一种限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测体系及方法

本发明涉及生物检测，具体是一种限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测体系及方法。

背景技术：

1、蛋白质生物标志物检测广泛应用于感染、炎症及疾病进程评估。现有蛋白质生物标志物检测方法多采用抗体或酶完成靶标识别与信号放大，但相关蛋白组分对温度、运输及储存条件较为敏感，检测过程通常涉及多步孵育、洗涤和信号标记，增加了检测成本及操作复杂性，不利于分散式检测场景的应用。核酸适配体具有易于化学合成、序列可设计、修饰方式灵活、批次间一致性较好及储存稳定性较高等特点，可通过序列设计和结构调控构建具有识别、信号转导及催化功能的核酸探针，为减少检测体系对抗体和酶的依赖提供了技术基础。

2、核酸链置换和催化发夹组装能够在无酶条件下实现核酸信号转导与循环放大，然而蛋白质靶标通常不能直接作为核酸催化组装的启动链，仍需将蛋白质识别事件转换为能够驱动下游反应的核酸信号。在自由扩散条件下，核酸探针之间的局部有效浓度和碰撞概率较低，容易造成反应动力学受限；提高探针浓度又可能增加非特异性链置换、背景泄漏及信噪比下降的问题。

3、现有基于核酸适配体和催化核酸组装的蛋白质检测方法中，信号转换方式与下游放大反应之间的耦合效率较低，且靶标识别、信号转换与循环放大通常由相互独立的反应单元完成，难以兼顾检测灵敏度、反应速度和体系稳定性，如何利用空间限域提高识别探针的局部有效浓度，并将蛋白质靶标识别与核酸催化组装有效耦合，是现有技术亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测体系及方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测体系，包括靶标识别元件、核酸信号放大元件与电化学检测元件；

4、所述靶标识别元件包含纳米转导器与游离的第二识别探针；

5、所述纳米转导器包括第一纳米颗粒载体，所述第一纳米颗粒载体的表面固定有第一识别探针，所述第一识别探针上预杂交有催化链；

6、所述第一识别探针与所述第二识别探针均为能够特异性结合待测蛋白质靶标不同结合区域的核酸适配体；

7、所述核酸信号放大元件包含信号发夹探针与纳米放大器；

8、所述纳米放大器包括第二纳米颗粒载体，所述第二纳米颗粒载体的表面固定有固定发夹探针；所述信号发夹探针标记有电活性信号分子；

9、所述电化学检测元件为功能化水凝胶电极，包括基底电极与修饰于所述基底电极表面的复合水凝胶层，所述纳米放大器负载于所述复合水凝胶层的多孔网络结构中；

10、所述检测体系被配置为通过靶标介导的双识别探针空间共定位触发催化链释放，进而启动催化发夹组装反应，使携带电活性信号分子的信号发夹探针富集于所述功能化水凝胶电极界面并产生电化学响应。

11、作为本发明进一步的方案：所述第一纳米颗粒载体与所述第二纳米颗粒载体均为金纳米颗粒；

12、所述第一识别探针与所述固定发夹探针均通过巯基修饰形成的金硫键固定于对应金纳米颗粒的表面。

13、作为本发明进一步的方案：所述复合水凝胶层为由聚丙烯酰胺、植酸与聚多巴胺复合形成的水凝胶层，所述基底电极为丝网印刷碳电极；

14、所述纳米放大器通过溶胀-收缩循环负载于所述复合水凝胶层的多孔网络结构内部。

15、作为本发明进一步的方案：所述电活性信号分子为亚甲基蓝，所述信号发夹探针为亚甲基蓝末端标记的发夹结构核酸探针。

16、作为本发明进一步的方案：所述待测蛋白质靶标为降钙素原；

17、所述第一识别探针与所述第二识别探针分别特异性结合降钙素原的不同结合区域。

18、一种限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测方法，包括以下步骤：

19、（1）构建检测反应体系：将第二识别探针、标记有电活性信号分子的信号发夹探针与纳米转导器分散于缓冲液中，得到检测反应液；

20、将所述检测反应液与负载有纳米放大器的功能化水凝胶电极接触，使电极工作区域浸没于反应液中；

21、所述纳米转导器表面固定有第一识别探针且预杂交有催化链，所述纳米放大器表面固定有固定发夹探针；

22、（2）靶标介导的催化链释放：向检测反应体系中加入待测样品，孵育反应，使样品中的蛋白质靶标同时结合所述第一识别探针与第二识别探针，介导两种识别探针在纳米转导器表面发生空间共定位，通过趾端介导的链置换反应释放催化链；

23、（3）催化发夹组装与信号富集：释放的催化链与信号发夹探针结合并打开发夹结构，打开后的信号发夹探针与纳米放大器表面的固定发夹探针杂交形成双链复合物，同时释放催化链以循环触发多轮催化发夹组装反应，使携带电活性信号分子的信号发夹探针富集于功能化水凝胶电极界面；

24、（4）电化学定量检测：洗涤去除未结合的游离探针后，采集功能化水凝胶电极的电化学响应信号，根据响应信号强度确定待测样品中蛋白质靶标的浓度。

25、作为本发明进一步的方案：步骤（2）与步骤（3）的孵育反应在20～30℃的室温条件下进行，总反应时长为8～12分钟。

26、作为本发明进一步的方案：步骤（4）采用差分脉冲伏安法采集电化学响应信号，以待测样品与空白对照样品的峰电流差值作为定量依据，通过预先建立的峰电流差值与靶标浓度的标准曲线计算得到靶标浓度。

27、作为本发明进一步的方案：更换分别对应目标蛋白质不同结合区域的第一识别探针与第二识别探针，用于检测不同种类的蛋白质生物标志物。

28、一种上述所述的限域效应触发的协同纳米机器催化组装检测体系在离体血清样品中蛋白质生物标志物定量检测中的应用。

29、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

30、本发明通过纳米转导器与纳米放大器的协同作用，将蛋白质靶标介导的双识别探针识别依次转换为限域效应触发的催化链释放、催化发夹组装及电化学信号输出，在不依赖蛋白质抗体和酶的条件下，实现了蛋白质靶标识别、核酸信号转换及循环放大的顺序耦合；

31、在检测性能方面，优化条件下本发明对降钙素原的线性检测范围为10-3～103ng/ml，相关系数r2为0.985，检测限为2.35×10-4ng/ml；与采用自由扩散探针的非纳米机器体系相比，纳米转导器通过提高识别探针的局部有效浓度，能够显著提高催化链释放效率和检测灵敏度。检测反应可在室温条件下于10min内完成，检测流程简便快速；

32、在检测特异性与稳定性方面，本发明对降钙素原能够产生明显的电化学响应，而相同浓度的降钙素、c反应蛋白、白细胞介素-6和b型利钠肽所产生的信号均接近空白对照，对所测试的潜在干扰物未产生明显交叉响应。对同一含降钙素原样品在不同日期进行20次独立检测，各次检测结果具有良好一致性；预制检测体系储存4周后，在4℃条件下仍可保留85%以上的初始信号，在室温条件下仍可保留80%以上的初始信号，具有较好的检测重复性和储存稳定性；

33、在实际应用层面，以0.1ng/ml为参考阈值，本发明与中心实验室参考方法对临床血清样品的分类结果一致；高于参考阈值样品的重复检测相对标准偏差均低于8.5%，全部样品的相对标准偏差均低于10%，可用于离体血清样品中降钙素原的定量检测；

34、对不同时间点采集的离体血清样品进行检测，所得靶标浓度变化趋势与参考方法检测结果基本一致，能够提高连续样品检测的时间分辨率；此外，通过更换能够分别结合目标蛋白不同结合区域的第一识别探针和第二识别探针，本检测体系可扩展用于其他蛋白质生物标志物的检测，为分散式检测和高频样品分析提供技术基础。