一种非小细胞肺癌基因快检试纸条的制备及应用

本发明属于比色生物传感领域，具体涉及基于crispr系统的非小细胞肺癌快检试纸条的制备方法和应用。

背景技术：

1、食源性疾病常年高居全球公共卫生威胁榜首，非小细胞肺癌(nsclc)是最常见的癌症类型之一，是全球大多数癌症相关死亡的原因。非小细胞肺癌作为肺癌中最常见的类型，约占肺癌总数的80％-85％，其癌细胞生长分裂速度相对平缓、转移扩散较晚，但早期症状极具隐匿性，多数患者确诊时已发展至中晚期。这种肿瘤会逐步破坏肺部组织与呼吸功能，引发咳嗽、咯血、胸闷气短等局部症状，随病情进展还会通过淋巴或血液转移至脑、骨、肝脏等全身器官，导致剧烈疼痛、肢体障碍、器官衰竭等严重并发症，不仅大幅降低患者生活质量，更因中晚期预后较差而对生命构成直接威胁。egfr l858r突变是nsclc中常见的驱动突变，已成为个性化治疗的重要靶点，其检测对临床诊疗具有重要价值。

2、因此，开发一种快速、现场即时检测非小细胞肺癌的方法，对保护人类的健康至关重要。

3、目前常规的几种检测非小细胞肺癌(nsclc)的方法如平板培养法、实时定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附测定同样存在诸多局限性。平板培养法作为传统“金标准”，虽然可靠性高，但无法直接用于nsclc的分子标志物检测。若类比组织或液体活检中的细胞培养，其耗时长且依赖熟练技术人员，难以满足快速诊断需求。实时定量聚合酶链反应(qpcr)虽灵敏度与特异性较高，但依赖昂贵的热循环设备，样本需经复杂核酸提取与纯化预处理，操作不当易产生假阳性信号，限制其在基层或床旁快速检测中的应用。酶联免疫吸附测定(elisa)操作相对简单、稳定性好，但成本较高，需多次洗涤步骤，且灵敏度有限，难以检出nsclc早期患者外周血或穿刺样本中的低丰度蛋白或外泌体标志物。因此，这些方法在实现nsclc的快速、高灵敏、低成本检测方面均存在瓶颈。为突破上述瓶颈，近年来兴起的快检试纸条凭借低成本、高灵敏和短耗时等优势，正成为临床早期诊断与现场监管的有力候选方案。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的问题，本发明提供了一种用于非小细胞肺癌egfr l858r突变基因便携、可视化检测的比色法试纸条及其制备方法和应用，该快检试纸条检测非小细胞肺癌egfr l858r的灵敏度高，线性范围宽，方便快捷，抗干扰能力强，可用于现场检测。

2、为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

3、一种“crispr信号放大技术”，包括设计特异性识别egfr l858r基因的crrna序列和被crispr/cas12a系统特异性识别的hpdna序列以及与切割后掉落的dna1互补的rna1序列。

4、当体系中不存在egfr l858r基因时，crispr/cas12a系统不具备切割hpdna的功能，相应的不会产生dna1-rna1杂交链无法被s9.6抗体捕获到试纸条上，加入检测液体后试纸条t线无颜色变化。

5、当体系中存在存在egfr l858r基因时，该crispr/cas12a系统具备切割hpdna的功能，相应的会产生dna1-rna1杂交链被s9.6抗体捕获到试纸条上，加入检测液体后试纸条t线有明显颜色变化。

6、优选的，所述egfr l858r模板序列为：5’-gat ttt ggg cgg gcc aaa ctg-3’；

7、所述特异性识别egfr l858r的核酸适配体crrna序列为：5'-uaa uuu cua cuaagu gua gau cac uuu ggc ccg ccc aaa auc-3’；

8、所述被特异性切割的核酸适配体hpdna序列为：5'-tca gcg ctc ctt taa cataat gaa ttt tit taa ctt att taa agt aat tgt taa aggacc-3’；

9、所述切割后的核酸适配体dna1序列为：5'-act tat tta aag taa ttg tta aaggag c-3’；

10、所述特异性识别dna1的核酸适配体rna1序列为：5'-gcu ccu uua aca auu acuuua aau aag u-3’；

11、本发明第二目的在于提供基于所述crispr/cas12a系统的快检试纸条，包括s9.6抗体修饰在试纸条的t线上的时候，可特异性识别dna1-rna1杂交链并捕获杂交链于试纸条t线上。

12、本发明的第三目的在于提供所述的制备方法，包括如下步骤：

13、在10ml hepes缓冲溶液(50mm ph＝7)中，将crrna(100μm，1μl)与cas12a(1μl)依次加入缓冲溶液中。37℃孵育30min后，快速加入egfr l858r(100μm，1μl)以激活切割功能，37℃孵育30min后，快速加入hpdna(20μm，1μl)，并于37℃水浴锅反应2h，得到的dna1。随后加入rna1(20μm，1μl)，并于37℃水浴锅反应2h。

14、优选的，步骤中所述dna溶液使用之前在95℃下退火，时间为5min，方式为自然冷却至室温。

15、本发明第四目的在于提供所述的非小细胞肺癌egfr l858r快检试纸条的应用，所述应用为：检测非小细胞肺癌egfr l858r。检测原理如图1所示。

16、本发明提供的非小细胞肺癌egfr l858r快检试纸条有益效果在于：

17、crispr相关免疫系统cas可靶向切割特定核酸序列，cas蛋白与靶双链dna结合后会被激活，释放非特异性内切核糖核酸酶活性以降解单链dna，为核酸检测提供了新方法。同时，测流层析试纸条因其操作简便、便携、成本低的特点，在即时检测中发挥着关键作用，广泛应用于食品安全、环境监测和疾病诊断等领域。将两者结合运用在非小细胞肺癌的检测中，可以以肉眼观测的方式直观的得到检测结果。

18、本发明提供的非小细胞肺癌egfr l858r快检试纸条检测金非小细胞肺癌，灵敏度高，线性范围宽101-105pm，检测限低至1.06nm(s/n≥3)。

19、所构建的非小细胞肺癌egfr l858r快检试纸条可在5h内完成对非小细胞肺癌的快检试纸条的检测，方便快捷、可用于现场检测。

20、快检试纸条的构建使该体系无需复杂仪器，即可实现对非小细胞肺癌的高灵敏、高特异性定量检测，可应用推广。

1.一种“crispr信号放大技术”，其特征在于，包括设计特异性识别egfrl858r基因的crrna序列和被crispr/cas12a系统特异性识别的hpdna序列以及与切割后掉落的dna1互补的rna1序列，

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.基于权利要求1-2任一所述的快检试纸条，其特征在于，包括以下组成：

4.权利要求1-3所述试纸条在检测血样中非小细胞肺癌egfr l858r含量中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述食品包括人体血样。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，待检测样品中非小细胞肺癌egfr l858r的浓度为101-105pm。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述检测非小细胞肺癌egfr l858r的方法，包括以下步骤：