一种含槲皮素的组合物及其用于延缓睾丸衰老的方法

本发明涉及细胞生物学，具体为一种含槲皮素的组合物及其用于延缓睾丸衰老的方法。

背景技术：

1、随着生活水平提高和医疗条件改善，睾丸作为男性重要的生殖器官，随着年龄的增长其功能和结构会发生渐进性退化，表现出激素分泌功能下降和生精能力的减弱，自然衰老是指生物个体的正常生理功能随着时间的推移而出现的机体组织器官的退行性变化，和年龄呈现正相关，衰老是一个复杂的过程，涉及到基因组的不稳定、端粒损耗、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失等多个层面，睾丸衰老则表现为睾丸的结构和功能随着年龄的增加逐渐衰退；

2、当前临床针对男性睾丸衰老和性腺功能减退的治疗仍以睾酮替代疗法为主，存在明显的毒副作用风险，对男性生育能力存在不良影响，中医药领域虽有淫羊藿苷、齐墩果酸、枸杞多糖等单体成分在延缓生殖衰老方面有一定效果，但其具体作用靶点和分子机制尚未完全阐明，且多聚焦于抗氧化应激或单一信号通路，缺乏对睾丸能量代谢的有效调控。

技术实现思路

1、本发明提供一种含槲皮素的组合物及其用于延缓睾丸衰老的方法，可以有效解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种含槲皮素的组合物，该组合物由活性成分和溶剂与分散介质组成；

3、所述活性成分包括槲皮素和槲皮素-3-o-葡萄糖醛酸，槲皮素：que，槲皮素-3-o-葡萄糖醛酸：q3g；

4、que为天然黄酮醇类化合物，存在于水果、蔬菜及多种药用植物中，q3g是槲皮素在机体内的代谢产物，是槲皮素经口服后在人体小肠和肝脏中经葡萄糖醛酸化反应生成的代谢物，也是血浆和多种组织中槲皮素的主要循环形式；

5、所述溶剂与分散介质为1%羧甲基纤维素钠溶液，是一种高分子多糖类辅料，选用1%羧甲基纤维素钠溶液作为分散介质和溶剂载体。

6、根据上述技术方案，所述含槲皮素组合物不同浓度配方，配置以下三种浓度规格：

7、低剂量槲皮素混悬液：每1ml1%羧甲基纤维素钠溶液中加入45mg槲皮素粉末；

8、高剂量槲皮素混悬液：每1ml1%羧甲基纤维素钠溶液中加入90mg槲皮素粉末；

9、阳性对照nad+混悬液：每1ml1%羧甲基纤维素钠溶液中加入100mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nad+。

10、根据上述技术方案，所述含槲皮素组合物在体外细胞实验部分，组合物的配置方式不同：

11、槲皮素和q3g均使用完全培养基溶解配制成相应浓度的储备液或工作液，并对不同浓度梯度进行筛选；

12、体外实验中用于诱导睾丸支持细胞衰老的造模药物为阿霉素doxo，经cck-8筛选确定后，用于建立doxo诱导的tm4细胞衰老模型。

13、一种含槲皮素的组合物用于延缓睾丸衰老的方法，该方法包括体内实验流程和体外实验流程；

14、体内实验流程具体如下：

15、步骤11，实验动物与分组；

16、步骤12，样本采集与处理；

17、步骤13，一般表型与形态学观察；

18、步骤14，血清生殖激素水平检测；

19、步骤15，精子质量分析；

20、步骤16，细胞衰老水平检测；

21、步骤17，透射电子显微镜观察；

22、步骤18，蛋白表达水平检测；

23、步骤19，免疫荧光染色；

24、体外实验流程具体如下：

25、步骤21，细胞培养与药物浓度筛选；

26、步骤22，doxo诱导的tm4细胞衰老模型构建；

27、步骤23，实验分组与干预；

28、步骤24，细胞衰老相关因子检测；

29、步骤25，seahorse xf能量代谢分析；

30、步骤26，ampk及糖酵解相关因子检测；

31、步骤27，ampk敲低验证实验。

32、根据上述技术方案，所述11，选用sd大鼠作为实验动物，根据大鼠月龄将其分为不同的实验组别：

33、选用6月龄青年sd大鼠作为正常对照组control，选用16月龄老年sd大鼠构建自然衰老模型，将老年大鼠进一步随机分为：模型对照组model、低剂量槲皮素组l-que、高剂量槲皮素组h-que、阳性对照组nad+，各组每日药物灌胃一次，连续干预60天，模拟长期干预对睾丸衰老的影响；

34、所述12，药物干预结束后，对大鼠禁食后进行麻醉，经心尖采集血液，将血液静置凝固后离心处理，吸取上层淡黄色血清部分，保存待用；

35、解剖大鼠取出双侧睾丸，去除睾丸周围的脂肪组织、结缔组织和血管膜，称取睾丸鲜重，计算睾丸指数；

36、将一侧睾丸速冻后冻存，另一侧睾丸置于多聚甲醛溶液中固定，同时取附睾组织，在生理盐水中切口，使精子释放，制备精子悬液；

37、所述13，在干预期间，每日观察并详细记录各组大鼠的生长状况；

38、睾丸组织病理学检测方面，将固定于多聚甲醛溶液中的睾丸组织经针尖刺破包膜后继续固定，使固定液渗透，随后进行组织梯度脱水和包埋处理，用切片机将包埋好的组织块切成石蜡切片，于烘箱中烘烤脱蜡后，存放备用；

39、将石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察检测。

40、根据上述技术方案，所述14，采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中的生殖激素水平，包括睾酮、促黄体生成素和卵泡刺激素；

41、以标准品浓度为横坐标、光密度值为纵坐标制作标准曲线，通过四参数logistic曲线拟合计算各血清样本中的激素浓度；

42、所述15，将附睾尾置于生理盐水中，做切口释放精子，使精子充分游出，过滤除去组织碎片，获得精子悬液，滴于载玻片上，对精子的运动参数进行评估；

43、精子形态学观察采用巴氏染色法，取精子悬液滴于载玻片上制成均匀涂片，自然晾干后经固定液固定，按巴氏染色步骤进行，观察精子的形态学变化；

44、所述16，通过sa-β-gal染色来评估睾丸组织中的细胞衰老水平，先制备冰冻切片后进行sa-β-gal染色，最后用水溶性封片剂封片；

45、染色结果在光学显微镜下观察，以蓝绿色阳性信号评估细胞衰老水平，并用imagej软件对阳性染色区域面积进行定量统计分析。

46、根据上述技术方案，所述17，取睾丸组织样品，切成小块，置于预冷的电镜固定液中固定，样品经后固定、梯度丙酮脱水、包埋、切片、铀铅双染色的透射电镜标准制样流程处理后，在透射电子显微镜下观察睾丸支持细胞的线粒体超微结构变化，评估线粒体的形态大小、膜结构完整性、线粒体嵴的排列密度及基质状态；

47、所述18，采用western blot法检测睾丸组织中多种蛋白的表达水平，经过蛋白提取、研磨及离心后，收集上清液保存备用，上清液即为组织总蛋白；

48、采用bca法测定蛋白浓度：将蛋白原液加入超纯水稀释，以牛血清白蛋白制作标准曲线，每孔加入lbca工作液和标准品或待测样品，孵育后，测定光密度值，计算各样品蛋白浓度，根据蛋白浓度计算上样量；

49、sds-page凝胶电泳采用一步法page凝胶快速制备试剂盒配制10%分离胶和压缩胶；

50、电泳时先使蛋白在压缩胶中压缩成一条线，随后使蛋白在分离胶中根据分子量分离，电泳结束后用湿转法将蛋白转移至pvdf膜，甲醇激活pvdf膜后，按顺序组装好转膜三明治，装入转膜槽后倒入免冰浴快速转膜缓冲液，400毫安恒流转膜1.5小时；

51、转膜完成后取出pvdf膜，用蛋白快速封闭液封闭，tris缓冲盐溶液洗膜，加入一抗在4℃摇床上孵育过夜；

52、次日回收一抗后，tris缓冲盐溶液洗膜3次，每次5分钟，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育，tris缓冲盐溶液洗膜后，进行化学发光显影，使用omni-ecl通用型化学发光检测试剂盒，将pvdf膜置于发光液中孵育，在蛋白印迹化学发光仪中进行曝光拍照，并用imagej软件分析各条带的灰度值，以目标蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为相对表达量进行统计分析；

53、所述19，通过免疫荧光染色检测睾丸组织中hk2和wt1蛋白的表达与共定位，将石蜡切片修复后，用过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，随后用triton x-100通透，山羊血清封闭液封闭，滴加一抗覆盖切片，孵育过夜；

54、次日用磷酸盐缓冲液冲洗，滴加相应的荧光标记二抗，避光孵育，磷酸盐缓冲液避光冲洗后，用dapi溶液对细胞核进行染色，避光冲洗后用抗荧光淬灭封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照；

55、wt1主要定位于支持细胞细胞核作为支持细胞的特异性标志物，hk2的荧光信号强度反映糖酵解活性，通过imagej软件对两者的荧光强度和共定位程度进行定量分析。

56、根据上述技术方案，所述21，选用小鼠睾丸支持细胞系tm4进行体外细胞实验，tm4细胞用含10%胎牛血清的完全培养基，置于二氧化碳培养箱中常规培养传代；

57、采用cck-8法筛选槲皮素和q3g的安全有效浓度，取对数生长期的tm4细胞，接种于96孔板中，培养使细胞贴壁生长后，更换为含系列浓度槲皮素或q3g的完全培养基，每种浓度设置复孔，每孔加入10μlcck-8试剂，孵育后，测定光密度值，计算各浓度组的细胞活力，以细胞活力大于对照组且有促进增殖作用的最低浓度为最适浓度；

58、所述22，取对数生长期的tm4细胞，接种于培养板中培养，后更换为含适当浓度阿霉素的完全培养基，处理24小时诱导细胞衰老，随后弃去含阿霉素的培养基，更换为完全培养基或含槲皮素、q3g的完全培养基进行后续干预实验，通过western blot检测衰老相关蛋白p16、p21和γ-h2ax的表达水平显著升高来验证衰老模型构建成功。

59、根据上述技术方案，所述23，体外实验分为空白对照组：tm4组，模型组：tm4加doxo组，槲皮素干预组：tm4加doxo加que组，q3g干预组：tm4加doxo加q3g组；

60、所述24，收集各组干预后的细胞，提取细胞总蛋白，采用western blot法检测衰老相关因子p16、p21、p53和γ-h2ax的蛋白表达水平，同时采用免疫荧光染色法，在激光共聚焦显微镜下观察衰老相关因子的细胞内分布和表达水平；

61、所述25，采用seahorse xf细胞能量代谢分析仪实时检测各组活细胞的能量代谢状态，将tm4细胞接种于seahorse xf专用细胞培养板中；

62、检测时换上seahorse xf分析培养基，在seahorse xf分析仪中进行实时测定；

63、耗氧率检测方面，在测定过程中依次向各孔注入寡霉素、fccp和抗霉素a，通过耗氧率曲线的变化计算细胞的指标；

64、细胞外酸化率检测方面，通过测定细胞外酸化率曲线计算细胞的指标，反映细胞糖酵解通量的变化。

65、根据上述技术方案，所述26，采用western blot法检测各组细胞中ampk和糖酵解相关因子的表达水平，以p-ampk与总ampk的比值反映ampk的磷酸化激活水平，以各糖酵解关键酶的表达水平反映细胞的糖酵解活性；

66、同时采用免疫荧光染色法检测hk2、pkm2和ldhc在细胞内的表达分布和荧光强度；

67、所述27，为验证ampk在槲皮素调节糖酵解和延缓睾丸支持细胞衰老中的关键介导作用，构建ampkα基因敲低的稳定细胞系；

68、对tm4-shnc和tm4-shampkα两组细胞进行转录组学测序，筛选差异表达基因并进行go功能和kegg通路富集分析，观察ampk敲低对细胞能量代谢相关通路的影响，随后以槲皮素和q3g分别干预tm4-shampkα细胞，采用western blot法检测糖酵解相关因子的表达水平变化，验证在ampk缺失情况下槲皮素对糖酵解的调节作用。

69、与现有技术相比，本发明的有益效果：

70、1、通过含槲皮素组合物实现延缓睾丸衰老，其核心机制在于构建了一条ampk-糖酵解代谢轴，在槲皮素进入体内后，通过口服吸收并经代谢转化为q3g的活性代谢产物，在睾丸组织中蓄积并激活支持细胞内的ampk信号通路，活化的ampk作为细胞的能量感受器，一方面直接磷酸化激活下游代谢酶类，增强葡萄糖摄取和糖酵解反应，另一方面上调hk2、pkm2、ldhc的糖酵解关键酶的表达水平，促进葡萄糖向乳酸的转化效率，增加atp和乳酸的产量，而乳酸作为生精细胞的首选能量底物，通过单羧酸转运蛋白从支持细胞转运至生殖细胞，为精子的发生和成熟提供充足的能量供给；

71、与此同时，ampk激活还上调线粒体sirt3的表达，改善线粒体功能完整性，促进丙酮酸进入三羧酸循环进行氧化磷酸化，进一步增强细胞的能量供应能力，能量代谢状态的改善进一步反馈性地下调p16、p21、p53和γ-h2ax的衰老标志物的表达，抑制细胞衰老程序，维持支持细胞的数量和功能完整性，改善血睾屏障的通透性和选择性，最终实现对睾丸形态结构、激素分泌、精子发生和能量代谢的全方位保护效应，从而实现延缓睾丸衰老的整体效果。

72、2、通过体内动物实验和体外细胞实验相结合，有效阐明含槲皮素组合物延缓睾丸衰老的具体分子机制，自然衰老状态下的睾丸组织呈现典型的衰老表型，包括血清睾酮水平下降、促性腺激素水平代偿性升高、曲细精管结构萎缩、生精细胞层次减少、精子质量下降，以及支持细胞线粒体超微结构损伤和功能障碍，分子层面表现为衰老标志物p16、p21、p53和γ-h2ax表达升高，ampk磷酸化水平降低，糖酵解关键酶hk2、pkm2、ldhc和sirt3表达下调，导致生精微环境能量供给不足。

73、综合上述，通过槲皮素组合物激活睾丸支持细胞中ampk信号通路，上调糖酵解关键酶，增强乳酸产生和atp合成，并维持生精微环境能量稳态，下调衰老标志物，延缓睾丸衰老，槲皮素在体内经代谢后主要转化为q3g形式发挥作用，两者均可通过ampk-糖酵解代谢轴，将能量感知、代谢重编程和生殖功能维持三者连接起来，从而改善自然衰老的睾丸功能损伤。