一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法

本发明涉及食品生物活性检测，具体而言，涉及一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法。

背景技术：

1、甲鱼作为特种养殖水产，其内脏、骨、壳等加工副产物富含功能性蛋白与活性肽，经分离纯化后可获得具有显著关节炎调节功效的活性肽，是我国重点开发的潜在新食品原料与功能性食品基料。

2、目前，生物活性肽的消化吸收检测多采用静态离线检测法，存在消化过程非连续、吸收监测滞后、数据重复性差、无法模拟体内真实动态消化吸收环境等缺陷；常规检测仅能测定肽的消化吸收含量，无法同步表征消化后抗炎能力；消化、吸收、检测分步操作，多次取样转移易造成肽样品损耗、氧化污染；传统手动操作人为误差大，批次试验参数不一致；且检测过程中需多步独立开展，试验周期长，难以精准表征甲鱼源关节炎调节活性肽在人体胃肠道内的真实消化行为与吸收效率，直接制约了该活性肽的吸收机制研究、产业化工艺优化及产品质量标准制订。

3、流路式检测技术依托微流控与在线检测联用，可实现生物样品的动态连续处理与实时监测，完全契合活性肽体内消化吸收的动态特征。现有技术中尚无针对甲鱼源关节炎调节活性肽的专用流路式消化吸收检测方法，技术空白显著。

4、因此，研发一种高效、精准、实时的流路式消化吸收检测方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出了一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，旨在解决当前技术中消化吸收检测存在消化过程非连续、吸收监测滞后、数据重复性差、无法模拟体内真实动态消化吸收环境的问题。

2、本发明提出了一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，包含以下步骤：

3、（1）样品制备：以甲鱼及其加工副产物为原料，经提取、纯化得到粗肽液，鉴定获得甲鱼源关节炎调节活性肽纯品，配制待测样品液；

4、（2）流路式分段模拟消化：将待测样品液依次通过模拟胃液消化段、模拟肠液消化段，进行动态连续消化，得到消化后的肽液；

5、（3）在线跨膜吸收检测：消化后的肽液流入跨膜吸收检测腔，采用仿生吸收膜进行实时跨膜吸收，同步通过在线检测模块对吸收液与未吸收液进行定性定量检测；

6、（4）消化吸收动力学解析：采集实时检测数据，拟合消化吸收动力学曲线，计算活性肽的消化率、吸收率及吸收速率常数；

7、（5）消化后活性评价：收集跨膜吸收后的活性肽样品，采用体外关节炎细胞炎症模型检测其关节炎调节活性保留率。

8、进一步的，步骤（1）中所述甲鱼及其加工副产物为甲鱼内脏、骨、壳中的一种或多种组合。

9、进一步的，步骤（1）中所述提取采用生物酶解法；所述纯化采用色谱分离与膜分离联用；所述鉴定采用质谱与核磁联用。

10、进一步的，步骤（2）中所述模拟胃液消化段温度36.5-37.5℃，ph为1.2-2.0，停留时间1-2h。

11、进一步的，步骤（2）中所述模拟肠液消化段温度36.5-37.5℃，ph为6.8-7.2，停留时间2-4h，流速控制在0.5-1.0ml/min。

12、进一步的，步骤（3）中所述仿生吸收膜为caco-2细胞单层仿生膜或仿生脂质体膜。

13、进一步的，步骤（3）中所述在线检测模块为高效液相色谱-串联质谱在线联用模块。

14、进一步的，步骤（4）中所述动力学解析采用软件拟合一级动力学模型，计算参数包括消化半衰期、吸收半衰期、最大吸收率。

15、进一步的，步骤（5）中所述体外关节炎细胞炎症模型为il-1β诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞模型，通过检测炎症因子tnf-α、il-6的表达水平评价活性保留率。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

17、本发明摒弃传统分批次静态消化试验模式，通过串联式流路的结构连续完成胃液、肠液分步消化，依靠恒定流速复刻胃肠道蠕动输送状态，消化环境与人体体内生理条件一致性高，检测数据真实性远优于离线静态检测方法。

18、本发明的消化产物无需取样转移、前处理等离线操作，消化液直接进入仿生跨膜腔体并连通在线hplc-ms/ms检测，规避样品转移损耗、外界环境干扰带来的检测偏差，提升活性肽消化率、吸收率测定精准度。

19、本发明在量化活性肽消化吸收动力学参数基础上，配套类风湿fls细胞模型开展体外抗炎活性检测，可直接建立吸收量-关节炎调节活性关联关系，解决现有技术只能测含量、无法同步评价功能保留率的短板，适配甲鱼源活性肽新产品开发与原料质控需求。

20、本发明整套流路系统参数可控、工艺固定，批次间试验条件统一，试验重复性显著提升；整套流程自动化连续运行，缩短多批次样品检测周期，利于后续活性肽工业化标准制定与大批量样品筛查。

21、本申请的流路式反应能精准模拟人体胃肠道动态消化环境，检测结果更贴近体内真实生理状态，通过消化-吸收-检测一体化连续作业，无离线操作误差，数据时效性与准确性显著提升，并同步完成消化吸收检测与功能活性验证，直接关联吸收效率与关节炎调节功效，支撑产业化应用。

1.一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述甲鱼及其加工副产物为甲鱼内脏、骨、壳中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（1）中所述提取采用生物酶解法；所述纯化采用色谱分离与膜分离联用；所述鉴定采用质谱与核磁联用。

4.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述模拟胃液消化段温度36.5-37.5℃，ph为1.2-2.0，停留时间1-2h。

5.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述模拟肠液消化段温度36.5-37.5℃，ph为6.8-7.2，停留时间2-4h，流速控制在0.5-1.0ml/min。

6.权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述仿生吸收膜为caco-2细胞单层仿生膜或仿生脂质体膜。

7.权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（3）中所述在线检测模块为高效液相色谱-串联质谱在线联用模块。

8.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（4）中所述动力学解析采用软件拟合一级动力学模型，计算参数包括消化半衰期、吸收半衰期、最大吸收率。

9.根据权利要求1所述的一种甲鱼源关节炎调节活性肽的流路式消化吸收检测方法，其特征在于，步骤（5）中所述体外关节炎细胞炎症模型为il-1β诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞模型，通过检测炎症因子tnf-α、il-6的表达水平评价活性保留率。