一种鹅星状病毒亚单位疫苗的制作方法

本发明属于兽医，尤其涉及一种鹅星状病毒亚单位疫苗。

背景技术：

1、禽星状病毒（avastrovirus）可感染鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽，引起火鸡肠炎、鸡矮小综合征（runting-stunting syndrome,rss）、鸡肾炎、鸭病毒性肝炎等疾病。2017年开始临床出现由鹅星状病毒（ gastv）引起的鹅痛风症在全国各地广泛流行。雏鹅（4～21日龄）发病，发病前2～3天出现拉稀、脱水、消瘦、干脚、软腿、呼吸困难、死亡。感染率高达80%，死亡率高达50%。剖检呈现肾脏肿大斑驳、输卵管及内脏表面尿酸盐沉积为特征的典型痛风症状，并且鹅胚孵化率降低。近几年鹅星状病毒的致病性从雏鹅发展至成年鹅，对大日龄鹅也造成不同程度致病，该病给养鹅业造成巨大危害。

2、鹅星状病毒属于星状病毒科星状病毒属，是单股正链rna病毒，病毒粒子无囊膜，直径24～30nm的球形。病毒基因组全长7252nt (orf1a, 3105 nt;orf1b, 1551 nt; orf2,2115 nt), and 5’utr of 245 nt and 3’utr of 228 nt。其rna上有3个阅读框，orf1a和orf1b编码非结构蛋白，orf2编码病毒衣壳蛋白。capsid protein (cp)是免疫原性蛋白，介导病毒对宿主细胞的粘附和入侵。根据全基因组及orf2（衣壳蛋白基因）系统进化分析，目前中国流行的鹅星状病毒主要分为两个基因型（genotype）：goastv-1（鹅星状病毒1型）

3、与经典禽星状病毒亲缘关系较近，目前我国检出率相对较低。

4、鹅星状病毒目前还没有商品化疫苗，没有有效的免疫保护导致该病广泛流行。由于鹅星状病毒培养工艺尚不成熟，鹅胚或细胞培养的病毒滴度均偏低，制备灭活疫苗成本高，且免疫保护效果不佳。通过基因工程技术表达鹅星状病毒抗原蛋白制备亚单位疫苗是目前研究的热点。但是，由于鹅星状病毒衣壳蛋白cp由三个结构域构成三层机构，s 区由cp的氨基端组成，形成病毒内壳，围绕病毒rna。p 区由剩余的氨基酸组成，分为p1 区和p2 区两个亚区。鹅星状病毒衣壳蛋白结构复杂，表达天然的抗原蛋白表达量低，抗原稳定性不佳，致使亚单位疫苗的规模化应用受到阻碍。因此，亟需对鹅星状病毒衣壳蛋白进行合理优化，制备亚单位疫苗用于防控鹅星状病毒。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种鹅星状病毒亚单位疫苗，属于兽医技术领域。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、其一，本发明提供了一种鹅星状病毒亚单位疫苗，所述亚单位疫苗为基因工程大肠杆菌表达的鹅星状病毒2型的重组p2抗原蛋白与矿物油佐剂乳化制备的油乳剂亚单位疫苗，所述重组p2抗原蛋白的氨基酸序列为seq id no.1。

4、进一步地，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：

5、（1）表达重组p2抗原蛋白的大肠杆菌按体积比1%的比例转接10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为一级种子液；

6、（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液；

7、（3）二级种子液按体积比1%的比例接种含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液于发酵罐中，发酵培养3h，培养至od600nm为0.6～0.8；

8、（4）加入100mm/l的α-乳糖至终浓度为0.4mm/l，培养温度降至25℃再培养6h结束发酵；

9、（5）发酵液12000 r/min连续流离心收集菌体，加入菌体重量10倍体积的pbs进行菌体悬浮，超声波破碎，12000 r/min连续流离心，上清液经0.22μm滤器过滤处理，经ni柱纯化抗原蛋白，纯化蛋白液2～8℃保存备用；

10、（6）纯化的抗原蛋白液计量加入10%的甲醛溶液，充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1%，2～8℃灭活72小时制成抗原液；

11、（7）将矿物油、司本-80、硬脂酸铝按照95:5:1混匀配制油相；灭活的抗原液95份、无菌的吐温-80 5份，充分混匀，使吐温-80完全溶解，即为水相；油相2份加入水相1份，剪切机乳化制备疫苗。

12、其二，本发明提供了一种鹅星状病毒重组抗原，所述抗原为基因工程大肠杆菌表达的鹅星状病毒2型的重组p2抗原蛋白，所述重组p2抗原蛋白的氨基酸序列为seq idno.1。

13、进一步地，所述重组抗原的制备方法包括如下步骤：

14、（1）表达重组p2抗原蛋白的大肠杆菌按体积比1%的比例转接10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为一级种子液；

15、（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液；

16、（3）二级种子液按体积比1%的比例接种含50μg/ml硫酸卡那霉素的lb培养液于发酵罐中，发酵培养3h，培养至od600nm为0.6～0.8；

17、（4）加入100mm/l的α-乳糖至终浓度为0.4mm/l，培养温度降至25℃再培养6h结束发酵；

18、（5）发酵液12000 r/min连续流离心收集菌体，加入菌体重量10倍体积的pbs进行菌体悬浮，超声波破碎，12000 r/min连续流离心，上清液经0.22μm滤器过滤处理，经ni柱纯化抗原蛋白，纯化蛋白液2～8℃保存备用。

19、进一步地，本发明提供了一种用于表达鹅星状病毒2型重组p2抗原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为seq id no.2。

20、有益效果：本发明对鹅星状病毒2型的衣壳蛋白结构进行分析，挖掘p2结构域抗原表位区域，并对其氨基酸序列进行突变，引入一对二硫键稳定蛋白结构。通过基因工程大肠杆菌表达重组p2抗原蛋白，经镍柱纯化后与矿物油佐剂乳化制备油乳剂亚单位疫苗。该亚单位疫苗超剂量免疫的所有试验鹅精神、采食及饮水均未见异常，注射部位均无红肿反应，疫苗安全性良好。亚单位疫苗免疫效果良好，能使免疫的狮头鹅产生中和抗体，达到攻毒保护。该亚单位疫苗临床应用能减少鹅星状病毒2型野毒感染对鹅群造成的损害，从而有效控制当前流行的鹅星状病毒。

1.一种鹅星状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗为基因工程大肠杆菌表达的鹅星状病毒2型的重组p2抗原蛋白与矿物油佐剂乳化制备的油乳剂亚单位疫苗，所述重组p2抗原蛋白的氨基酸序列为seq id no.1。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：

3.一种鹅星状病毒重组抗原，其特征在于，所述抗原为基因工程大肠杆菌表达的鹅星状病毒2型的重组p2抗原蛋白，所述重组p2抗原蛋白的氨基酸序列为seq id no.1。

4.根据权利要求3所述的鹅星状病毒重组抗原，其特征在于，所述重组抗原的制备方法包括如下步骤：

5.一种用于表达鹅星状病毒2型重组p2抗原蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为seq id no.2。