肽键；

37、l可不存在或作为信号肽序列存在。l可包含来自以下蛋白质衍生信号肽的结构域：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137或它们的组合。l可为来源于cd8的信号肽。信号肽序列可为如seq id no: 25所示的氨基酸序列：malpvtalllplalllhaarp；

38、vh,bcma为抗bcma抗体重链可变区。vh,bcma的序列可包含seq id no: 5至seq idno: 7所示的cdr。vh,bcma抗体重链可变区的序列可以如seq id no: 1所示。

39、vl,bcma为抗bcma抗体轻链可变区。vl,bcma的序列可包含seq id no: 8至seq idno: 10所示的cdr。vl,bcma抗体轻链可变区的序列可以如seq id no: 2所示。

40、vh,cd19为抗cd19抗体重链可变区。vh,cd19的序列可包含seq id no: 11至seqid no: 13所示的cdr。vh,cd19抗体重链可变区的序列可如seq id no: 3所示。

41、vl,cd19为抗cd19抗体轻链可变区。vl,cd19的序列可包含seq id no: 14至seqid no: 16所示的cdr。vl,cd19抗体轻链可变区的序列如seq id no: 4所示。

42、h为铰链区；

43、tm为第一跨膜结构域；

44、tm'为第二跨膜结构域；

45、2a肽选自p2a、t2a、e2a或f2a；

46、c为共刺激信号分子；

47、cd3ζ为来源于cd3ζ的细胞质信号转导序列。

48、vh,bcma为抗bcma抗体重链可变区，并且vl,bcma为抗bcma抗体轻链可变区；vh,bcma抗体重链可变区的序列如以下seq id no: 1所示：

49、qvqlvqsgaevkkpgasvklsckasgytftdyyihwvrqapgqglewigyinpnsgytnyaqkfqgratmtadksintayvelsrlrsddtavyfctrymwervtgffdfwgqgtmvtvss（seq id no: 1）。

50、在上述序列seq id no: 1中，根据kabat编号系统，重链可变区有三个互补决定区（crd），其如下所示：

51、hcdr1: dyyih（seq id no: 5）

52、hcdr2: yinpnsgytnyaqkfqg（seq id no: 6）

53、hcdr3: ymwervtgffdf（seq id no: 7）

54、作为另一个示例，vh,bcma抗体重链可变区还包含：包含seq id no: 1所示的氨基酸序列或与之相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如，一个、两个或三个氨基酸的取代、缺失或添加）的序列；

55、在一些实施方案中，vh,bcma抗体重链可变区的变体与其所来源的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性，或具有与其所来源的序列相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加）。在一个实施方案中，取代是保守的。

56、vl,bcma抗体轻链可变区的序列如以下seq id no: 2：

57、diqmtqspssvsasvgdrvtitclasedisddlawyqqkpgkapkvlvyttsslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyfcqqtykfpptfgggtkveikr（seq id no: 2）。

58、在上述序列seq id no: 2中，根据kabat编号系统，轻链可变区有三个互补决定区（crd），它们是：

59、lcdr1: lasedisddla（seq id no: 8）

60、lcdr2: ttsslqs（seq id no: 9）

61、lcdr3: qqtykfppt（seq id no: 10）

62、作为另一个示例，vl,bcma抗体轻链可变区还包含：包含seq id no: 2所示的氨基酸序列或与之相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如，一个、两个或三个氨基酸的取代、缺失或添加）的序列；

63、在一些实施方案中，vl,bcma抗体轻链可变区的变体与其所来源的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性，或具有与其所来源的序列相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加）。在一个实施方案中，取代是保守的。

64、vh,cd19为抗cd19抗体重链可变区，并且vl,cd19为抗cd19抗体轻链可变区；vh,cd19抗体重链可变区的序列如以下seq id no: 3所示：

65、evklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss；

66、vl,cd19抗体轻链可变区的序列如以下seq id no: 4所示：

67、diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleit.

68、在上述序列seq id no: 3中，根据kabat编号系统，重链可变区有三个互补决定区（crd），其如下所示：

69、hcdr1: dygvs（seq id no: 11）

70、hcdr2: viwgsettyynsalks（seq id no: 12）

71、hcdr3: hyyyggsyamdy（seq id no: 13）

72、在上述序列seq id no: 4中，根据kabat编号系统，轻链可变区有三个互补决定区（crd），其如下所示：

73、lcdr1: rasqdiskyln（seq id no: 14）

74、lcdr2: htsrlhs（seq id no: 15

75、lcdr3: qqgntlpyt（seq id no: 16

76、作为另一个示例，vh,cd19还包含：包含seq id no: 3所示的氨基酸序列或与之相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如一个、两个或三个氨基酸的取代、缺失或添加）的序列；

77、在一些实施方案中，vh,cd19变体与其所来源的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性，或具有与其所来源的序列相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加）。在一个实施方案中，取代是保守的。

78、作为另一个示例，vl,cd19还包含：包含seq id no: 4所示的氨基酸序列或与之相比具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如一个、两个或三个氨基酸的取代、缺失或添加）的序列；

79、在一些实施方案中，scfv2的变体与其所来源的序列相比具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99%或100%的序列同一性，或具有与其所来源的序列具有一个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加（例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加）。在一个实施方案中，取代是保守的。

80、h为铰链区；h可包含来自以下蛋白质的结构域：cd8、cd28、cd137或它们的组合；h可选自来源于cd8的铰链区；h可包含seq id no: 17至seq id no: 19所示的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成：

81、tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd（seq id no: 17）；

82、或kptttpaprpptpaptiasqplslrpeasrpaaggavhtrgldfasdkp（seq id no: 18）；

83、或sgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd（seq id no: 19）；

84、tm或tm'为（分别为第一或第二）跨膜结构域；在一个示例中，tm或tm'可为cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154或它们的组合的蛋白质结构域的跨膜区；

85、tm或tm'可为来源于cd8的跨膜区，该来源于cd8的跨膜区具有如seq id no: 20所示的氨基酸序列：

86、iyiwaplagtcgvlllslvitlyc（seq id no: 20）。

87、c可为共刺激信号分子；c可为ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2或它们的组合的蛋白质结构域的共刺激信号分子；

88、c可为来源于4-1bb的共刺激信号分子。c可来源于具有如以下seq id no: 21所示的氨基酸序列的4-1bb：

89、krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。

90、cd3ζ为来源于cd3ζ的细胞质信号转导序列。在一个实施方案中，cd3ζ具有如以下seq id no: 22所示的氨基酸序列：

91、rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

92、在另一个示例中，car（例如，在c末端或n末端处）还包含细胞自杀元件；其中该细胞自杀元件可通过t2a与该car或双特异性car的l或cd3ζ连接。

93、在另一个示例中，连接子不存在或为如seq id no: 23所示的氨基酸序列：ggggs。在一些实施方案中，在每种情况下的连接子序列可独立地不存在或对应于seq id no: 23或seq id no: 23的重复。在一个实施方案中，连接子的每种情况独立地不存在或重复1次至10次、1次至5次、1次至3次或一次。

94、在另一个实施方案中，在每种情况下，bcma和/或cd19的可变链中的每条可变链之间的连接子序列可独立地不存在，可为seq id no: 23或其一些重复，并且/或者为如seqid no: 24所示的氨基酸序列：gstsgsgkpgsgegstkg。

95、在一个实施方案中，双特异性car可包含seq id no: 5至seq id no: 16的氨基酸序列。在一个实施方案中，双特异性car可包含seq id no: 5至seq id no: 16、seq id no:17至seq id no: 19中的一者、以及seq id no: 20至seq id no: 22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，双特异性car还包含seq id no: 23至seq id no: 25中的每一者的至少一种情况。在一个特定实施方案中，双特异性car包含seq id no: 5至seq id no: 16、seq idno: 19至seq id no: 22和seq id no: 25。在一个特定实施方案中，双特异性car包含seqid no: 5至seq id no: 16、seq id no: 19至seq id no: 22和seq id no: 25，以及seqid no: 23和seq id no: 24的至少一种情况。在这些实施方案的每个实施方案中，可调整bcma和cd19的重链可变区和轻链可变区的顺序。bcma和cd19重链的示例结构顺序包括但不限于：vh, bcma-vl, bcma-vh, cd19-vl, cd19；vl, bcma-vh, bcma-vh, cd19-vl, cd19；vh, bcma-vl, bcma-vl, cd19-vh, cd19；vl, bcma-vh, bcma-vl, cd19-vh, cd19；vh, cd19-vl, cd19-vh, bcma-vl, bcma；vl, cd19-vh, cd19-vh, bcma-vl, bcma；vh, cd19-vl, cd19-vl, bcma-vh, bcma；vl, cd19-vh, cd19-vl, bcma-vh, bcma；vh, cd19-vl, bcma-vh, bcma-vl, cd19；vh, cd19-vh, bcma-vl, bcma-vl, cd19；vl, cd19-vl, bcma-vh, bcma-vh, cd19；vl, cd19-vh, bcma-vl, bcma-vh, cd19；vh, bcma-vl, cd19-vh, cd19-vl, bcma；vh, bcma-vh, cd19-vl, cd19-vl, bcma；vl, bcma-vl, bcma-vh, cd19-vh, cd19；或者vl, bcma-vh, bcma-vl, cd19-vh, cd19。

96、在一个实施方案中，双特异性car可包含seq id no: 1至seq id no: 4的氨基酸序列。在一个实施方案中，双特异性car可包含seq id no: 1至seq id no: 4、seq id no:17至seq id no: 19中的一者、以及seq id no: 20至seq id no: 22的氨基酸序列。在一个实施方案中，双特异性car还包含seq id no: 23至seq id no: 25中的每一者的至少一种情况。在一个特定实施方案中，双特异性car包含seq id no: 1至seq id no: 4、seq idno: 19至seq id no: 22和seq id no: 25。在一个非常特定实施方案中，双特异性car包含seq id no: 1至seq id no: 4、seq id no: 19至seq id no: 22和seq id no: 25，以及seq id no: 23和seq id no: 24的至少一种情况。

97、在一个实施方案中，双特异性car包含：具有seq id no: 19的氨基酸序列的h；具有seq id no: 25的氨基酸序列的l；具有seq id no: 1的氨基酸序列的vh,bcma；具有seqid no: 2的氨基酸序列的vl,bcma；具有seq id no: 3的氨基酸序列的vh,cd19；具有seqid no: 4的氨基酸序列的vl,cd19；具有seq id no: 20的氨基酸序列的tm；具有seq idno: 21的氨基酸序列的c；和具有seq id no: 22的氨基酸序列的cd3ζ。双特异性car的结构可对应于式1a)。

98、在一个实施方案中，双特异性car具有如seq id no: 26所示的以下氨基酸序列：

99、malpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsqvqlvqsgaevkkpgasvklsckasgytftdyyihwvrqapgqglewigyinpnsgytnyaqkfqgratmtadksintayvelsrlrsddtavyfctrymwervtgffdfwgqgtmvtvssgstsgsgkpgsgegstkgdiqmtqspssvsasvgdrvtitclasedisddlawyqqkpgkapkvlvyttsslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyfcqqtykfpptfgggtkveikrggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsssgtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。

100、在一个实施方案中，如上文所描述的双特异性car以0.5±20%×10^5个细胞/千克、1.0±20%×10^5个细胞/千克、2.0±20%×10^5个细胞/千克或3.0±20%×10^5个细胞/千克中任一者的量施用于受试者。在一个实施方案中，双特异性car以0.5×10^5个细胞/千克、1.0×10^5个细胞/千克、2.0×10^5个细胞/千克或3.0×10^5个细胞/千克的量施用于受试者。

101、在一个实施方案中，提供了用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的药物组合物，该药物组合物包含如本文所描述的双特异性car。

102、在一个实施方案中，公开了一种用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用如本文所描述的双特异性car进行治疗。

103、在一个实施方案中，本文公开了一种如本文所描述的双特异性car用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的用途。该用途可包括制备用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的药品、药物或制剂。

104、本文所公开的第三方面是一种用于治疗和/或预防b细胞介导的自身免疫性疾病（诸如sle）的bcma-cd19 car-t细胞，并且该bcma-cd19 car-t细胞是在细胞膜上表达上述car的工程化自体t细胞。收集患者的t细胞，并且通过使用慢病毒（四质粒系统包）利用car基因对t细胞进行转导，使得t细胞可特异性地识别表达于靶细胞的表面上的bcma和cd19抗原。

105、在一个实施方案中，提供了一种bcma-cd19 car-t细胞在制备用于治疗和/或预防b细胞介导的自身免疫性疾病的药物中的用途，并且该bcma-cd19 car-t细胞可为在细胞膜上表达上述嵌合抗原受体的工程化t细胞（诸如工程化自体t细胞），或者可以是编码上述嵌合抗原受体的核苷酸序列的工程化t细胞（诸如工程化自体t细胞）。

106、第四方面公开了一种编码本文所公开的双特异性car的核酸分子，该核酸分子用于治疗自身免疫性疾病。在一个实施方案中，公开了一种用于治疗和/或预防自身免疫性疾病的重组载体。载体可包含如本文所公开的双特异性car或核酸分子。

107、在一个实施方案中，公开了一种核酸分子在制备用于治疗b细胞介导的自身免疫性疾病（诸如系统性红斑狼疮）的药物中的用途，并且该核酸分子包含编码上述嵌合抗原受体的核苷酸序列。

108、本文所公开的第五方面是一种载体在治疗b细胞介导的自身免疫性疾病中的应用，其中该载体选自dna载体、rna载体、质粒、脂质体、微粒、转座子载体、crispr/cas9载体或病毒载体；在一个实施方案中，载体为慢病毒载体。

109、本文所公开的第六方面提供了一种bcma-cd19 car-t细胞在制备用于治疗和/或预防b细胞介导的自身免疫性疾病（诸如系统性红斑狼疮）的药物中的用途，并且该bcma-cd19 car-t细胞为在细胞膜上表达上述嵌合抗原受体的工程化自体t细胞。

110、本文所公开的第七方面是一种药物或制剂，该药物或制剂包含嵌合抗原受体、核酸分子、载体或bcma-cd19 car-t细胞，以及任选地，药学上可接受的载剂、佐剂和/或赋形剂；药物或制剂可用于治疗和/或预防b细胞介导的自身免疫性疾病（诸如系统性红斑狼疮）。

111、与现有技术相比，本文所公开的主题至少具有以下显著的优点和效果：

112、bcma-cd19 car-t具有同时清除b细胞（包括b前体细胞）和浆细胞的潜力，并且能够清除自身抗体的主要来源，并且实现局部免疫重置，使得b细胞介导的自身免疫性疾病（诸如难治性sle）患者可获得长期且持续的缓解。