一种适用于CosMxSMI空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法与流程

本发明涉及脱片，具体涉及一种适用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法。

背景技术：

1、cosmx spatial molecular imager（smi）是一种基于原位杂交、循环报告探针杂交和高分辨率荧光成像读出的空间分子成像分析平台，可在福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, ffpe）组织切片或新鲜冰冻切片中原位检测并定量多种rna和蛋白靶点。该系统在样本制备阶段通常包括切片固定和透化、rna探针杂交、洗涤、oligo标记形态学抗体杂交、flow cell组装、成像视野（field of view, fov）选择以及仪器端多轮报告探针杂交和荧光成像等步骤。

2、与常规苏木精-伊红染色、免疫组化或单轮免疫荧光相比，cosmx smi对ffpe切片的组织附着稳定性要求更高。原因在于：其一，切片需经历脱蜡、复水/脱水、高温抗原修复、蛋白酶通透和多次洗涤；其二，后续还需与flow cell结合并在仪器内完成多轮液体交换、报告探针杂交和成像；其三，空间转录组实验通常需要保持组织结构、细胞边界、rna信号点位和形态学标记的空间对应关系，一旦组织局部翘边、皱缩、漂浮或脱落，会直接导致roi丢失、细胞分割不准确、转录本计数下降或整张切片实验失败。

3、现有ffpe切片样本制备通常采用常规病理贴片和烤片流程，例如42℃展片后贴附于载玻片并进行一次性50-60℃烤片或常规脱蜡处理。该类流程能够满足一般组织学染色，但在cosmx smi这类长流程、多轮液体交换和高温/酶消化并存的空间转录组实验中，会出现如下缺点：常规一次性烤片或常规脱蜡处理难以抵御cosmx smi流程中的高温抗原修复、蛋白酶通透、长时间液体交换和flow cell组装操作，切片存在翘边、局部脱落或整体脱片风险；单纯延长烤片时间虽然可能增强组织附着，但容易造成组织过度干燥、rna保存质量下降、形态学抗体信号受影响或后续探针进入组织效率降低；仅依赖提高载玻片黏附性不能充分解决脱蜡、抗原修复、乙醇脱水和蛋白酶消化之间的应力变化，尤其不能稳定控制切片在各处理阶段的附着状态；现有cosmx smi标准流程更强调探针杂交、成像和数据读取，对ffpe切片防脱片的前处理参数缺少针对性优化，不利于在不同批次ffpe样本中获得稳定结果。

4、综上，现有技术得到的ffpe切片样本，可能出现组织边缘翘起、组织碎片脱落、局部区域缺失、切片与载玻片附着不均一等问题。尤其对于组织面积较大、纤维化明显、坏死区域较多、脂肪含量较高或切片保存时间较长的ffpe样本，脱片风险更高。

5、因此，亟需建立一种与cosmx smi标准样本处理流程兼容、操作简便、无需改变仪器端读出逻辑，无需引入复杂组织扩张或清除步骤，并能显著提高ffpe切片附着稳定性的防脱片处理方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种适用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法。本发明通过优化展片、贴片、分段烤片、水浴热处理、过夜脱蜡、抗原修复后干燥以及低浓度蛋白酶通透等关键步骤，提高ffpe组织切片在cosmx smi全流程中的附着稳定性，并兼顾组织形态保持、rna信号检测和后续多轮荧光成像的兼容性。本发明适用于ffpe组织切片，尤其适用于需要进行cosmx smi空间转录组或空间多组学检测的肿瘤组织、炎症组织、纤维化组织、临床归档组织以及存在较高脱片风险的石蜡样本。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、一种用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，包括以下步骤：

4、s1、将ffpe组织制备为石蜡切片，并在40-45℃水浴中展片后贴附于载玻片，得到贴片后载玻片；

5、s2、将s1所得贴片后载玻片进行分段热处理：先于65℃下烤片2h，再进行62℃水浴处理1h，随后再于65℃下烤片2h，得到热处理切片；

6、s3、将s2所得热处理切片置于60℃条件下脱蜡至少16h，得到脱蜡后的切片；

7、s4、将s3所得脱蜡后的切片依次采用一次清洗液二甲苯、二次清洗液二甲苯、三次清洗液100%乙醇和四次清洗液100%乙醇清洗切片，再烘干，并置于室温平衡，得到一次清洗后切片；

8、s5、将s4所得一次清洗后切片置于预热的1×cosmx retrieval buffer抗原修复液中，于100℃水浴处理15min，得到抗原修复后切片；

9、s6、将s5所得抗原修复后切片转移至新鲜depc水中，上下移动15s清洗；随后置于100%乙醇中的时间为3min，再转移至洁净、低尘、低纤维脱落的吸水擦拭材料上，室温干燥30-60min，得到二次清洗后切片；

10、s7、采用疏水性组化笔在s6所得二次清洗后切片的组织区域外围描绘闭合线，以形成封闭的疏水围栏；向所述疏水围栏围成的区域内滴加室温digestion buffer，使digestion buffer完全覆盖组织区域，得到一次处理切片；

11、s8、将s7所得一次处理切片置于预热至40℃的湿盒中，并于40℃烘箱孵育30min，得到二次处理切片；

12、s9、将s8所得二次处理切片转移至depc水中洗涤2次，每次上下移动切片3-5次；洗涤后的切片暂存于depc水中，随后进入cosmx smi标准流程。

13、所述s1中，石蜡切片的厚度为4-6μm。

14、所述s4中，一次清洗液二甲苯清洗时间为5min；二次清洗液二甲苯清洗时间为5min；三次清洗液100%乙醇清洗时间为2min；四次清洗液100%乙醇清洗时间为2min。

15、所述s4中，在60℃下烘干5min。

16、所述s5中，1×cosmx retrieval buffer抗原修复液在100℃下预热15min。

17、所述s7中，所述digestion buffer为将浓度为20mg/ml的proteinase k储备液稀释至浓度为3μg/ml的工作浓度并溶于1×pbs中。

18、本发明的有益效果是：1.本发明能够显著提高ffpe组织切片在前处理过程中的组织保留完整性，降低脱片、翘边和局部组织缺损风险；尤其适用于组织面积较大、结构松散或珍贵临床ffpe样本的空间转录组分析。

19、2.本发明通过提高组织切片保留完整性，进一步增加样本进入cosmx smi标准流程后的有效成像视野数量和可分析组织面积，从而提升空间转录组检测成功率和数据获取效率，即通过分段烤片、水浴热处理、过夜脱蜡、抗原修复后乙醇处理和室温干燥、低浓度proteinase k温和通透以及depc水轻柔洗涤等技术特征，降低了组织切片在前处理和上机流程中的脱片风险。

1.一种用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，所述s1中，石蜡切片的厚度为4-6μm。

3.根据权利要求1所述用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，所述s4中，一次清洗液二甲苯清洗时间为5min；二次清洗液二甲苯清洗时间为5min；三次清洗液100%乙醇清洗时间为2min；四次清洗液100%乙醇清洗时间为2min。

4.根据权利要求1所述用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，所述s4中，在60℃下烘干5min。

5.根据权利要求1所述用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，所述s5中，1×cosmx retrieval buffer抗原修复液在100℃下预热15min。

6.根据权利要求1所述用于cosmx smi空间转录组分析的石蜡组织切片防脱片方法，其特征在于，所述s7中，所述digestion buffer为将浓度为20mg/ml的proteinase k储备液稀释至浓度为3μg/ml的工作浓度并溶于1×pbs中。