一种基于防接触垫片的组织切片处理方法

本技术涉及生物组织切片处理与显微成像，特别涉及一种基于防接触垫片的组织切片处理方法。

背景技术：

1、免疫组化染色、免疫荧光染色和多重连续染色均需在组织切片上原位检测蛋白等生物标志物。对于福尔马林固定石蜡包埋组织切片，在脱蜡、水化、抗原修复、封闭、抗体孵育、显色、封片、扫描、脱色或灭活等步骤中，组织会反复经历温度变化、缓冲液冲洗、有机溶剂处理和机械扰动。尤其在多轮连续染色中，同一张切片需反复加液、覆盖盖玻片、成像和移除盖玻片，组织完整性和空间位置稳定性直接影响后续标志物检测、图像配准和单细胞空间分析。

2、常规操作通常是在组织切片上滴加封片液或反应液后直接覆盖盖玻片。盖玻片与组织表面直接接触，盖玻片自重、操作时的外力、液体表面张力、盖玻片滑动以及移除过程中的摩擦都可能导致组织局部受压、脱落或刮擦；对肝癌等异质性强、坏死或纤维化区域多、切片面积较大的样本问题更明显。

3、现有边框、密封垫或小型反应腔主要用于限制液体流动、减少蒸发或形成局部反应空间。但在多轮连续染色中，若采用甘油明胶等封片剂进行明场成像，封片剂在盖玻片、组织切片和载玻片之间形成粘附，直接干态剥离或垂直撬起盖玻片易造成组织局部刮擦、脱落或位移。现有疏水圈、开放式孵育盒或商品化小型反应腔虽能限制反应液扩散或维持湿润环境，但未针对多轮连续染色中盖玻片与组织直接接触带来的机械损伤、局部压片及多轮成像配准不稳定问题提供简单、低成本且兼容常规显微扫描的解决方案。

技术实现思路

1、本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本技术提出一种基于防接触垫片的组织切片处理方法，可降低多轮连续处理、封片、图像采集和去盖玻片过程中的组织面积损失，提高组织形态保持性、组织面积保留率和后续图像的配准稳定性。

2、根据本技术实施例的一种基于防接触垫片的组织切片处理方法，所述防接触垫片具有窗口，所述窗口沿所述防接触垫片的厚度方向贯穿所述防接触垫片，所述基于防接触垫片的组织切片处理方法包括如下步骤：

3、准备载玻片及组织切片，所述组织切片附着于所述载玻片的表面，对所述组织切片进行检测前处理；

4、准备所述防接触垫片，将所述防接触垫片放置于所述载玻片上，并使得所述组织切片或待检测区域完整地处于所述窗口内；

5、向所述窗口内加入封片剂或成像介质；

6、准备盖玻片，覆盖所述盖玻片于所述防接触垫片的上方，使得所述载玻片、所述防接触垫片以及所述盖玻片配合形成间隔腔，以得到封片组件；

7、将所述封片组件进行显微图像采集；

8、完成图像采集后，将所述封片组件置于液体环境中；

9、待所述间隔腔内的所述封片剂或所述成像介质发生物理性状改变后，移除所述盖玻片，对所述组织切片进行后续处理。

10、根据本技术实施例的组织切片处理方法，至少具有如下有益效果：通过在组织切片外围设置防接触垫片支撑盖玻片，使盖玻片与组织切片之间形成由垫片厚度限定的间隔腔，避免盖玻片直接接触或压迫组织切片；同时在图像采集完成后于液体环境中使封片剂或成像介质软化、溶胀或松动后移除盖玻片，避免干态剥离或垂直撬起盖玻片造成的机械损伤。上述防接触封片与液体环境温和去盖片的配合，可减少组织切片在封片、图像采集和去盖片过程中因盖玻片直接压迫、滑移和摩擦导致的局部受压、刮擦、脱落和位移，从而提高组织切片的形态保持性、组织面积保留率以及后续图像配准稳定性。

11、根据本技术的一些实施例，将所述封片组件置于液体环境中步骤，以及所述待所述间隔腔内的所述封片剂或所述成像介质发生软化、溶胀或松动后移除所述盖玻片，对所述组织切片进行后续处理步骤包括：

12、将所述封片组件浸没于缓冲液中，并置于设定温度的水浴锅中，使得所述间隔腔内的所述封片剂或所述成像介质发生软化、溶胀或松动，之后在所述缓冲液的环境中对所述盖玻片施力，使所述盖玻片与所述防接触垫片分离。

13、根据本技术的一些实施例，所述向所述窗口内加入封片剂或成像介质步骤中，所述封片剂或所述成像介质的加入量根据所述防接触垫片的厚度和所述窗口的面积确定，使得所述封片剂或所述成像介质基本填充所述间隔腔。

14、根据本技术的一些实施例，所述封片剂包括甘油明胶，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液，所述水浴锅的设定温度范围为36.5℃-37.5℃。

15、根据本技术的一些实施例，在所述准备所述防接触垫片，将所述防接触垫片放置于所述载玻片上，并使得所述组织切片或待检测区域完整地处于所述窗口内步骤之前，还包括如下步骤：

16、选择合适规格的所述防接触垫片，所述防接触垫片的整体尺寸和窗口尺寸根据所述组织切片大小或所述待检测区域大小、所述盖玻片尺寸、所述载玻片尺寸、组织切片厚度、所述封片剂黏度以及显微扫描焦平面要求中的至少两项数据确定。

17、根据本技术的一些实施例，所述组织切片或所述待检测区域的边缘与所述窗口内边缘的距离范围在0.5mm-5mm，所述防接触垫片的外侧面距离所述窗口内边缘的距离d的范围为0.3mm≤d≤8mm，所述防接触垫片的厚度h范围为20μm≤h≤500μm。

18、根据本技术的一些实施例，所述防接触垫片的外侧面距离所述窗口内边缘的距离d范围为0.5mm≤d≤5mm，所述防接触垫片的厚度h范围为50μm≤h≤150μm。

19、根据本技术的一些实施例，所述准备所述防接触垫片，将所述防接触垫片放置于所述载玻片上，并使得所述组织切片或待检测区域完整地处于所述窗口内步骤，包括：

20、在所述防接触垫片用于与所述载玻片贴合的表面设置粘附层，所述防接触垫片通过所述粘附层粘合于所述载玻片上，以固定所述防接触垫片。

21、根据本技术的一些实施例，所述待所述间隔腔内的所述封片剂或所述成像介质发生物理性状改变后，移除所述盖玻片，对所述组织切片进行后续处理步骤之后，还包括如下步骤：

22、对所述组织切片进行下一轮检测前处理后，重复执行加入所述封片剂或所述成像介质、覆盖所述盖玻片、图像采集和移除所述盖玻片的操作，循环执行上述步骤多次直至完成预定轮次的检测。

23、根据本技术的一些实施例，所述对所述组织切片进行检测前处理包括：

24、当所述组织切片为福尔马林固定石蜡包埋组织切片时，所述检测前处理包括脱蜡、水化和抗原修复处理；当所述组织切片为冰冻组织切片时，所述检测前处理包括固定和洗涤处理。

25、根据本技术上述实施例的组织切片处理方法，至少具有如下有益效果：1.将封片组件浸没于缓冲液并置于控温水浴中，使封片剂均匀软化而非局部硬化残留，降低去盖片时的剪切力和摩擦力。采用甘油明胶配合磷酸盐缓冲液、36.5℃-37.5℃水浴时，可在有效软化封片剂的同时不损伤组织结构。2.根据组织切片规格和成像要求选择垫片的窗口尺寸、垫片的宽度及厚度，并按垫片厚度和窗口面积确定封片剂用量以充分填充间隔腔，确保形成连续均匀的成像介质层，避免气泡和液层不均，满足明场或荧光扫描的聚焦要求。3.防接触垫片表面设置粘附层以粘合盖玻片，防止图像采集过程中盖玻片滑移，保持间隔腔距离恒定，提高焦平面稳定性和跨轮次图像配准精度。4.每轮均利用防接触封片与液体环境温和去盖片的配合，将单轮机械损伤控制在较低水平且不随轮次累积放大。实验表明，组织大片经5轮连续染色后累计面积损失率仍≤0.64%，且该方法可兼容组织大片和组织芯片的高轮次连续处理。

26、本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。