一种狼疮肾炎诊断标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种狼疮肾炎诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、狼疮肾炎（lupus nephritis，ln）是系统性红斑狼疮（systemic lupuserythematosus，sle）最常见的器官并发症，也是影响sle患者预后和生活质量的关键因素。临床流行病学数据显示，超过50%的sle患者在病程中会出现肾脏受累的临床表现，而肾活检发现，几乎所有sle患者都存在不同程度的肾脏病理改变。狼疮肾炎的临床表现多样，轻者可仅表现为轻微蛋白尿，重者可快速进展为肾功能衰竭。及时准确地诊断狼疮肾炎、判断其活动性并监测治疗效果，对于改善患者预后至关重要。

2、目前，狼疮肾炎的诊断和监测手段主要包括：肾活检、血清学指标和尿常规检查。肾活检虽然是金标准，但作为一种侵入性检查，存在禁忌症和并发症风险，且无法频繁重复。血清学指标如抗ds-dna抗体、补体c3/c4等主要反映全身性免疫异常，对肾脏局部病变的特异性不足。尿蛋白定量是临床上最常用的无创监测指标，但蛋白尿的出现往往滞后于肾脏免疫病理改变，且在区分活动性肾炎和慢性肾损伤方面存在局限。因此，开发能够早期、准确、无创地反映狼疮肾炎活动性的新型生物标志物，是该领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供生物标志物asialoglycoprotein receptor 2在诊断狼疮肾炎中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供如下任一项应用：

4、（1）检测待测样本中生物标志物表达水平的试剂在制备狼疮肾炎诊断产品中的应用，所述生物标志物为asialoglycoprotein receptor 2；

5、（2）检测待测样本中生物标志物表达水平的试剂在制备系统性红斑狼疮分型产品中的应用，所述生物标志物为asialoglycoprotein receptor 2。

6、进一步，所述系统性红斑狼疮分型包括狼疮肾炎和无肾脏受累的系统性红斑狼疮。

7、本技术通过蛋白质组学质谱分析发现，asialoglycoprotein receptor 2在狼疮肾炎患者外周血中表达升高，且roc分表明auc大于0.8，这提示asialoglycoproteinreceptor 2可以区分ln患者和正常人，从而对ln患者进行判断。

8、在本发明中，asialoglycoprotein receptor 2包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的asialoglycoprotein receptor 2，以及源自细胞中加工的任何形式的asialoglycoprotein receptor 2。该术语涵盖asialoglycoprotein receptor 2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。asialoglycoprotein receptor 2包含人的asialoglycoprotein receptor 2以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的asialoglycoprotein receptor 2，在本发明中，asialoglycoprotein receptor 2为人的蛋白，其相关信息可以在ncbi上查询，其在ncbi上对应的基因id为433。

9、申请中使用的术语“狼疮肾炎”和“ln”可互换使用；“系统性红斑狼疮”和“sle”可互换使用；“无肾脏受累的系统性红斑狼疮”和“sle without ln”可互换使用。

10、本技术中使用的术语“诊断”是指通过其体征、症状、且尤其是各种诊断过程(包括检测从个体中获得的生物样品(如血清)中的asialoglycoprotein receptor 2水平)的结果来鉴定医学疾患或疾病(如ln)的过程。而且，作为本文使用的术语“诊断”包括疾病的筛查、辅助确诊、确诊(判断是否存在疾病)、预测或者判断疾病的严重程度、评估疾病活动度、监控治疗，例如治疗过程中监测疾病恶化或复发、评价疾病的治疗效力、以及给定治疗方案的选择等。不作限制，在一些具体的实施例中，本技术已充分证实基于asialoglycoproteinreceptor 2水平可用于判断受试者ln的存在与否，进而可用于筛查、辅助确诊、确诊。

11、本技术中使用的术语“roc”或“roc曲线”是指接受者操作特性曲线(receiveroperating characteristic curve)，又称为感受性曲线(sensitivity curve)，roc曲线可以是二元分类器系统的性能的图形表示。对于任何给定方法，roc曲线可以通过在多种阈值设置下针对特异性绘制灵敏度来产生。此外，只要提供三种参数(例如灵敏度、特异性和阈值设定)中的至少一种，并且roc曲线可以确定任何未知参数的值或预期值，未知参数可以使用针对roc曲线拟合的曲线测定。

12、本技术中使用的术语“auc”或“rocauc”通常是指接受者操作特性曲线下方部分的面积，即area under curve。这一度量考虑方法的灵敏度和特异性，可以提供方法的诊断效用的测量值。通常，rocauc在0.5到1.0范围内，其中更接近0.5的值表明方法具有有限的诊断效用(例如较低的灵敏度和/或特异性)，并且更接近1.0的值表明方法具有较大的诊断效用(例如较高的灵敏度和/或特异性)。

13、进一步，所述生物标志物表达水平包括核酸水平或蛋白水平。

14、进一步，所述生物标志物表达水平为蛋白水平。

15、进一步，所述蛋白水平的检测方法包括蛋白质质谱检测、酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法、放射免疫分析、放射免疫扩散法、补体固定分析法、荧光激活细胞分选或蛋白质微阵列方法。

16、进一步，所述试剂包括特异性检测所述生物标志物蛋白表达水平的结合剂。

17、进一步，所述结合剂包括特异性结合所述生物标志物的抗体、抗体功能片段、偶联抗体。

18、获取样本中生物标志物水平的检测剂或组件，可以理解地包括直接获取样本中生物标志物水平的检测试剂，或者间接获取样本中生物标志物水平的组件(如计算机程序直接获取已经被检测好的样本中生物标志物水平的指标)。

19、可以理解本领域的核酸检测方式有多种，包括但不限于通过测序技术、核酸扩增技术、核酸杂交技术、电泳技术、生物质谱技术或色谱技术，这些技术都能够用于本技术。在本技术的一些实施例中，包括但不限于以下任一种具体方法：基因测序法、聚合酶链式反应法、等温扩增反应法、基因芯片法、探针杂交法、凝胶电泳法、rna印迹法、核酸质谱法或液相色谱法。可以理解核酸包括dna或rna层面。

20、可以理解本领域的蛋白检测方式有多种，包括但不限于测序技术、免疫技术、电泳技术、生物质谱技术或色谱技术，这些技术都能够用于本技术。在本技术的一些实施例中，包括但不限于以下任一种具体方法：氨基酸测序法、酶联免疫法、化学发光法、免疫层析法、放射免疫法、免疫组化法、免疫印迹法、流式细胞术、凝胶电泳法、蛋白质谱法或液相色谱法。

21、举例而言，在一些实施方式中，在蛋白水平上定量检测生物标志物的方法中包括了特异性抗体。其中，特异性抗体是指能够特异性识别生物标志物编码蛋白的抗体，具体包括但不限于单克隆抗体(例如全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如具有预期的生物学活性的双特异性抗体)、纳米抗体或者包括某些抗体片段中的至少一种。可以理解的是，抗体可以是人、人源化和/或亲和力成熟的抗体。根据本技术的实验数据可知，asialoglycoprotein receptor 2可作为狼疮肾炎诊断的独立指征，即仅单独依据asialoglycoprotein receptor 2生物标志物即可实现狼疮肾炎的有效诊断。

22、可以理解的是，为了进一步增强对狼疮肾炎的诊断效果，试剂所检测的生物标志物还可以是其它本领域技术人员所熟知的具有诊断作用的核酸片段、蛋白质、代谢物等可以作为标志物使用的生物材料，通过这种方式实现多种生物标志物的组合使用，相互之间进行配合达成更好对狼疮肾炎患者的诊断效果，从而达成更有效的诊断评估。因此，asialoglycoprotein receptor 2还可以与其他现有已知的诊断标记物进行联合检测，从而提升诊断效能。

23、进一步，所述待测样本包括括血液样本、血清样本、组织样本、细胞样本、尿液样本或外泌体样本。

24、进一步，所述待测样本为血清样本。

25、本技术中使用的术语“样品”、“样本”、“待测样品”、“待测样本”等包括从患者、个体或受试者获得的并可用于诊断或监测测定的各种样品类型。患者样品可以从健康受试者、患病患者或具有ln相关症状的患者获得。此外，从患者获得的样品可以被分成部分，并且可以将仅一部分用于诊断。此外，样品或其一部分可以在保持样品以供随后分析的条件下储存。该定义具体包括血液和生物来源的其他液体样品(包括但不限于组织、细胞(如pmbc细胞、t细胞等)、体液、血清、血浆、全血、尿液、精液、唾液、胸水、腹水、脑脊液、粪便和滑液等)。在一个具体实施方案中，样品包括血液样品。在另一个实施方案中，使用血清样品。该定义还包括在样品取得之后以任何方式被操作的样品，例如通过离心、过滤、沉淀、透析、色谱法、用试剂处理、洗涤或富集某些细胞群体。这些术语还包括临床样品，并且还包括培养物中的细胞、细胞上清液、组织样品、器官等。样品还可以包括新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块，例如从临床或病理活组织检查物制备的块，制备用于通过免疫组织化学的病理分析或研究。样品可以在收集后立即进行测试、在rt、4摄氏度、20摄氏度或80摄氏度储存并且在储存24小时、1周、1个月、1年、10年或多达30年后进行测试。

26、本发明第二方面提供一种产品。

27、进一步，所述产品包括检测生物标志物表达水平的试剂，所述生物标志物为asialoglycoprotein receptor 2。

28、进一步，所述生物标志物表达水平包括核酸水平或蛋白水平。

29、进一步，所述生物标志物表达水平为蛋白水平。

30、进一步，所述产品包括诊断待测样本是否为狼疮肾炎的产品。

31、进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、芯片。

32、进一步，所述产品还包括说明书。

33、进一步，所述说明书记载了当生物标志物asialoglycoprotein receptor 2表达显著上调时，受试者患有狼疮肾炎或存在患狼疮肾炎的风险。

34、本技术的试剂盒可以包括一组试剂，用于通过至少一次测定生成数据集。该组试剂能够检测定量本技术的生物标志物水平。该组试剂也可进一步检测其他一种或多种生物标志物水平。在一些方面，检测试剂是用于核酸或蛋白的水平检测。

35、在一些实施方案中，试剂盒还可以包括载体、包装或容器，该包装或容器被区室化为接收一个或多个容器，比如小瓶、管等，每个容器包含有待在该方法中使用的独立要素之一。本技术的试剂盒可以包括上述的容器以及一个或多个包含出于商业终端用户立场需要的物质的其他容器，该物质包括缓冲液、稀释剂、过滤器和带有使用说明的包装说明书。

36、在一些实施方案中，试剂盒中还包括样品的处理试剂，该样品的处理试剂可以包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品提取试剂中的至少一种。

37、在一些实施方案中，试剂盒中还包括标准品、校准品、对照品、缓冲液中的至少一种。其中，对照品是检验实验有效性的控制品，并作为判断结果的对照。缓冲液可以是本领域所公知的任何能够在检测过程中提供适当的缓冲条件的溶液。

38、在一些实施方案中，试剂盒可以包括一组试剂的使用说明书。例如，试剂盒可以包括用于执行至少一种测定法的说明书，例如免疫测定法、蛋白结合测定法、基于抗体的测定法、基于抗原结合蛋白的测定法、基于蛋白质的阵列、酶联免疫吸附测定(elisa)、流式细胞术、蛋白质阵列、印迹、蛋白质印迹、散射比浊法、比浊法、色谱法、质谱法、酶活性和免疫测定法，免疫测定法选自ria、免疫荧光、免疫化学发光、免疫电化学发光、免疫电泳、竞争性免疫测定法和免疫沉淀。

39、除了上述组件之外，试剂盒将进一步包括用于实施主题方法的说明书。这些说明书可以多种形式存在于主题试剂盒中，其中的一种或多种形式可存在于试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是其为在适合的介质或基材上的印刷信息，例如，在其上印刷信息的一张或多张纸，纸在试剂盒的包装中或呈包装插页形式等。

40、本发明第三方面提供一种筛选治疗狼疮肾炎候选药物的方法。

41、进一步，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有asialoglycoproteinreceptor 2的体外培养体系；检测所述体外培养体系中asialoglycoprotein receptor 2的表达水平；其中，当所述待筛选物质抑制asialoglycoprotein receptor 2的表达水平时，该待筛选物质是治疗狼疮肾炎的候选药物。

42、进一步，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

43、进一步，所述待测物质包括(但不限于)：干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物。

44、本发明第四方面提供生物标志物asialoglycoprotein receptor 2在筛选治疗狼疮肾炎候选药物中的应用。

45、本发明第五方面提供一种诊断狼疮肾炎的系统。

46、进一步，所述系统包括：

47、获取单元：用于获取待测样本中生物标志物的表达水平，所述生物标志物为asialoglycoprotein receptor 2；

48、分析单元：将待测样本中的生物标志物的表达水平与对照样本中生物标志物的表达水平进行比较，如果存在显著性差异，则判断待测样本来源的受试者患有狼疮肾炎或存在患狼疮肾炎的风险。

49、进一步，所述系统还包括输出单元，用于输出分析单元的结果。

50、进一步，所述对照样本为正常人群样本。

51、本技术中对照样本可以根据实际需求选定，比如在疾病诊断中，对照样本为正常人群样本，而在用于系统性红斑狼疮分型时，则可以是无肾脏受累的系统性红斑狼疮的对照样本。

52、在一些实施方式中，可以给出一个生物标志物水平的设定值。举例来说，该设定值可以根据正常人和/或非狼疮肾炎患者的正常样本的asialoglycoprotein receptor 2的表达水平而确定，例如，选择合适样本数量的正常样本的asialoglycoprotein receptor 2的表达水平的平均值，或基于该平均值设定一个合理的倍数，如0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍等，当受试者的asialoglycoprotein receptor 2的表达水平高于该设定值时，判断为狼疮肾炎。可以理解的是，基于平均值，或平均值的倍数所确定的设定值的需要具有良好的分类意义，可以通过基于该设定值的分类对已知样本采用常用的统计学检验方法进行检验，当结果具有统计学意义时，表明该设定值可以作为判断标准使用。

53、在一些实施方案中，计算机系统与装置通信以接收可溶性介质的定量表达值，计算机系统通过应用预测模型分析定量表达值并确定受试者中的ln疾病活动事件的可能性。

54、在本技术的一些实施例中，可利用计算机上进行本技术的方法或用途，包括通过计算机检测或分析本技术的生物标志物水平以预测ln疾病。

55、举例来说，用于生成评分的预测模型的构建和执行可以在硬件或软件或两者的组合中实现。在一个实施方案中，提供了一种可读存储介质，例如介质包括用机器可读数据编码的数据存储材料，当使用通过该数据的指令编程的机器时，数据存储材料能够显示本技术的预测模型的任何数据集以及执行和结果。这样的数据可以用于多种目的，比如ln患者监测、诊断、治疗考虑等。上述方法的实施方案可以在可编程计算机上执行的计算机程序中实现，计算机包括处理器、数据存储系统、图形适配器、网络适配器、至少一个输入设备和至少一个输出设备等。显示器与图形适配器耦合。将程序代码应用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。以已知方式将输出信息应用于一个或多个输出设备。计算机可以是个人计算机、微型计算机或传统设计的工作站。

56、每个程序可以在高级程序或面向对象的编程语言中实施，从而与计算机系统通信。然而，如果期望的话，程序可以在汇编或机器语言中实施。在任何情况下，语言可以是编译语言或解释语言。每个这样的计算机程序优选存储在通用或专用可编程计算机可读的存储介质或设备(例如rom或磁盘)上，用于当计算机读取存储介质或设备时配置和操作计算机以执行本技术的程序。

57、系统还可以视为以配置有计算机程序的计算机可读存储介质的形式实施，其中如此配置的存储介质使计算机以特定和预定义的方式运行以执行本技术的功能。

58、在一些实施方案中，可以在各种介质中提供特征模式及其数据库以促进它们的使用。术语“介质”是指含有本技术的特征模式信息的制造品。本技术的数据库可以记录在计算机可读介质上，例如计算机可以直接读取和访问的任何介质。这样的介质包括但不限于：磁存储介质，比如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，比如cdrom；ram和rom等电子存储介质；以及这些类别的混合体，比如磁/光存储介质。本领域技术人员可以容易地理解如何将任何目前已知的计算机可读介质用于产生包含当前数据库信息的记录的制造品。术语“记录”是指使用本领域已知的任何此类方法在计算机可读介质上存储信息的过程。基于用于访问存储信息的方式，可以选择任何方便的数据存储结构。可以使用多种数据处理器程序和格式进行存储，例如文字处理文本文件、数据库格式等。

59、本发明第六方面提供检测样本中生物标志物表达水平的试剂在制备诊断狼疮肾炎的系统中的应用。

60、进一步，所述生物标志物为asialoglycoprotein receptor 2。

61、本发明的优点和有益效果：

62、本技术为狼疮肾炎提供了一种新的生物标志物，通过分析中国人群中asialoglycoprotein receptor 2蛋白的表达水平，发现其能够有效的区分狼疮肾炎患者和正常人群，同时能够有效的区分狼疮肾炎患者和无肾脏受累的系统性红斑狼疮患者，为狼疮肾炎的诊断、治疗提供了一种新的方案和途径，弥补了现有狼疮肾炎临床无创检测方法缺失的不足，具有显著的临床价值。