一种双价呼吸道合胞病毒RSV疫苗的制作方法

本发明涉及人用疫苗，特别是一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒（rsv）在全球范围内是导致婴幼儿、老年人及免疫功能低下者急性下呼吸道感染的主要病原体之一；rsv病毒于1956年首次从黑猩猩呼吸道样本中分离，随后在1957年被确认为是人类病原体，对人类具有特异性和致病性；病毒通过飞沫传播，从鼻子到肺部沿着人类呼吸道感染细胞；rsv感染最初症状通常在暴露于病毒之后4~7天内出现；在上呼吸道，疾病的体征和症状包括：流涕、咽痛、头痛、疲劳和发热；值得注意的是，虽然大多数儿童在感染rsv期间可能会出现发热症状，但一定比例的幼儿可能不会出现；在下呼吸道感染的体征和症状包括：咳嗽、呼吸短促、呼吸急促、支气管痉挛和喘鸣音；在婴幼儿中重症病例可出现呼吸窘迫、发绀、喂养困难等表现；在成人中，rsv多表现为普通感冒症状，在老年人和免疫力低下者可导致严重肺炎；严重的肺部疾病可导致体内含氧量低，呼吸肌疲劳，有时可导致死亡；生命早期的rsv下呼吸道感染可能导致长期的呼吸系统后果，包括婴儿因呼吸系统疾病反复住院，喘鸣音和哮喘反复发作，婴儿期以后肺部健康受损。

2、目前有批准的疫苗可用于预防婴儿和老年人发生重症呼吸道合胞病毒病；为了保护婴儿，疫苗可为孕妇和妊娠晚期（世卫组织建议在妊娠晚期接种疫苗，在大多数情况下从孕龄28周开始）的人接种；孕产妇免疫接种可以通过胎盘将抗呼吸道合胞病毒的抗体转移到未出生的婴儿身上，然后在出生后大约6个月内为其提供保护。

3、rsv属于肺病毒科，是一种单股负链rna病毒；病毒颗粒呈现多形性，直径150~300nm，基因组全长15.2kb，编码11种蛋白质；当感染发展时，rsv会使细胞融合形成大细胞，称为合胞体；病毒的结构主要由三种膜蛋白组成：一种小疏水蛋白（sh）、一种附着糖蛋白（g）和一种融合蛋白（f），其中g蛋白与f蛋白在细胞融合中起着重要作用，同时也是刺激机体产生保护性抗体的蛋白；病毒的复制周期容易出错，允许快速产生突变，从而导致rsv毒力的变化以及制备抗病毒药物或疫苗的困难。

4、rsv两个主要基因亚型的流行情况因地区、季节和人群而异，rsv-a通常与更严重的临床症状相关，复制速度较快，可能更易导致重症感染；rsv-b的致病性略低，但是某些毒株可能有较强的免疫逃逸能力；rsv-a和rsv-b表现交替流行和共流行；交替流行是主导，多数地区呈现交替趋势，第一年以a为主，次年以b为主；在部分季节两者同时流行，流行比例有差异，a占比60~70%，b占比30~40%；a和b亚型流行也呈现地域差异，中国部分研究显示a型主导，但是覆盖两种亚型的rsv疫苗更具有优势，形成全面的免疫压力应对病毒流行，如果单纯使用主要a亚型，随着免疫人群扩大，b亚型逐渐会呈现优势株，不利于rsv疫病控制。

5、a和b亚型主要基于g抗原和序列变异，g是变异最大的基因序列；这两个亚型可以进一步区分和鉴定几种基因型，包括15种不同的b基因型和9种不同的a基因型；rsv在全球范围内不断进化，多年来出现了新的基因型；b基因型多样性大于rsv a；rsv f蛋白在a和b基因型中比g蛋白更保守，是疫苗开发的主要靶点；f蛋白在a和b基因型之间仅相差25个氨基酸；f蛋白含有融合前和融合后构象共享的抗原位点，以及每种构象独有的位点；f蛋白上定义了六个主要的抗原位点（ø，i，ii，iii，iv，v）；一些抗原位点在pre-f和post-f上都有表达，而其他位点仅在一种构象上存在；抗原位点i、ii、iii和iv存在于pre-f和post-f构象中，并呈现不同的亲和力；抗原位点ø和v仅存在在pre-f构象中，对中和抗体具有最高的亲和力。

6、人血清中的rsv中和活性主要来源于靶向融合前构象的f蛋白的抗体，更具体地说是抗原位点ø和v；免疫学分析表明，超过85%的高效抗体对pre-f特异性；此外，pre-f特异地抗体比pre-f和post-f交叉反应抗体更有效，也比post-f特异性抗体更有效；相比之下，g蛋白特异性血清没有观察到病毒中和活性。

7、两种稳定的基于pre-f蛋白的疫苗arexvy和abrysvo已在美国和欧洲获得授权，可保护老年人免受rsv相关的下呼吸道疾病；abrysvo还表明可以通过母体疫苗接种保护婴儿免受rsv的侵害；单价疫苗arexvy基于源自a2毒株f蛋白抗原；abrysvo是双价疫苗，同时预防a亚型和b亚型rsv病毒感染。

8、已批准上市的双价疫苗abrysvo仍然有很多地方需要改进，这些问题概括起来主要有：第一是所制备的三聚体不够稳定，制剂需要冻干，在使用前用水溶解后再注射；第二是为了实现三聚体，疫苗开发者在f蛋白氨基酸末端引入了一段t4噬菌体序列foldon，辅助形成三聚体，这些非病毒的外源序列对疫苗安全性和有效性构成威胁；第三是序列中含有p27片段，该部分序列需要依靠表达宿主细胞的furin酶将其切除，实验表明fulin酶切除效率达不到100%，残留的p27影响疫苗纯度和免疫原性。

技术实现思路

1、鉴于上述现有存在的问题，提出了本发明。

2、本发明提供了一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗解决现有rsv疫苗三聚体稳定性差需冻干、含外源序列安全隐患、酶切残留导致纯度低的问题。

3、为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

4、第一方面，本发明实施例提供了一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗，其包括，

5、rsv-a亚型的pre-f三聚体蛋白；

6、rsv-b亚型的pre-f三聚体蛋白；

7、铝佐剂；

8、其中所述疫苗为液体剂型，且两种pre-f三聚体蛋白均通过链间二硫键共价连接形成稳定结构。

9、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述pre-f三聚体蛋白单体通过以下重构获得：

10、a) 删除f2与f1结构域之间的p27片段seq no.3及furin酶切位点seq no.4；

11、b) 用gsgsgs连接子连接f2和f1结构域；

12、c) 删除c端酯化区seq no.5；

13、d) 将n端病毒信号肽替换为cho细胞分泌信号肽seq no.8mewswvflfflsvttgvhs。

14、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述链间二硫键通过以下氨基酸替换形成：

15、rsv-a亚型中：s146c和n460c；

16、rsv-b亚型中：a149c和y458c。

17、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：还包含链内二硫键，通过s155c和s290c突变稳定pre-f构型。

18、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述cho细胞分泌信号肽使pre-f三聚体分泌至细胞培养基中。

19、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述rsv-a亚型pre-f三聚体蛋白纯度≥98%，rsv-b亚型纯度100%。

20、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述铝佐剂为氢氧化铝，每0.5ml剂量含铝0.35mg。

21、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：每0.5ml剂量包含：

22、rsv-a亚型pre-f三聚体蛋白60μg；

23、rsv-b亚型pre-f三聚体蛋白60μg；

24、氢氧化铝，以al3+计，0.35mg；

25、nacl 135 mmol/l；

26、tris-hcl 20 mmol/l，ph 7.6；

27、吐温-80 0.5‰。

28、作为本发明所述一种双价呼吸道合胞病毒rsv疫苗的一种优选方案，其中：所述连接子为gsgsgs。

29、第二方面，本发明实施例提供了上述疫苗在制备预防rsv感染药物的用途。

30、本发明有益效果为：本发明通过在f蛋白单体间引入三对链间二硫键，同时在单链内部构建s155c/s290c链内二硫键，直接将抗原锁定在pre-f构象；经37℃加速试验28d仍保持≥95%三聚体纯度，显著优于现有需冻干的产品。

31、本发明省去t4-foldon等非病毒片段，仅依赖天然氨基酸突变即可自组装，降低潜在免疫原性和安全性风险。

32、本发明表达后无需细胞内酶切即可得到成熟蛋白，避免残留p27降低纯度或掩蔽抗原位点，简化纯化流程。

33、本发明抗原在20mmtris-hcl／150mmnacl／0.05%吐温-80缓冲液中长期稳定，可直接与0.35mgal3+/剂量氢氧化铝吸附成疫苗，无需冻干和复溶环节。

34、本发明等质量混合rsv-a和rsv-bpre-f三聚体，既维持a型高致病毒株的强中和表位，也抵御b型免疫逃逸株，适应不同地区交替或共流行格局。

35、本发明在小鼠模型中，含铝疫苗诱导的血清中和抗体gmt比无铝抗原高7~37倍；cd4+/cd8+t细胞tnf-α、ifn-γ阳性率分别达70%/40%以上，兼具体液与细胞免疫。

36、本发明纯度高、安全性好，可作为孕晚期妇女主动免疫或老年人、基础病患者直接接种的候选疫苗。