一种检测红茶中手性农药呋虫胺残留量的高效液相色谱方法与流程

本发明属于农药检测，具体涉及一种检测红茶中手性农药呋虫胺残留量的高效液相色谱方法。

背景技术：

1、随着人们生活水平的提升，对茶叶的品质与安全性要求日益提高。红茶作为全球消费量较大的茶类之一，其质量安全问题备受关注。呋虫胺（dinotefuran，化学名为(rs)-1-甲基-2-硝基-3-(四氢-3-呋喃甲基)胍）是一种新型烟碱类杀虫剂，具备高效、低毒、内吸性好等特性，被广泛应用于水稻、蔬菜、果树、茶叶等农作物害虫防治。然而，若在茶叶种植过程中不合理使用呋虫胺，可能导致其在茶叶中残留，对人体健康构成潜在威胁。

2、目前，呋虫胺残留的检测方法主要包括气相色谱法（gc）、气相色谱-质谱联用法（gc-ms）、液相色谱法（hplc）及液相色谱-质谱联用法（lc-ms/ms）等。气相色谱法对挥发性较强的农药检测效果较好，但呋虫胺分子结构中含有胍基和四氢呋喃环，极性较强、挥发性较弱，热稳定性较差，直接采用气相色谱法检测需进行衍生化处理，操作相对繁琐。气相色谱-质谱联用法虽可结合保留时间与特征离子进行定性，但同样面临衍生化需求的问题。

3、液相色谱-质谱联用法是当前呋虫胺残留检测的主流方法。李立等（李立, 付建,初玉圣, 等.食品中呋虫胺残留量的hplc-ms/ms检测方法研究）建立了食品中呋虫胺残留量的hplc-ms/ms检测方法，样品经乙腈提取、envi-carb/lc-nh2固相萃取柱净化后测定，检出限为10 μg/kg，回收率为67%~90%。李春勇等（李春勇, 吕莹, 金静, 等. 呋虫胺和唑虫酰胺在茶叶加工过程中的残留特征及风险评价）采用quechers前处理结合uplc-ms/ms法，研究了呋虫胺在茶鲜叶、茶干叶和茶汤中的残留特征，方法定量限为0.05 mg/kg。上述质谱联用法虽具有灵敏度高、定性准确的优势，但仪器设备价格昂贵，对操作人员要求较高，且日常维护成本高，不利于在基层检测机构推广应用。

4、相对而言，高效液相色谱法（hplc）配紫外检测器（uv）或二极管阵列检测器（dad）的操作相对简便，仪器购置与维护成本较低，对操作人员的技术要求也相对较低，因此是基层人员进行呋虫胺残留量检测的首选方法。现有技术中，已有采用c18反相色谱柱结合紫外检测器测定呋虫胺含量的方法报道，如以甲醇-水为流动相、270 nm为检测波长，可实现呋虫胺的分离检测。中国专利cn105842357a公开了一种同时检测粮谷中呋虫胺及其代谢物uf、dn残留量的方法，采用psa+c18分散固相萃取净化，以甲酸-甲酸铵水溶液-甲醇为流动相进行lc-ms/ms测定。然而，上述方法主要针对粮谷、呋虫胺制剂等相对简单的基质体系，尚未针对红茶基质进行系统优化。

5、目前尚无专用于检测红茶中呋虫胺残留量的高效液相色谱方法。红茶作为发酵茶，在加工过程中茶多酚经多酚氧化酶催化氧化，生成大量茶黄素、茶红素、茶褐素等特征色素成分，同时含有较高含量的茶多酚、咖啡碱、氨基酸及挥发性香气成分，这些成分的存在使得红茶基质远比绿茶、粮谷等基质复杂。这些物质会干扰呋虫胺的提取与检测，导致检测结果不准确，现有文献报道的液相色谱检测条件多针对水稻、蔬菜等基质进行优化，未对红茶基质进行针对性研究，在检测红茶样品时分离效果不理想，检测灵敏度较低。

6、此外，以往的呋虫胺高效液相色谱检测方案多采用c18柱，在检测红茶样品时易受上述复杂基质成分的干扰，难以实现色谱峰的有效分离与准确定量。更为关键的是，呋虫胺分子结构中四氢呋喃环的3位碳原子为手性中心，存在r-呋虫胺和s-呋虫胺两种对映异构体。研究表明，呋虫胺不同手性异构体的生物活性存在显著差异，因此，仅检测呋虫胺总残留量而不能区分手性异构体，无法准确评估其实际健康风险。目前，分离呋虫胺对映异构体的方法主要依赖于手性固定相。已有研究采用chiralpak ig手性柱结合uplc-ms/ms，实现了普洱茶中呋虫胺等3种手性杀虫剂对映体的分离检测（quechers-超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中3种杀虫剂手性农药）；亦有研究采用chiralpak ad-3手性柱结合超高效合相色谱（upc2），实现了大米中呋虫胺对映体的快速分离（cn121595759a）。然而，上述手性分离方法均采用质谱检测器，成本高昂，且尚未有针对红茶基质中呋虫胺手性异构体的hplc-uv检测方法报道。

7、综上所述，现有的呋虫胺残留检测方法存在以下不足：（1）gc及gc-ms法需衍生化处理，操作繁琐；（2）lc-ms/ms法虽灵敏度高，但设备昂贵、维护成本高，不利于基层推广；（3）常规hplc法多采用c18柱，未针对红茶复杂基质进行优化，茶黄素、茶红素等成分严重干扰检测，分离效果和灵敏度不理想；（4）c18柱无法分离呋虫胺的手性异构体，而不同手性异构体的生物活性和毒性存在差异，仅检测总残留量无法准确评估健康风险。因此，开发一种快速、准确、灵敏度高、适用于红茶基质且能实现手性分离的呋虫胺残留量检测方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、鉴于现有技术的不足，本发明提供一种检测红茶中手性农药呋虫胺残留量的高效液相色谱方法。

2、本发明的技术方案主要包括以下内容：

3、一种检测红茶中手性农药呋虫胺残留量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

4、（1）样品前处理：取红茶样品，粉碎，过筛，加入无水预处理剂，涡旋振荡，离心去掉预处理剂，留滤渣；所述无水预处理剂包括环己烷、正己烷、石油醚中的一种或几种；

5、（2）提取待测物：滤渣中加入水，涡旋振荡，静置浸润，随后加入提取溶剂，涡旋振荡，加入盐析试剂，涡旋振荡，离心，移取上层上清液，置于含有分散固相萃取吸附剂的净化管中，涡旋振荡，离心，取净化后的上清液，过滤后，得到待检测液；

6、（3）高效液相色谱检测：将待检测液注入高效液相色谱仪，在设定的色谱条件下进行检测，根据标准曲线计算样品中农药残留的含量；

7、所述色谱条件为：固定相为superchiral r-ag , 3 μm, 4.6mm×150mm或superchiral r-ag , 5 μm, 4.6mm×150mm色谱柱，流动相为乙腈水。

8、进一步的，所述无水预处理剂为体积比（1~2）:（8~9）的环己烷和石油醚。

9、进一步的，步骤（2）中，静置浸润至少10min。

10、进一步的，步骤（2）中，所述提取溶剂为乙腈。

11、进一步的，所述盐析试剂为质量比4:1的硫酸镁和氯化钠。

12、进一步的，所述分散固相萃取吸附剂为质量比300:150:150的硫酸镁、n-丙基乙二胺和c18。

13、进一步的，所述乙腈水的体积浓度为30%。

14、进一步的，所述固定相为superchiral r-ag , 3 μm, 4.6mm×150mm色谱柱。

15、进一步的，所述色谱条件还包括：柱温30~35℃，检测波长254~280nm。

16、进一步的，待测红茶样品、无水预处理剂、步骤（2）所述水、提取溶剂、盐析试剂、分散固相萃取吸附剂的质量体积比为2g：10 ml：10 ml：10 ml：5g：300mg。

17、进一步的，因呋虫胺对光照敏感，整个检测过程中应当保持避光操作。特别是在预处理和待测物提取阶段，应尽量在避光环境中操作。

18、本发明的有益效果：

19、本发明通过优化样品前处理和净化方式，有效减少了红茶中复杂成分对呋虫胺检测的干扰，使得检测结果更加准确可靠。

20、以往的呋虫胺高效液相色谱检测方案中，主要以c18柱为固定相，但c18柱无法区分r/s-呋虫胺手性异构体，且以往的色谱条件均需要采用梯度洗脱程序。本发明所采用的superchiral r-ag色谱柱对红茶中的干扰成分与呋虫胺具备优异的分离选择性，可在等度洗脱条件下实现呋虫胺的有效分离，无需进行梯度洗脱，简化了检测程序。

21、与现有技术相比，本发明针对红茶复杂基质的特点设计了专门的前处理流程：先采用无水预处理剂脱除红茶样品中的部分色素、蜡质等干扰成分，再通过水浸润结合乙腈提取、分散固相萃取净化等方式进一步去除杂质，大幅降低了红茶自身基质成分对检测结果的影响，显著提升了检测的灵敏度和准确性，可检测出极低浓度的呋虫胺残留。

22、本发明操作简便，对仪器配置要求较低，检测成本远低于质谱联用法，适合基层检测机构开展红茶中呋虫胺残留量的大批量日常检测，可为红茶质量安全监管提供稳定可靠的技术支持，具备良好的应用前景。

23、本方法单个样品的检测时间较短（10min以内），能够满足大量红茶样品快速检测的要求，提高检测效率。