一种基于生物传感技术的BOD5快速测定方法与流程

本发明涉及快速测定，具体为一种基于生物传感技术的快速测定方法。

背景技术：

1、bod是评价水体有机污染程度的核心指标，其中bod5是国际通用的标准测定方法，然而传统的稀释接种法操作繁琐、耗时长达5天，无法满足水质实时监测和应急响应的需求，近年来，基于微生物传感器和电化学技术的bod快速测定方法得到了长足发展，这类方法利用微生物对有机物的代谢活动引起溶解氧消耗或电流信号变化，通过建立信号响应值与bod浓度之间的标准曲线实现快速定量，测定时间可缩短至数十分钟；

2、然而，现有快速测定技术在工程应用中普遍面临一个关键瓶颈--标准曲线的“基质适配”问题，快速bod测定高度依赖预先建立的校准曲线，而该曲线通常基于葡萄糖/谷氨酸标准液或特定来源的污水基质建立，实际水样的有机物组成极其复杂，不同行业废水、不同季节地表水中可生物降解有机物的种类、比例和降解动力学特征差异巨大，微生物传感器对易同化底物与难降解底物的响应速率截然不同，导致同一bod浓度的实际水样与标准液在传感器上的信号响应存在显著偏差，传统方法对此缺乏有效的校正手段；

3、针对上述问题，现有技术中虽有通过溶解氧补偿来修正测量误差的方案，但该补偿主要针对溶解氧过饱和等物理因素，并未触及基质差异这一根本性的化学组成问题，因此，本领域亟需一种能够突破瓶颈的实际水体bod5测定方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于生物传感技术的快速测定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于生物传感技术的快速测定方法，包括以下步骤：

3、s1、以目标水样在富集反应器中连续流经亲水改性多孔碳基载体，于25~35℃、0.5~2.0 ml/min条件下恒温培养6~24小时，使载体表面形成与原水菌群结构高度相似的混合生物膜，从而构建出自适应微生物菌群；

4、s2、接收微生物菌群，以过滤后的同源水样为基质，配制至少三个浓度梯度的bod标准添加液，依次注入反应器记录传感器稳态响应值，同时测定空白基质的本底信号，经背景扣除后建立该特定水质条件下的自适应工作曲线；

5、s3、接收工作曲线和背景基线值，将待测水样经空气饱和处理后注入反应器，在恒温恒流下记录稳态响应信号，扣除背景基线后代入工作曲线反演计算，获得测定值；

6、s4、接收测定值，与数据库中历史记录进行相似度匹配，匹配成功则调取对应最优曲线参数进行回传，替代当前工作曲线以减少重复标定，匹配失败则将本次全套标定参数作为新记录存入数据库。

7、优选的，所述s1具体包括以下步骤：

8、s101、获取目标监测点位的实际水样后，将其注入安装有微生物载体材料的富集反应器中；

9、s102、由于富集反应器内设有载体材料，水样在蠕动泵驱动下以 0.5~2.0 ml/min的流速连续流经载体表面；

10、s103、在 25~35 °c 恒温条件下持续富集培养 6~24 小时，其中培养时长下限 6小时为原生混合菌群形成肉眼可见微菌落所需的最短时间，上限 24 小时对应于生物膜厚度达到稳态临界值时的最长有效富集时间，表示溶解氧有效扩散穿透深度与液膜边界层厚度之和，超过该值时深层微生物因缺氧进入内源呼吸期，新增生物量不再对bod响应信号产生正向贡献；

11、s104、在流速和温度条件的协同作用下，水样中原生混合菌群不断在载体表面黏附、繁殖并代谢水样中的可降解有机物，确定载体表面的活菌密度；

12、s105、当培养时间达到由水样可生化性指数自动确定的特定值时，载体表面形成稳定的混合微生物生物膜，其群落结构组成与水样中原生悬浮菌群的bray-curtis相似度达85%以上，表明该生物膜已具备针对目标水样有机物组成的特异性降解能力，至此完成自适应微生物菌群的构建。

13、优选的，所述s2中具体包括以下步骤：

14、s201、在自适应微生物菌群构建完成且生物膜活性达到稳态后，进行自适应响应系数的标定，以经过 0.22 μm滤膜过滤的同一目标水样作为背景基质，以葡萄糖/谷氨酸标准混合液作为添加物，按等比例增量法配制至少三个浓度梯度的bod标准添加溶液，浓度梯度数量不少于三个；

15、s202、依据目标水样的预估bod范围确定各浓度梯度，涵盖低、中、高三个水平，其中最高浓度不超过目标水样bod预估上限的1.5倍，避免超出微生物的线性响应区间；

16、s203、将各浓度梯度的标准添加溶液依次注入富集反应器中，每次注入后待传感器输出信号达到稳态，记录电化学传感器的稳态信号响应值；

17、s204、以过滤后的空白实际水样，即未添加任何标准物的背景基质，注入反应器，通过微型库仑计记录其背景响应值。

18、优选的，所述s2中具体还包括以下步骤：

19、s205、将各浓度梯度的响应值扣除背景响应值后，得到净响应信号，以净响应信号为纵坐标、对应的标准添加浓度为横坐标，建立该实际水样基质条件下的自适应工作曲线；

20、s206、若净响应信号与浓度之间在低浓度区段呈现线性关系而在高浓度区段趋于饱和，则采用双区段分段拟合，其中低浓度区段采用过原点的一阶线性方程，高浓度区段采用米氏型饱和曲线拟合，两区段的交界点定义为线性响应临界浓度；

21、s207、标定完成后，自适应工作曲线的参数及其对应的基质类型编码一并存入基质特征数据库中，供后续同源水样的快速测定调用。

22、优选的，所述s3中具体包括以下步骤：

23、s301、将待测实际水样经空气饱和处理后注入富集反应器，所述空气饱和处理具体为将待测水样置于敞口容器中，以无菌空气泵通入经 0.22 μm滤膜过滤的洁净空气，曝气时间不少于十五分钟，使水样中溶解氧浓度达到该温度条件下的饱和值，通过溶解氧测定仪实时监测，当水样溶解氧浓度在30 °c条件下达到7.5 mg/l且五分钟内波动不超过±0.1mg/l时，即视为空气饱和处理完成；

24、s302、将完成空气饱和处理的待测水样以标定时完全相同的流速注入富集反应器，富集反应器通过恒温夹套将温度维持在29 °c 至31 °c，确保微生物代谢活性恒定；

25、s303、水样流经附着有自适应微生物菌群的载体表面，微生物对水样中的可降解有机物进行代谢消耗，伴随产生溶解氧的消耗以及电化学活性物质的产生，利用溶解氧电极连续记录信号值；

26、s304、从水样注入时刻开始计时，观测信号随时间的变化曲线，当信号在一百二十秒内的变化幅度不超过±1%时，判定达到稳态，记录该时刻的稳态信号响应值；

27、s305、将该稳态信号响应值减去原先测得的背景响应值，得到待测水样的净响应信号，根据待测水样净响应信号所在的浓度区间，从自适应工作曲线中调取对应的拟合方程，将该净响应值代入该方程进行反演计算，即可获得该水样的快速测定值；

28、s306、若净响应信号低于标定曲线的最低浓度点，则结果报告为低于检出限，若净响应信号高于标定曲线的最高浓度点，则需将待测水样进行适当倍数的稀释后重新测定，并确保稀释后的净响应信号落入工作曲线的线性区段内，最终测定值乘以稀释倍数即得原始水样的值；

29、s307、每次样品测定结束后自动以磷酸盐缓冲液清洗流路和反应器，清洗时间不少于五分钟，待传感器信号回归至背景基线水平后方可进行下一水样的测定，避免样品间交叉污染。

30、优选的，所述s4中具体包括以下步骤：

31、s401、每完成一组实际水样的测定后，自动执行自适应校正与自学习程序，在测定结束并完成稳态响应信号的背景扣除后，从本次测定全程记录的动态响应曲线中提取一组基质特征参数，所有参数通过微处理器内嵌的在线拟合算法自动计算；

32、s402、将当前水样基质特征参数格式化为一组特征向量，连同当前实际测定值、测定时间戳和生物膜批次编号，一并存入富集反应器配套的基质特征数据库中；

33、s403、计算当前特征向量与数据库中已有的全部历史记录之间的标准化欧氏距离，当该距离小于预设的相似度阈值时，则判定当前水样与对应的历史记录属于同一基质类型；

34、s404、若匹配成功，自动调取该历史记录中所关联的最优工作曲线参数，将其作为后续同源水样测定时的默认标定曲线。

35、优选的，所述s4中具体还包括以下步骤：

36、s405、调取操作完成后，将本次测定中获得的响应值分别代入历史工作曲线与当前使用的自适应工作曲线进行双轨核算，若两条曲线的计算结果之间的偏差不超过百分之五，则无需重新标定，直接进入下一水样的测定流程；

37、s406、若偏差超过百分之五，则触发一次快速的单点校正，即以当前水样作为标准添加的背景基质，仅配制一个中等浓度水平的标准添加液进行校正测定，校正后的曲线参数取代数据库中该历史记录对应的旧参数；

38、s407、若当前水样的基质特征与数据库中的所有历史记录的相似度均低于阈值，说明该水样属于新型基质，将当前完整的一组标定结果，包括所有浓度梯度的净响应信号和拟合曲线参数，作为一个新的记录条目存入数据库；

39、s408、若数据库中的基质记录数量因持续积累而超过设定的存储容量上限，自动触发合并机制，将bray-curtis相似度大于百分之九十的相似基质记录进行加权合并，以释放存储空间。

40、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

41、本发明通过采用实际目标水样作为微生物富集培养基质和标定背景基质，使自适应工作曲线与实测条件完全一致，从根本上克服了传统gga标准曲线因有机物组成差异导致的系统偏差，显著提高了测定结果的准确性，同时将测定周期从传统五日法大幅缩短，兼顾了时效性与准确性，真正实现了快速监测的目标，各步骤之间形成完整的数据流闭环，随着测定次数的不断累积，对已识别水质的重复标定需求逐步降低，整体效率呈现出自优化的演进趋势，此外，整套方法集成度高，可广泛适用于工业废水、地表水及生活污水等多种水质类型的现场快速监测，具有良好的推广应用前景。