用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法与流程

本发明涉及蛋白质组学及生物检测，具体地说，涉及用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法。

背景技术：

1、细胞核内蛋白复合体是调控基因转录、染色质重塑等生命活动的基础。解析这些蛋白复合体的组成及相互作用网络，对于揭示疾病发生机制及寻找治疗靶点具有重要意义。特别是在肿瘤机制研究中，如前列腺癌中的雄激素受体（ar）及其剪接变体调控网络，关键调控蛋白之间往往以高度动态的弱相互作用存在，如何准确捕获并鉴定这些核内复合体一直是蛋白质组学领域的技术难点。

2、目前，研究染色质结合蛋白复合体相互作用的主流技术是染色质免疫沉淀结合质谱分析（chip-ms）或快速免疫共沉淀内源性蛋白质谱分析（rime）。其基本处理流程是：利用交联剂将蛋白与dna、蛋白与蛋白固定，通过超声破碎细胞核将染色质片段化，利用特异性抗体进行免疫富集，最后解交联并制备肽段进行质谱鉴定。

3、然而，现有技术在处理复杂的核内弱相互作用复合体时存在明显的局限性：

4、第一，交联方式单一导致弱结合蛋白极易丢失。现有方法普遍仅依赖甲醛进行单一交联。甲醛的分子间隔臂极短（约2å），只能固定物理距离紧密的直接结合蛋白。核内大量关键转录共调控因子（如foxa1、hoxb13等）与核心蛋白之间通常存在较大的物理距离，相互作用较弱。在后续的细胞裂解、超声破碎和多次洗涤过程中，这类弱结合复合体容易发生结构解离，导致在最终的质谱结果中无法检出。

5、第二，单纯依赖物理超声导致非特异性背景极高。现有处理流程主要依靠超声波剪切染色质体系。受限于超声的物理切断特性，基因组dna难以被完全片段化至极短片段。体系中残留的长链核酸会引发核酸桥接效应，将大量原本无直接相互作用的核酸结合蛋白共沉淀下来。这会导致免疫富集产物中混入大量非特异性杂蛋白，产生极高的假阳性噪音，严重掩盖了低丰度真实互作蛋白的质谱信号。

6、因此，本领域亟需一种新的样品前处理方法，既能有效锁定并维持核内弱相互作用复合体的结构完整性，又能消除由于核酸未完全断裂引发的非特异性杂蛋白干扰，以提高下游质谱检测的灵敏度和特异性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，以解决上述背景技术中提出的现有技术中传统前处理方法对核内弱相互作用蛋白捕获效率低、非特异性背景噪音高的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，包括以下步骤：

3、s1、第一阶段交联：向处于原始培养状态或预处理状态的细胞体系中加入双功能交联剂进行初步交联，双功能交联剂的分子间隔臂长度大于8å，以锁定核内空间距离较远的蛋白间弱相互作用；

4、s2、第二阶段交联：在s1交联体系中直接加入甲醛试剂进行二次交联，利用甲醛的短间隔臂锁定邻近的蛋白-蛋白及蛋白-核酸相互作用，构建双层级的交联网络；

5、s3、反应淬灭与核提取：加入含氨基的淬灭剂终止交联反应，经过细胞裂解处理后，离心提取细胞核；

6、s4、超声片段化：对提取的细胞核重悬后进行超声破碎处理，将染色质初步打断为长片段；

7、s5、核酸酶彻底降解：向超声后的体系中加入全能核酸酶，将体系中的dna和rna链完全降解为寡核苷酸片段，释放交联状态的蛋白复合体。

8、进一步地，所述s1中，双功能交联剂为辛二酸二琥珀酰亚胺酯（dsg）或二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯（dsp）；双功能交联剂的终浓度为0.5-4mm，交联反应时间为10-40min，反应温度为室温。

9、进一步地，所述s2中，甲醛试剂的终浓度为1%v/v，交联反应时间为10-15min。

10、进一步地，所述s4中，超声破碎处理采用水浴超声，超声参数设定为：开启15s，关闭15s，循环进行，至裂解液变澄清，使染色质片段化至平均长度为200-500bp。

11、进一步地，所述s5中，全能核酸酶为benzonase核酸酶，其加入量控制为每10^7个细胞对应加入50-100u，降解反应条件为37℃孵育30-60min。

12、进一步地，向体系中加入benzonase核酸酶时，同步加入终浓度为1-2mm的镁离子作为酶促反应辅因子。

13、进一步地，所述s5之后还包括免疫共沉淀步骤：将核酸酶降解后的裂解液离心取上清，加入目标蛋白特异性抗体进行4℃孵育，随后加入包被有proteina/g的磁珠捕获抗体-蛋白复合体；使用洗脱缓冲液清洗磁珠，去除游离杂蛋白。

14、进一步地，所述洗脱缓冲液清洗磁珠后，还包括解交联与质谱前处理步骤：采用加热方式对磁珠上的复合物进行解交联处理，加热条件为65℃孵育至少4小时；随后通过胰蛋白酶对复合物进行酶切肽段化，制备质谱检测样本。

15、本发明还提供上述方法在制备前列腺癌细胞核蛋白靶向质谱检测样本中的应用。

16、本发明还提供一种用于实施上述方法的试剂盒，包括：双功能交联剂、甲醛试剂、含甘氨酸的淬灭液、核提取缓冲液组分、以及benzonase全能核酸酶。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果：

18、该用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法中，引入具有长空间间隔臂的双功能交联剂（如间隔臂长7.7å的dsg或12.0å的dsp）进行首轮交联，如同搭建长桥一般跨越空间位阻，率先共价锁定核内动态、远距离的弱结合转录协同复合体；随后引入甲醛进行次轮交联，利用其极短间隔臂（约2å）高密度固定核心蛋白与dna的紧密结合界面。在不破坏蛋白质天然构象的前提下，构建了稳固的空间锚定网络，克服了单一甲醛交联易导致复合体解离的缺陷，极大降低了弱结合蛋白在后续洗脱过程中的丢失率。

19、其次，针对传统方法单独依靠超声难以断裂染色质的问题，本方案在利用超声初步解开染色质压缩结构后，精准引入了特定剂量的全能核酸酶。该酶能够无差别地将单、双链dna及rna降解为极短的寡核苷酸片段（2-5个碱基）。物理与酶促的协同作用解除了长链核酸的物理牵连限制，切断了核酸桥接效应，排除了大量无关的核酸结合蛋白被共沉淀的可能性，从根本上降低了背景杂蛋白噪音，成倍提升了下游质谱检测对于低丰度弱相互作用蛋白的灵敏度和信噪比。

20、此外，本发明限定了长臂交联剂的浓度（0.5-4mm）与全能核酸酶的用量（50-100u/107个细胞）。该参数区间既保证了空间网络交联度及核酸的完全降解，又避免了交联过度导致的抗原表位封闭影响特异性抗体抓取，同时也防止了过量加入外源性酶蛋白对质谱动态检测范围的信号掩盖干扰，实现了样品前处理流程的最优平衡。

1.用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s1中，双功能交联剂为辛二酸二琥珀酰亚胺酯或二硫代双琥珀酰亚胺基丙酸酯；双功能交联剂的终浓度为0.5-4mm，交联反应时间为10-40min，反应温度为室温。

3.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s2中，甲醛试剂的终浓度为1%v/v，交联反应时间为10-15min。

4.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s3中，淬灭剂为甘氨酸溶液；细胞裂解处理和离心提取细胞核具体为：

5.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s4中，超声破碎处理在核提取与超声缓冲液lb3中进行；核提取与超声缓冲液lb3的组分为：10mm tris-hcl (ph8.0)、100mm nacl、0.1%去氧胆酸钠、0.5%n-十二烷基肌氨酸钠和2mm mgcl2；

6.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s5中，全能核酸酶为benzonase核酸酶，其加入量控制为每107个细胞对应加入50-100u，降解反应条件为37℃孵育30-60min。

7.根据权利要求1所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述s5之后还包括免疫共沉淀步骤：

8.根据权利要求7所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液清洗磁珠后，还包括解交联与质谱前处理步骤：

9.根据权利要求1-8任一项所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法在制备前列腺癌细胞核蛋白靶向质谱检测样本中的应用。

10.一种用于权利要求1-8任一项所述的用于核内弱相互作用蛋白复合体捕获的样品前处理方法的试剂盒，其特征在于，包括：双功能交联剂、甲醛试剂、含甘氨酸的淬灭液、胞质去除缓冲液lb1、核膜透化缓冲液lb2、核提取与超声缓冲液lb3、以及benzonase全能核酸酶；