一种基于纳米酶技术检测OXA-23阳性鲍曼不动杆菌的方法

本发明涉及鲍曼不动杆菌检测领域，具体地，本发明涉及一种基于纳米酶技术检测oxa-23阳性鲍曼不动杆菌的方法。

背景技术：

1、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii，a.baumannii)作为非发酵革兰阴性杆菌，是不动杆菌属中的一种常见的病原菌。它环境适应力强，能在干燥的环境中长期定植、存活，在潮湿、富含有机物的污水环境中更能持续生存甚至繁殖。近年来，随着广谱抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(carbapeneresistant acinetobacterbaumannii，crab)越来越多，导致临床治疗难度大，病死率高；根据历年chinet统计数据，我国鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率已经从2006年的31.7%和39.9%上升至2021年的71.5%和72.3%。基于国内外相关文献报道，oxa23是鲍曼不动杆菌产生碳青霉烯耐药性的最重要因素之一。

2、目前，crab的检测方法主要有血培养法、pcr或qpcr法。但是现有方法存在灵敏度低的技术问题，存在低浓度模板检测时结果无法确定(如采集样本前使用抗生素、样本中细菌浓度低以及血液中某些杀菌物质)、漏检低浓度样本的可能。且培养法耗时较长，通常需要培养18h以上。

3、因此，开发一种快速且准确的crab检测技术至关重要。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于纳米酶技术检测oxa-23阳性鲍曼不动杆菌的方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种非诊断目的的检测oxa-23酶和/或检测oxa-23阳性鲍曼不动杆菌的方法。

4、进一步，所述方法包括如下步骤：

5、将磁性纳米探针、待测样品加入缓冲液中进行混合孵育，孵育后加载到侧向流免疫层析检测试纸上进行检测；

6、所述磁性纳米探针修饰有第一识别抗体；所述第一识别抗体的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，其序列分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示；所述第一识别抗体的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，其序列分别如seq id no:10、seqid no:11和seq id no:12所示；

7、所述侧向流免疫层析检测试纸上设置有检测线t线，所述检测线t线喷涂第二识别抗体；所述第二识别抗体的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，其序列分别如seq idno:13、seq id no:14和seq id no:15所示；所述第二识别抗体的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，其序列分别如seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18所示。

8、在本发明中，“互补决定区”或“cdr区”或“cdr”或“高变区”，是抗体可变结构域中在序列上高度可变并且形成在结构上确定的环（“超变环”）和/或含有抗原接触残基（“抗原接触点”）的区域。cdr主要负责与抗原表位结合。

9、基于本发明给定抗体或其片段包含的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的cdr。例如，采用imgt方案、kabat方案、abm方案、chothia方案或contact方案限定可变区氨基酸序列中的cdr。

10、在涉及用本发明定义的具体cdr序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体cdr序列，但是由于应用了不同的方案（例如不同的指派系统规则或组合）而导致其所声称的cdr边界与本发明所定义的具体cdr边界不同。

11、本发明抗体的cdr可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“cdr”或“cdr序列”涵盖以上述任一种方式确定的cdr序列。在本发明具体的实施方案中，所述cdr序列的确定方案为imgt方案。

12、进一步，所述第一识别抗体的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列，或与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:1所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

13、进一步，所述第一识别抗体的轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列，或与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

14、进一步，所述第二识别抗体的重链可变区包含seq id no:3所示的氨基酸序列，或与seq id no:3所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:3所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

15、进一步，所述第一识别抗体的轻链可变区包含seq id no:4所示的氨基酸序列，或与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

16、进一步，所述磁性纳米探针的制备方法包括：将磁性纳米颗粒与第一识别抗体结合得到磁性纳米探针。

17、进一步，所述磁性纳米颗粒为aunss@dtnb@os复合纳米粒子。

18、进一步，所述aunss@dtnb@os复合纳米粒子的制备方法包括：诱导金种子还原形成金纳米星aunss，采用dtnb修饰金纳米星aunss，得到aunss@dtnb；将aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液混合，孵育，得到aunss@dtnb@os复合纳米粒子。

19、进一步，所述金种子采用如下方法进行制备：将水和haucl4加热至沸腾，加入柠檬酸钠，搅拌制得；

20、进一步，所述诱导金种子还原形成金纳米星的方法如下：在水中加入haucl4，接着依次加入金种子、柠檬酸钠、sds和对苯二酚水溶液，搅拌；

21、在本发明中，金种子是直径2~40nm、形状近球形的金纳米颗粒。它们的尺寸通常比最终的金纳米星核心要小，以保证在后续的生长阶段能够提供足够的表面位点供金原子沉积。在本发明具体的实施方案中，所述金纳米星的合成是以30nm的金种子为基底，使用对苯二酚还原为金纳米星。

22、进一步，所述采用dtnb修饰金纳米星的方法如下：将dtnb溶液加入金纳米星溶液aunss中，搅拌混合3-5 h后，离心取沉淀，用去离子水重悬沉淀得到aunss@dtnb。

23、进一步，所述dtnb溶液和金纳米星溶液aunss溶液搅拌混合4h。

24、进一步，所述dtnb溶液的浓度为10mm。

25、进一步，所述aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液混合孵育的时间为1.5-2.5h，优选为2h。

26、进一步，所述aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液的体积比为20:1；

27、进一步，所述k2oso4溶液的浓度为20mm。

28、进一步，所述将aunss@dtnb@os复合纳米粒子与第一识别抗体结合得到磁性纳米探针的方法包括：使用羧基活化剂活化aunss@dtnb@os表面的羧基，随后加入第一识别抗体混合孵育，孵育后加入封闭液封闭多余活性位点，离心清洗后得到所述磁性纳米探针。

29、进一步，所述羧基活化剂包括edc和nhs。

30、进一步，所述edc和nhs的浓度为10mm；

31、进一步，所述aunss@dtnb@os与第一识别抗体混合孵育的时间为1-3h，优选为2h。

32、进一步，所述封闭液包括bsa、tbs和奶粉。

33、进一步，所述封闭液为奶粉。

34、在一些实施方案中，可采用化学法或物理法制备磁性纳米探针，所述化学法制备磁性纳米探针分四步：活化、偶联，封闭和保存。所述物理法制备磁性纳米探针无需活化，只需调节ph进行偶联、封闭和保存三个步骤。

35、在本发明具体的实施方案中，采用化学法制备磁性纳米探针，采用羧基活化剂edc和nhs活化磁性粒子表面的羧基，之后将活化后的磁性粒子和抗体孵育进行偶联，然后加入封闭液封闭多余活性位点，将制备得到的磁性纳米探针保存在pb缓冲液中4℃保存。

36、在本发明中，发明人对bsa、tbs和奶粉三种封闭液的效果进行研究，发现bsa的封闭效果较差，而tbs和奶粉封闭效果较好。

37、进一步，所述侧向流免疫层析检测试纸制备的方法包括：按照样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫的顺序依次组装，得到侧向流免疫层析检测试纸。

38、进一步，所述硝酸纤维素膜上设置检测线t线和质控线c线。

39、进一步，所述质控线c线喷涂羊抗鼠igg抗体。

40、进一步，所述检测线t线和质控线c线相距6-10mm。

41、进一步，所述样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫各部分之间有2mm宽的重叠部分。

42、在一些实施方案中，所述侧向流免疫层析检测试纸的组装方法包括：将样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次贴在聚氯乙烯(pvc)支撑板上，各部分之间有2mm宽的重叠部分。

43、在一些实施方案中，样本垫是试纸条最前端的多孔纤维材料，通常为玻璃纤维膜或特殊处理的纤维膜，样本滴加到样本垫上，被快速吸收并均匀分配。吸收垫是试纸条末端的吸水材料，可以为高吸水性纸板、聚酯纤维或滤纸，其可吸附样本中未与t线、c线结合的游离标记物和其他杂质，降低背景信号，提高检测信噪比。

44、进一步，所述磁性纳米探针与待测样品的体积比为1：2。

45、进一步，所述缓冲液为含1% 吐温20和9% 牛奶的pbst缓冲液。

46、进一步，所述磁性纳米探针和待测样品混合孵育的时间为15-30min，优选为20min。

47、进一步，所述待测样品包括环境样品、人体样品，所述人体样品为离体的人体样品。

48、进一步，所述环境样品包括水源。

49、进一步，所述水源包括污水。

50、进一步，所述污水包括废水处理厂、河道、下水道系统中的污水。

51、进一步，所述人体样品包括痰液、肺泡灌洗液、血液或腹水。

52、鲍曼不动杆菌可以在干燥、营养贫瘠的表面存活很长时间，在潮湿、富含有机物的污水环境中更能持续生存甚至繁殖。污水中的生物膜（管道、处理设施内壁）为细菌提供了完美的庇护所，使其免受消毒剂和外界压力的影响。目前，国内外已有大量研究从污水处理厂（包括进水、出水、活性污泥）甚至河流、地表水中检出oxa-23阳性鲍曼不动杆菌或blaoxa-23基因。因此，本发明第一方面所述非诊断和非治疗目的的检测方法用来检测环境样品尤其是污水中是否存在oxa-23阳性鲍曼不动杆菌或blaoxa-23基因，进而研究污水中的细菌组成及耐药情况。

53、另外，blaoxa-23耐药基因通常位于质粒或转座子等可移动遗传元件上。在污水环境中，不同细菌可以通过接合、转化、转导等方式，发生水平基因转移。因此，一些原本不产oxa-23的鲍曼不动杆菌或其他革兰氏阴性菌（如肺炎克雷伯菌）也可能会获得blaoxa-23基因，从而演变成新的耐药菌株。因此，本发明第一方面的非诊断方法还可用于检测环境样品中blaoxa-23基因的存在。

54、在一些实施方案中，待测样品可以生物样品。在一些实施方案中，生物样本包含生物组织或液体。在一些实施方案中，生物样本可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针活检样本；含有细胞的体液；游离漂浮核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；皮肤拭子；口服拭子；鼻拭子；洗涤物(washings)或灌洗物，诸如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；吸出物；刮屑；骨髓标本；组织活检标本；手术标本；粪便，其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或其中的细胞等。

55、本发明第二方面提供一种基于纳米酶技术检测oxa-23阳性鲍曼不动杆菌的系统。

56、进一步，所述系统包括：

57、磁性纳米探针制备单元：用于将aunss@dtnb@os复合纳米粒子与第一识别抗体结合，得到磁性纳米探针；所述第一识别抗体的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，其序列分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示；所述第一识别抗体的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，其序列分别如seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12所示；

58、侧向流免疫层析检测试纸制备单元：用于按照样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫的顺序依次组装，得到侧向流免疫层析检测试纸；所述硝酸纤维素膜上设置检测线t线和质控线c线，所述检测线t线喷涂第二识别抗体；所述第二识别抗体的重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，其序列分别如seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15所示；所述第二识别抗体的轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，其序列分别如seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18所示；

59、检测单元：用于将磁性纳米探针、待测样品加入缓冲液中进行混合孵育，孵育后加载到侧向流免疫层析检测试纸上进行检测。

60、进一步，所述第一识别抗体的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列，或与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:1所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

61、进一步，所述第一识别抗体的轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列，或与seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:2所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

62、进一步，所述第二识别抗体的重链可变区包含seq id no:3所示的氨基酸序列，或与seq id no:3所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:3所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

63、进一步，所述第一识别抗体的轻链可变区包含seq id no:4所示的氨基酸序列，或与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，或与seq id no:4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入或其任意组合的序列。

64、进一步，所述aunss@dtnb@os复合纳米粒子的制备方法包括：诱导金种子还原形成金纳米星aunss，采用dtnb修饰金纳米星aunss，得到aunss@dtnb；将aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液混合，孵育，得到aunss@dtnb@os复合纳米粒子；

65、进一步，所述金种子采用如下方法进行制备：将水和haucl4加热至沸腾，加入柠檬酸钠，搅拌制得；

66、进一步，所述诱导金种子还原形成金纳米星的方法如下：在水中加入haucl4，接着依次加入金种子、柠檬酸钠、sds和对苯二酚水溶液，搅拌；

67、进一步，所述采用dtnb修饰金纳米星的方法如下：将dtnb溶液加入金纳米星溶液aunss中，搅拌混合3-5 h后，离心取沉淀，用去离子水重悬沉淀得到aunss@dtnb。

68、进一步，所述dtnb溶液和金纳米星溶液aunss溶液搅拌混合4h。

69、进一步，所述dtnb溶液的浓度为10mm。

70、进一步，所述aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液混合孵育的时间为1.5-2.5h，优选为2h。

71、进一步，所述aunss@dtnb溶液与k2oso4溶液的体积比为20:1；

72、进一步，所述k2oso4溶液的浓度为20mm。

73、进一步，所述将aunss@dtnb@os复合纳米粒子与第一识别抗体结合得到磁性纳米探针的方法包括：使用羧基活化剂活化aunss@dtnb@os表面的羧基，随后加入第一识别抗体混合孵育，孵育后加入封闭液封闭多余活性位点，离心清洗后得到所述磁性纳米探针。

74、进一步，所述羧基活化剂包括edc和nhs。

75、进一步，所述edc和nhs的浓度为10mm。

76、进一步，所述aunss@dtnb@os与第一识别抗体混合孵育的时间为1-3h，优选为2h。

77、进一步，所述封闭液包括bsa、tbs和奶粉。

78、进一步，所述封闭液为奶粉。

79、进一步，所述系统还包括结果判定单元，用于根据侧向流免疫层析检测试纸上的条带判断待测样品中是否含有oxa-23阳性鲍曼不动杆菌。

80、进一步，当检测线t线和质控线c线同时出现条带，则判断待测样品中含有oxa-23阳性鲍曼不动杆菌；当只有质控线c线出现条带，则判断待测样品中不含有oxa-23阳性鲍曼不动杆菌；当质控线c线无条带或只有检测线t线有条带，则判断本次检测结果无效。

81、进一步，所述质控线c线喷涂羊抗鼠igg抗体。

82、进一步，所述检测线t线和质控线c线相距6-10mm。

83、进一步，所述样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫各部分之间有2mm宽的重叠部分。

84、进一步，所述磁性纳米探针与待测样品的体积比为1：2。

85、进一步，所述缓冲液为含1% 吐温20和9% 牛奶的pbst缓冲液。

86、进一步，所述磁性纳米探针和待测样品混合孵育的时间为15-30min，优选为20min。

87、进一步，所述待测样品包括环境样品、人体样品，所述人体样品为离体的人体样品。

88、进一步，所述环境样品包括水源。

89、进一步，所述水源包括污水。

90、进一步，所述污水包括废水处理厂、河道、下水道系统中的污水。

91、进一步，所述人体样品包括痰液、肺泡灌洗液、血液或腹水。

92、应该理解到，本发明所述的系统可以通过其它的方式实现。例如，所述模块/单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个模块或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，装置或模块的间接耦合或通信连接，可以是电性，机械或其它的形式。

93、所述作为分离部件说明的模块可以是或者也可以不是物理上分开的，作为模块显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。

94、本发明第三方面提供本发明第一方面所述的磁性纳米探针和侧向流免疫层析检测试纸在制备检测oxa-23酶和/或检测oxa-23阳性鲍曼不动杆菌的产品中的应用。

95、本发明第四方面提供一种计算机设备。

96、进一步，所述计算机设备包括：存储器和处理器；所述存储器用于存储计算机程序；所述处理器执行所述计算机程序以实现本发明第一方面所述的方法。

97、在本发明中，所述处理器还可以称为cpu(central processing unit，中央处理单元)。处理器可以是一种集成电路芯片，具有信号的处理能力。处理器还可以是通用处理器、数字信号处理器(dsp)、专用集成电路(asic)、现场可编程门阵列(fpga)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。通用处理器可以是微处理器或者该处理器也可以是任何常规的处理器等。

98、在本发明中，所述计算机设备可以是移动电子设备。

99、本发明第五方面提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明第一方面所述的方法。

100、本发明第六方面提供一种计算机程序产品，包括计算机程序，该计算机程序被处理器执行时实现本发明第一方面所述的方法。

101、在本发明中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

102、本发明的优点和有益效果：

103、本研究创新性地以crab特异性分泌至菌体外的活性oxa-23碳青霉烯酶为直接检测靶标。与传统基于菌体抗原或核酸的检测方法相比，该策略省去了复杂的破壁提取步骤；同时，由于oxa-23是crab耐药的关键功能分子，且在高流行株中广泛存在，使其兼具病原识别与耐药性直接判定的双重价值。