一种基于耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌的Cu-ZIF-8@Apt探针及其制备方法和应用

本发明属于纳米材料生物功能化及细菌检测，具体涉及一种基于耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌的cu-zif-8@apt探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa）是一类对β-内酰胺类抗生素及多种抗菌药物具有耐药性的常见条件致病菌，对食品安全和公共卫生安全构成重要威胁。因此，建立快速、灵敏且特异的mrsa检测方法，对食品、环境及离体样本中mrsa的快速识别与准确检测具有重要意义。

2、目前，mrsa及其他致病菌的常用检测方法主要包括显微镜观察、平板培养、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbent assay，elisa）等。显微镜观察方法操作直观，但检测结果易受操作者经验影响，且难以实现准确区分和定量分析；平板培养法检测结果较为可靠，但检测周期较长，通常难以满足快速筛查和现场检测需求；pcr方法具有较高的灵敏度和特异性，但其通常依赖专业仪器、标准化实验环境以及复杂的样品前处理过程；elisa方法操作相对简便，但抗体制备成本较高，且可能存在稳定性不足、批次差异以及保存条件要求较高等问题。因此，现有mrsa检测技术在检测时间、操作复杂程度、设备依赖性、检测成本和现场适用性等方面仍存在一定局限。

3、近年来，纳米酶因兼具纳米材料的良好稳定性和类天然酶催化活性，在生物检测领域受到广泛关注。部分金属有机骨架材料及其复合材料具有类过氧化物酶活性，能够在过氧化氢存在条件下催化无色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（tmb）氧化生成蓝色氧化产物，从而实现比色检测。与天然酶相比，纳米酶通常具有制备方法简单、稳定性较好、成本较低以及易于功能化修饰等优点。然而，单纯依赖纳米酶催化显色进行细菌检测时，往往缺乏对目标菌的特异性识别能力，容易受到非目标微生物或复杂样品基质的干扰，导致检测准确性和选择性不足。

4、适配体（apt，即aptamer）是一类能够通过特定空间构象与靶标分子高亲和力、特异性结合的寡核苷酸序列，具有易于化学合成、便于修饰、稳定性较好、批次差异小以及靶标识别能力强等特点。将适配体与纳米酶材料相结合，可构建兼具靶标识别能力和催化信号放大能力的生物传感体系。在该类体系中，适配体可吸附或修饰于纳米酶表面，对纳米酶的催化活性产生一定屏蔽或调控作用；当目标菌存在时，适配体能够优先与目标菌表面的特异性结构结合，并从纳米酶表面发生脱附或置换，使纳米酶表面的催化活性位点重新暴露，从而增强其对tmb-h2o2显色体系的催化氧化作用。通过观察或测定蓝色氧化产物的生成程度，可实现对目标菌的快速比色检测。

5、对于mrsa检测而言，选择合适的靶标是提高检测特异性和响应效率的关键。mecr1蛋白是与meca介导的甲氧西林耐药调控过程相关的β-内酰胺类抗生素感应/信号转导膜蛋白，其膜外暴露结构域便于适配体在完整菌体表面进行识别和结合。与直接针对胞内核酸序列或胞内蛋白进行检测相比，以mecr1蛋白膜外暴露区域作为识别靶点，有利于减少样品裂解、核酸扩增或复杂前处理步骤，提高检测体系的操作便利性和靶标响应效率。

6、因此，基于mecr1蛋白筛选mrsa特异性耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体，并将其与具有类过氧化物酶活性的纳米酶材料结合，构建适配体调控的比色检测平台，有望克服现有mrsa检测方法检测周期长、操作复杂、设备依赖性强、成本较高以及现场适用性不足等问题，为mrsa的快速检测、现场筛查及体外微生物风险评估提供新的技术手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体（apt）、包含该适配体的cu-zif-8@apt探针及其制备方法和应用。本发明通过系统优化cu-zif-8与apt的孵育时间、apt浓度以及检测体系中耐甲西林金黄色葡萄球菌菌液体积，获得具有最佳催化性能和检测灵敏度的功能化纳米探针，实现对耐甲西林金黄色葡萄球菌的高灵敏度、高特异性快速检测。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明提供了一种耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体，所述步骤二中的耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体的dna序列如seq id no.1所示：

4、5'-cacaggtgtggggaggtccccatggaggtggtacctgtg-3'。

5、所述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体为靶向耐甲西林金黄色葡萄球菌mecr1膜蛋白膜外暴露结构域的单链dna适配体，其长度为39nt，gc含量为64.10%。该适配体能够以mecr1膜外暴露结构域为识别靶点，在完整耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌表面实现特异性结合。

6、所述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体与mecr1蛋白的bli测得kd为3.81±0.34nm，elisa-based结合实验测得ec50为6.5±0.7nm，mrsa完整活菌结合实验测得表观kd为9.8±1.2nm，在50nm条件下的mfi为6840±390。相较于未经蚁群算法优化的对接候选序列、随机文库初筛序列、打乱序列及阴性对照序列，seq id no.1表现出更低的kd或ec50值及更强的荧光响应。

7、优选地，所述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体通过以下筛选方法获得：

8、步骤（1）、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌膜蛋白mecr1蛋白的三维结构：从ncbi、uniprot或pdb数据库中检索耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecr1蛋白的氨基酸序列；当数据库中存在可用晶体结构或预测结构时，直接下载对应结构文件；当缺少完整三维结构时，以同源蛋白为模板，采用同源建模方法构建mecr1蛋白的三维结构模型；对获得的mecr1蛋白三维结构进行预处理，包括去除非必要小分子、水分子及冗余离子，补加氢原子，计算并分配原子电荷，修复缺失残基或侧链，并对蛋白结构进行能量最小化处理，以获得构象稳定、可用于分子对接的mecr1蛋白受体模型；采用蛋白结构评价工具对优化后的mecr1蛋白模型进行合理性验证，分析其二级结构、空间构象稳定性、拉氏图分布以及表面电荷分布；根据mecr1蛋白的膜外暴露区域、功能结构域及表面可接近区域，确定其可作为耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体识别的候选结合区域，并将该区域作为后续分子对接的主要靶向区域；

9、构建短链寡dna随机文库：随机设计容量为1014的短链寡dna片段文库，其中短链寡dna片段的长度范围为30bp-80bp；所述随机文库由a、t、c、g四种碱基随机排列组成，并通过序列筛选程序剔除连续同一碱基过长、gc含量异常、明显自互补或容易形成非特异聚集结构的序列，得到初筛寡核苷酸序列库；对短链寡dna片段文库中的序列进行初步结构分析，预测各序列的二级结构、自由能及构象稳定性，保留具有稳定茎环结构、空间构象较稳定且具备潜在靶标结合能力的候选短链寡dna片段，用于后续分子对接筛选；

10、步骤（2）、将mecr1蛋白受体模型与短链寡dna片段文库进行分子对接测试：将mecr1蛋白结构信息导入分子模拟软件中，并将短链寡dna片段文库作为配体分子导入分子对接体系；以mecr1蛋白膜外暴露结构域及预测结合口袋为对接区域，设置对接网格盒，使其覆盖mecr1蛋白表面主要可接近区域；在模拟生理环境条件下，对短链寡dna片段与mecr1蛋白表面结构域进行柔性分子对接模拟；对接过程中，允许短链寡dna片段发生构象调整，以模拟其与mecr1蛋白结合过程中的空间适配行为；每条短链寡dna片段均分别与mecr1蛋白进行多次对接计算，获得对应的结合构象、结合位点、氢键作用、静电作用、疏水作用以及结合自由能；根据分子对接结果，对每条短链寡dna片段与mecr1蛋白之间的结合自由能δg进行统计分析，优先筛选结合自由能较低、结合位点位于mecr1蛋白表面暴露区域、结合构象稳定且空间匹配程度高的短链寡dna片段，作为候选适配体序列；

11、步骤（3）、将分子对接结果进行蚁群算法模型优化：将分子对接结果输入改进的蚁群算法模型中进行全局优化；所述蚁群算法模型以短链寡dna片段的碱基排列作为搜索路径，以短链寡dna片段与mecr1蛋白的结合自由能作为主要评价指标，以序列稳定性、gc含量、二级结构稳定性及靶向结合区域匹配程度作为辅助评价指标，对候选短链寡dna片段进行迭代优化；在蚁群算法模型中，每一只人工蚂蚁代表一种候选短链寡dna序列构建路径；模型初始化时，在a、t、c、g四种碱基之间随机生成多条候选路径，并为各路径赋予初始信息素浓度；每次迭代过程中，人工蚂蚁根据信息素浓度和启发函数选择下一位碱基，从而生成新的短链寡dna片段；所述启发函数根据候选短链寡dna片段与mecr1蛋白之间的结合自由能、结合位点稳定性、二级结构自由能和序列合理性综合确定；结合自由能越低、结构越稳定、靶向结合区域越明确的短链寡dna片段，其对应路径的信息素浓度越高，在后续迭代中被选择的概率越大；经多轮迭代优化后，统计概率较高且综合评分靠前的短链寡dna片段，并再次进行分子对接验证和二级结构预测，将结合自由能低、与mecr1蛋白表面结构域结合稳定、二级结构合理且不存在明显非特异性结构风险的序列确定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌候选耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体；

12、其中，某一时刻第i个候选碱基被选择的概率pi (t)按照信息素浓度和启发函数共同确定：；

13、其中，ti (t)表示t时刻第i条路径上的信息素浓度；ηi(t)表示第i条路径的启发函数值；α表示信息素因子权重；β表示启发函数因子权重；∑表示对所有可选碱基路径进行求和。

14、蚁群算法优化参数为：初始随机文库容量1×1014，候选序列长度39nt，人工蚂蚁数量60，最大迭代次数150，信息素因子α=1.0，启发函数因子β=2.0，信息素挥发系数ρ=0.35，收敛判断为连续20轮最优评分变化小于1%。

15、本发明提供了一种基于耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌的cu-zif-8@apt探针，包含cu-zif-8纳米酶和组装于所述cu-zif-8纳米酶表面的上述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体。

16、所述cu-zif-8纳米酶具有类过氧化物酶催化活性，能够在h2o2存在下催化tmb氧化生成蓝色氧化产物。所述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体组装于cu-zif-8表面后，对cu-zif-8的类过氧化物酶催化活性位点产生遮蔽作用；当耐甲西林金黄色葡萄球菌存在时，所述耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体与目标菌发生特异性结合并从cu-zif-8表面脱附，使cu-zif-8的类过氧化物酶催化活性增强，促进tmb氧化，增加氧化态tmb的生成量，使反应体系在654nm处的吸光度升高。

17、所述cu-zif-8@apt探针的zeta电位为负值，所述cu-zif-8的zeta电位为正值。zif-8、cu-zif-8及cu-zif-8@apt的zeta电位分别为+19.8mv、+16.5mv和-18.8mv。

18、本发明提供了一种基于耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌的cu-zif-8@apt探针的制备方法，包括以下步骤：

19、步骤一、将六水合硝酸锌溶于去离子水中，得到硝酸锌溶液；将三水合硝酸铜溶于去离子水中，得到硝酸铜溶液；将2-甲基咪唑溶于去离子水中，得到2-甲基咪唑溶液；将硝酸铜溶液、硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液混合，搅拌后进行水热反应，反应结束后，离心、洗涤、干燥，得到cu-zif-8固体粉末；

20、步骤二、将cu-zif-8固体粉末分散于去离子水中，得到cu-zif-8分散液；将耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体用无核酸酶水溶解，配制成适配体储备液；将cu-zif-8分散液与适配体储备液混合，孵育，得到cu-zif-8@apt探针。

21、优选地，所述步骤一中，六水合硝酸锌、三水合硝酸铜、2-甲基咪唑的质量比为(0.25-0.35):(0.025-0.035):(4-5)，水热反应的条件为在115-125℃温度下反应5.5-6.5h。

22、优选地，所述步骤一中，硝酸锌溶液的浓度为(0.25-0.35)g/10ml，硝酸铜溶液的浓度为(0.025-0.035)g/ml，2-甲基咪唑溶液的浓度为(4-5)g/70ml。

23、优选地，所述步骤二中，cu-zif-8分散液中，cu-zif-8的浓度为0.5-3mg/ml；适配体储备液中，耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体的浓度为50-150nmol/ml；孵育的条件为在37℃、180r/min的恒温摇床中避光孵育120min。

24、优选地，所述制备方法还包括cu-zif-8纳米酶类过氧化物酶催化活性条件的优化，具体包括：

25、（i）材料浓度的优化：配制一系列不同浓度的cu-zif-8分散液，浓度范围为0.5-3mg/ml，梯度间隔为0.5mg/ml，取不同浓度的cu-zif-8分散液分别加入至离心管中，依次加入h2o2溶液和tmb溶液，用hac-naac缓冲液定容，混合均匀后置于恒温金属浴中避光孵育，反应结束后测定溶液在654nm处的吸光度值，确定cu-zif-8的最佳催化浓度为1.5mg/ml；

26、（ii）反应温度的优化：采用最佳材料浓度，取cu-zif-8分散液加入至离心管中，依次加入h2o2溶液和tmb溶液，用hac-naac缓冲液定容，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒温金属浴中避光孵育，反应结束后测定654nm处的吸光度值，确定最佳反应温度为40℃；

27、（iii）缓冲液ph的优化：采用最佳材料浓度和最佳反应温度，取cu-zif-8分散液加入至离心管中，依次加入h2o2溶液和tmb溶液，分别使用ph为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的hac-naac缓冲液定容，置于最佳温度恒温金属浴中避光孵育，反应结束后测定654nm处的吸光度值，综合考虑催化显色响应和适配体构象稳定性，确定最佳反应ph为5.0；

28、（iv）tmb浓度的优化：采用最佳材料浓度、最佳反应温度和最佳ph值，取cu-zif-8分散液加入至离心管中，依次加入h2o2溶液和不同浓度的tmb溶液，浓度范围为10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm，用hac-naac缓冲液定容，置于最佳温度恒温金属浴中避光孵育，反应结束后测定654 nm处的吸光度值，确定最佳tmb浓度为30mm。

29、优选地，所述制备方法还包括cu-zif-8@apt比色显色时间的优化：按照tmb显色反应体系设置对照组和实验组，对照组为cu-zif-8与无菌水的混合体系，实验组为cu-zif-8@apt探针体系；分别向各反应体系中依次加入h2o2溶液和tmb溶液，并用hac-naac缓冲液定容；将各反应体系置于40℃恒温金属浴中避光反应，反应时间分别为5min、10min、15min、20min、25min和30min；反应结束后测定各反应体系在654nm波长处的吸光度值，确定最佳显色时间为20min。

30、优选地，所述制备方法还包括cu-zif-8@apt探针中apt浓度的优化：分别取浓度为1.5mg/ml的cu-zif-8分散液置于离心管中，分别加入浓度为50nmol/l、75nmol/l、100nmol/l、125nmol/l和150nmol/l的apt溶液，混合均匀后于37℃、180r/min条件下避光孵育最佳组装时间，获得不同apt浓度条件下制备的cu-zif-8@apt探针；孵育结束后，分别加入h2o2溶液和tmb溶液，并用hac-naac缓冲液定容，置于40℃恒温金属浴中避光反应最佳显色时间；反应结束后测定各反应体系在654nm波长处的吸光度值，确定apt的最佳组装浓度为150nmol/l。

31、本发明还公开了上述的基于耐甲西林金黄色葡萄球菌活菌的cu-zif-8@apt探针的应用。

32、进一步地，所述应用为在非诊断目的的耐甲西林金黄色葡萄球菌检测中的应用。

33、所述应用包括以下步骤：

34、（1）将待测样品与cu-zif-8@apt探针混合，于40℃避光孵育，使耐甲西林金黄色葡萄球菌与适配体发生特异性结合；

35、（2）向孵育后的反应体系中依次加入h2o2溶液和tmb溶液，并用hac-naac缓冲液定容，于40℃恒温金属浴中避光反应；

36、（3）测定反应体系在654 nm波长处的吸光度值，根据预定的标准曲线确定待测样品中耐甲西林金黄色葡萄球菌的浓度。

37、优选地，所述（2）中，h2o2溶液的浓度为100mmol/l，tmb溶液的浓度为30mmol/l，hac-naac缓冲液的ph为5.0，避光反应的时间为20min；

38、所述（3）中所述标准曲线的线性回归方程为y=0.12289x+0.26123，检出限为1.20cfu/ml。

39、优选地，所述应用还包括待测菌液体积的优化：分别取25μl、50μl、75μl、100μl、125μl和150μl浓度为1×106cfu/ml的菌悬液，分别加入等体积的cu-zif-8@apt探针，混合后于40℃避光孵育；孵育结束后取孵育反应液，加入h2o2溶液和tmb溶液，再加入hac-naac缓冲液定容，将各反应体系置于40℃恒温金属浴中避光反应20 min，测定654nm处的吸光度值，确定最佳菌液体积为75μl。

40、所述待测样品为食品样品或环境水样。当待测样品为牛奶样品时，预先将牛奶样品于5000×g条件下离心10min去除上层脂肪及部分蛋白质，取处理后牛奶加入无菌水稀释后再进行检测。

41、优选地，所述应用还包括cu-zif-8@apt探针的特异性检测：分别配制浓度为1×106cfu/ml的单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、阪崎克罗诺杆菌、铜绿假单胞菌及耐甲西林金黄色葡萄球菌菌悬液，并以不含细菌的溶液作为空白对照，按照相同条件进行比色检测，测定各反应体系在654nm波长处的吸光度值，验证cu-zif-8@apt探针对耐甲西林金黄色葡萄球菌的检测特异性。

42、优选地，所述应用还包括实际样品加标回收检测：选取纯净水和纯牛奶作为实际样品，向纯净水样品中分别加入耐甲西林金黄色葡萄球菌菌液，使其浓度分别为1×102cfu/ml、1×104cfu/ml和1×106cfu/ml，将所得样品直接作为待测液；对于牛奶样品，将加标后的牛奶于5000×g条件下离心10 min去除上层脂肪及部分蛋白质，取处理后牛奶加入无菌水稀释，再加入耐甲西林金黄色葡萄球菌菌液，使样品中的目标菌浓度分别为1×102cfu/ml、1×104cfu/ml和1×106cfu/ml，获得牛奶待测液；采用所述cu-zif-8@apt探针进行比色检测，测定各待测液在654nm波长处的吸光度值，将检测结果代入所建立的线性回归方程，计算纯净水和纯牛奶样品中耐甲西林金黄色葡萄球菌的浓度。

43、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

44、（1）本发明提供的耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体能够特异性识别耐甲西林金黄色葡萄球菌mecr1膜蛋白的膜外暴露结构域，无需裂解菌体即可在完整活菌表面实现特异性结合，避免了复杂的样品前处理步骤，检测操作简便快捷。

45、（2）本发明提供的cu-zif-8@apt探针将耐甲西林金黄色葡萄球菌适配体的高特异性识别能力与cu-zif-8纳米酶的类过氧化物酶催化活性相结合，利用适配体对cu-zif-8催化活性位点的遮蔽/脱附调控机制实现对目标菌的比色检测，检测灵敏度高，检测限低至1.20cfu/ml。

46、（3）本发明提供的cu-zif-8@apt探针对耐甲西林金黄色葡萄球菌具有优异的检测特异性，对单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、阪崎克罗诺杆菌、铜绿假单胞菌等非目标菌无明显响应。

47、（4）本发明提供的cu-zif-8@apt探针的制备方法简单、成本较低、稳定性好，适配体与cu-zif-8的组装条件温和，易于规模化制备。

48、（5）本发明提供的检测方法无需依赖大型仪器设备和专业操作人员，显色反应结果可通过紫外-可见分光光度计或肉眼观察判断，适用于食品样本及环境样本中mrsa的离体快速筛查，检测结果用于微生物负荷评估。

49、（6）本发明通过系统优化cu-zif-8浓度、反应温度、缓冲液ph、tmb浓度、显色时间、apt浓度及菌液体积等关键参数，显著提高了检测体系的催化效率和检测灵敏度。

50、（7）本发明通过mecr1蛋白三维结构建模、短链寡dna随机文库构建、分子对接测试及蚁群算法模型优化的组合筛选策略，获得了对mecr1蛋白及mrsa完整活菌均具有最高亲和力和最强识别响应的优选适配体序列seq id no.1，该序列与mecr1蛋白的结合自由能δg为-13.42±0.38 kcal/mol，bli测得kd为3.81±0.34nm，elisa-based结合实验测得ec50为6.5±0.7nm，mrsa完整活菌结合实验测得表观kd为9.8±1.2nm，在50nm条件下的mfi为6840±390，综合性能优于未经蚁群算法优化的对接候选序列、随机文库初筛序列、打乱序列及阴性对照序列。